一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基sers芯片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，公開了一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其制備方法。該芯片由銀納米顆粒修飾的硅晶片、金納米顆粒、SEQ ID NO:1、2、4所示核苷酸序列，以及在SEQ ID NO:3所示核苷酸序列5’端偶聯(lián)巰基、3’端偶聯(lián)熒光染料的序列片段組成。本發(fā)明用多聚腺嘌呤輔助的表面增強拉曼散射硅基芯片用于鉛離子檢測，所述芯片由核(銀)?衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片構(gòu)成，共價連接在芯片上的DNAzyme可以被鉛離子特異性激活，使得substrate strand斷裂成兩段自由的DNA，因而可檢測到較強的SERS信號，達到較高的靈敏度、特異性、可重現(xiàn)性以及可循環(huán)性。
【專利說明】
一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其制 備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的 硅基SERS芯片及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉛離子是環(huán)境中最危險的重金屬離子之一，存在多種源頭例如食物、血液、飲用 水、工業(yè)廢水等等。研究發(fā)現(xiàn)，通過食物鏈和飲用水鉛污染會對人類特別是兒童的神經(jīng)系 統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、智力發(fā)展等造成嚴重的傷害(參見：Int · J ·Hyg·Environ ·Health 2008，211， 345-351; Annu. Rev.Med. 2004,55,209-222)。鉛離子在人體內(nèi)不易于降解，因而長期的積累 甚至少量的鉛離子也會影響人類的健康。美國環(huán)境保護局規(guī)定在飲用水中鉛離子的最大殘 余量不能超過72.4nM。已有報道發(fā)現(xiàn)，一些兒童由于長期的和低水平的鉛離子暴露，智力能 力受到嚴重的影響（參見British Medical Bulletin 2003,68,167-182)。因此對于鉛離 子的檢測已日益成為環(huán)境監(jiān)測的重要問題，研發(fā)新型鉛離子檢測方法對于環(huán)境保護、疾病 預(yù)防、重大環(huán)境污染監(jiān)測具有重要意義。
[0003] 目前，各種傳統(tǒng)的分析方法像原子吸收光譜法，電感耦合等離子體-質(zhì)譜法，電感 耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法，已廣泛使用。然而，這些分析方法大多是昂貴的，耗時的， 需要冗長的步驟和復(fù)雜的儀器，從而限制了鉛離子檢測的廣泛應(yīng)用。
[0004] 表面增強拉曼散射（SERS)是一種非常吸引人的現(xiàn)象，它已廣泛的用于傳感應(yīng)用 中。相比較正常的拉曼信號，分子吸附在一些特定的金屬表面時，該分子的拉曼信號會得到 極大地提高，因而能夠超高靈敏的檢測樣品。這種巨大的增強因子是由于，在光照下，對于 表面較為粗糙的金屬襯底來說，表面能夠產(chǎn)生局域電磁場。除了較高的靈敏性，SERS具有狹 窄的拉曼峰從而導(dǎo)致較小的背景，有利于多元檢測。此外，拉曼散射在不同的環(huán)境下非常穩(wěn) 定，幾乎不受濕度，氧氣，外來物種等的影響。因此，SERS已用于靈敏性和特異性的檢測鉛離 子。例如，王等人，發(fā)展了一種獨特的和簡單的"Signal off"SERS策略用于靈敏性和選擇性 的檢測鉛離子(參見:Chem. Commun. 2011，47，4394-4396)。之后，徐等人，介紹了一種基于 DNAzyme的Ag NPs-〇n_Ag f ilm結(jié)構(gòu)，能夠檢測InM的鉛離子（參見：Anal · Chem · 2014，86， 11494-11497)。盡管這些SERS傳感器是可行的，但是靈敏性和重現(xiàn)性不是令人滿意的，因而 限制其在實際水樣中的應(yīng)用。因此，更多的努力開始致力于發(fā)展穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性優(yōu)良的基 底以實現(xiàn)超靈敏性和特異性的檢測產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基 SERS芯片及其制備方法，使得所述硅基SERS芯片在檢測實際水樣中鉛離子濃度時具有較好 的靈敏度、特異性、重現(xiàn)性以及可循環(huán)性。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片，其特征在于，由銀納米顆 粒修飾的硅晶片、金納米顆粒、SEQ ID NO: 1-2和SEQ ID N0:4所示核苷酸序列，以及在SEQ ID NO: 3所不核昔酸序列5 '端偶聯(lián)有疏基、3 '端偶聯(lián)有焚光染料的序列片段；
[0008]其中，銀納米顆粒修飾的娃晶片與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列連接，金納米顆粒 與SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列連接，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列彼此形成互補雙鏈連 接，在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段通過 末端巰基與金、銀納米顆粒共價連接，SEQ ID N0:4所示核苷酸序列與SEQ ID NO: 3所示核 苷酸序列彼此形成互補雙鏈連接。
[0009]本發(fā)明針對現(xiàn)有檢測實際水樣中鉛離子濃度的SERS技術(shù)靈敏度(僅為nM級）和重 現(xiàn)性較差的問題，本發(fā)明采用多聚腺嘌呤(Poly A30,即SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列，本 發(fā)明中分別命名為Poly A30-P1和Poly A30-P2)輔助的表面增強拉曼散射硅基芯片用于高 性能的鉛離子檢測，本發(fā)明這種芯片由核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片所構(gòu)成，共 價連接在硅基SERS芯片上的DNAzyme(g卩SEQ ID N0:3所示核苷酸序列，本發(fā)明中命名為 Cy5-17E-SH)可以被鉛離子特異性激活，使得substrate strand(即SEQ ID N0:4所示核苷 酸序列，本發(fā)明中命名為17DS)斷裂成兩段自由的DNA，因而可檢測到較強的SERS信號，原理 示意圖見圖1。
[0010]其中，作為優(yōu)選，所述序列片段為在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有HS-(CH2)6-、3'端偶聯(lián)有Cy5熒光染料的序列片段，即5' - HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'〇 [0011]作為優(yōu)選，所述硅晶片為〇. 01~20 Ω *cm的p型或n型硅晶片。
[0012]同時，本發(fā)明還提供了所述硅基SERS芯片的制備方法，包括：
[0013] 步驟1、制備銀納米顆粒修飾的娃晶片以及金納米顆粒；
[0014] 步驟2、將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列恒溫混合孵育，然后向其中加入鹽溶液，過夜老化，得到SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列連接的銀納米顆粒修飾的硅晶片；
[0015] 將所制備的金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID N0:2所示核苷酸序列 恒溫混合孵育，然后向溶液中加入鹽溶液，過夜老化，得到SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列連 接的金納米顆粒；
[0016] 步驟3、將步驟2所得硅晶片和金納米顆粒置于雜交緩沖液中恒溫混合孵育，通過 SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗，然后氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片(掃描電鏡表征照片見圖2);
[0017] 步驟4、將核(銀)-衛(wèi)星（金)納米顆粒修飾的硅晶片與在SEQ ID NO: 3所示核苷酸 序列5 '端偶聯(lián)有疏基、3 '端偶聯(lián)有焚光染料的序列片段丨旦溫混勾并振蕩反應(yīng)，使SEQ ID NO: 3所示核苷酸序列末端疏基與金、銀納米粒子共價連接形成金-硫鍵和銀-硫鍵，然后向 溶液中加入鹽溶液，過夜老化；
[0018] 將老化后的材料取出，與溶解于雜交緩沖液中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列恒溫 混合孵育，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗，氮氣吹干，得到所述硅基 SERS芯片。
[0019] 作為優(yōu)選，所述銀納米顆粒修飾的硅晶片由以下方法制備獲得：
[0020] 將單晶硅片依次用去離子水、丙酮、去離子水進行超聲清洗，然后再用濃硫酸和過 氧化氫混合溶液清洗；
[0021] 清洗后的單晶硅片加入到氫氟酸溶液中進行硅-氫化反應(yīng)，得到表面覆蓋Si-H鍵 的硅晶片，然后光面朝上，放入硝酸銀和氫氟酸的混合溶液中，緩慢振蕩反應(yīng)，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆粒，得到銀納米顆粒修飾的硅晶 片，最后用氮氣吹干表面。
[0022] 作為優(yōu)選，所述的過氧化氫質(zhì)量濃度為40%，濃硫酸和40%過氧化氫體積比為1: (0.01~100)。
[0023]作為優(yōu)選，所述氫氟酸溶液中氫氟酸的質(zhì)量濃度為1~40%。
[0024]作為優(yōu)選，所述娃-氫化反應(yīng)的時間為1~60分鐘。
[0025]作為優(yōu)選，所述硝酸銀和氫氟酸的混合溶液由IM的硝酸銀溶液和質(zhì)量濃度為40% 的氫氟酸溶液按體積比為1:(0.01~100)配制而成。
[0026] 作為優(yōu)選，所述振蕩反應(yīng)時間為1~60分鐘。
[0027] 作為優(yōu)選，所述納米金顆粒通過檸檬酸還原法制備獲得。具體的可參照如下方式：
[0028] 在沸騰的氯金酸溶液中，加入檸檬酸鈉溶液，攪拌反應(yīng)之后，得到金納米顆粒，所 述氯金酸質(zhì)量濃度為〇.〇1%，檸檬酸鈉質(zhì)量濃度為1%，反應(yīng)時間為15分鐘。
[0029] 作為優(yōu)選，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列濃度均為0.001~1M。
[0030] 作為優(yōu)選，步驟2所述恒溫混合孵育為在25°C孵育16小時。
[0031] 作為優(yōu)選，步驟2和步驟4所述加入鹽溶液為將初始濃度為IM的鹽溶液，每隔兩小 時分3-5次加入，鹽溶液最終濃度為0.01~1M。
[0032] 作為優(yōu)選，步驟3所述恒溫混合孵育為在37°C孵育24小時。
[0033] 作為優(yōu)選，步驟4所述振蕩反應(yīng)為在100~600轉(zhuǎn)每分鐘、25°C下反應(yīng)1~24小時。 [0034] 作為優(yōu)選，步驟4所述恒溫混合孵育為在37°C孵育1~24小時。
[0035]作為優(yōu)選，步驟4中在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有 熒光染料的序列片段、SEQ ID N0:4所示核苷酸序列濃度均為0.001~1M。
[0036]本發(fā)明構(gòu)建的硅基SERS芯片從IOpM到ΙμΜ鉛離子的對數(shù)濃度與歸一化的拉曼強度 存在較好的線性關(guān)系(R2 = O. 997);由于該芯片優(yōu)越的SERS性能，它可以檢測到低至8.9 X 10一 12Μ(ρΜ級）的鉛離子濃度，遠遠低于已報道的SERS傳感器(ηΜ級）；此外，所提供的芯片具 有良好的選擇性和可循環(huán)性(三次循環(huán)后拉曼強度損失僅為11.1%);更重要的是，所制備 的芯片可以精確和可靠的檢測湖水、自來水和工業(yè)廢水等實際體系中未知鉛離子的濃度 (RSD值小于12%)。
【附圖說明】
[0037]圖1是本發(fā)明的硅基SERS芯片檢測鉛離子的原理圖；
[0038]圖2是本發(fā)明制備得到的硅基SERS芯片，即核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶 片的掃描電鏡表征照片，其中銀納米顆粒(AgNPs)的尺寸約為11Onm，金納米顆粒(Au NPs) 的尺寸約為13nm，且較均勾的分布在Ag NPs表面上；
[0039] 圖3是本發(fā)明制備得到的芯片對不同濃度鉛離子的SERS試驗系列結(jié)果譜圖；
[0040] 圖4是本發(fā)明制備得到的芯片對同一濃度不同離子的SERS光譜圖以及不同離子的 拉曼峰1366CHT1的強度的對比柱形圖，其中a圖為對同一濃度不同離子的SERS光譜圖，b圖為 不同離子的拉曼峰1366CHT1的強度的對比柱形圖；
[0041]圖5是本發(fā)明制備得到的芯片重建的原理圖以及3次循環(huán)使用的SERS光譜圖和相 應(yīng)的拉曼峰1366CHT1的強度的對比圖，其中a圖為芯片的重建原理圖，b和c圖分別為3次循環(huán) 使用的SERS光譜圖和相應(yīng)的拉曼峰1366CHT 1的強度的對比圖。
【具體實施方式】：
[0042]本發(fā)明公開了一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其制備方 法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有 類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本 發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi) 容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本 發(fā)明技術(shù)。
[0043]下面就本發(fā)明提供的一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片及其 制備方法做進一步說明。
[0044] 實施例1:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0045] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0046] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮氣吹干表面。
[0047] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0048]根據(jù)標準的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分3次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分5次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1 M，過夜老化，得到PolyA30-P2連接的銀納米顆粒修 飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵育 24小時。通過DNA互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮氣吹干，得到核(銀)-衛(wèi)星 (金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0049] (3)核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0050]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0051 ] 實施例2:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0052] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0053]取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (1M)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40% )的混合溶液(體積比=1:50)中，緩慢振蕩反應(yīng)30分鐘，根據(jù) 電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆粒， 從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮氣吹干表面。
[0054] ⑵核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0055]根據(jù)標準的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分3次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分5次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到Poly A30-P2連接的銀納米顆粒 修飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵 育24小時。通過DNA互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮氣吹干，得到核(銀)-衛(wèi) 星(金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0056] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0057]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為O . IM，過夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:O. OO1M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0058] 實施例3:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0059] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0060] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮氣吹干表面。
[0061 ] (2)核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0062]根據(jù)標準的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.01M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分3次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。將 已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.01M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1 M，過夜老化，得到PolyA30-P2連接的銀納米顆粒修飾 的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵育24 小時。通過DNA互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮氣吹干，得到核（銀)-衛(wèi)星 (金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0063] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0064]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:O. OO1M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0065] 實施例3:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0066] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0067] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮氣吹干表面。
[0068] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0069]根據(jù)標準的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分3次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到Poly A30-P1連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分5次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到Poly A30-P2連接的銀納米顆粒 修飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵 育24小時。通過DNA互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮氣吹干，得到核(銀)-衛(wèi) 星(金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0070] (3)核(銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0071]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.01M)的溶液，使得溶液浸沒材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.01M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0072] 實施例5:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0073] (I)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0074] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮氣吹干表面。
[0075] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0076]根據(jù)標準的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分3次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.5M，過夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分5次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.5M，過夜老化，得到PolyA30-P2連接的銀納米顆粒修 飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵育 24小時。通過DNA互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮氣吹干，得到核(銀)-衛(wèi)星 (金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0077] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0078]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，350轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)24小時，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.5M，過夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育24小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0079] 實施例6:制備本發(fā)明所述硅基SERS芯片
[0080] (1)氫氟酸輔助刻蝕方法制備銀納米顆粒修飾的硅晶片
[0081] 取0.5cm2大小單晶硅片3-6片置于潔凈燒杯中于超聲儀中依次用去離子水、丙酮、 去離子水進行超聲清洗15分鐘，再放入40mL濃硫酸和過氧化氫(質(zhì)量濃度:40%)混合溶液 (體積比= 3:1)中進一步清洗，然后再用去離子水清洗，得到干凈的硅晶片。將清洗干凈的 硅晶片置入氫氟酸溶液(質(zhì)量濃度:5 % )中進行硅-氫化反應(yīng)，緩慢振蕩30分鐘，得到表面覆 蓋大量Si-H鍵的硅晶片。將經(jīng)過上述處理后所得到的硅晶片，光面朝上，放入20mL硝酸銀 (IM)和氫氟酸（質(zhì)量濃度:40%)的混合溶液(體積比= 1:100)中，緩慢振蕩反應(yīng)60分鐘，根 據(jù)電化學(xué)反應(yīng)原理，銀離子被Si-H鍵還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆 粒，從而得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最后用氮氣吹干表面。
[0082] (2)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的制備
[0083]根據(jù)標準的檸檬酸還原方法，在沸騰的50mL氯金酸溶液(質(zhì)量濃度:0.01 % )中，加 入2mL檸檬酸鈉溶液(質(zhì)量濃度：1%)，攪拌反應(yīng)15分鐘之后，得到金納米顆粒。將所制備的 金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液（P B S )中的P 〇 I y A 3 0 - P I D NA ( 5 ' -AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGA-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分3次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到PolyA30-Pl連接的金納米顆粒。 將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的Poly A30-P2DNA(5'_ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATC-3 '）（濃度： 0.001M)，恒溫25°C，在恒溫混勻儀上混合孵育16小時，然后向溶液中分5次每隔2小時加一 次IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0.1M，過夜老化，得到Poly A30-P2連接的銀納米顆粒 修飾的硅晶片。將上述兩步所得材料置于雜交緩沖液中，恒溫37°C，在恒溫混勻儀上混合孵 育24小時。通過DNA互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗幾次，然后氮氣吹干，得到核(銀)-衛(wèi) 星(金)納米顆粒修飾的硅晶片。
[0084] (3)核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片構(gòu)建
[0085]將核（銀)-衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的娃晶片放在離心管中，加入enzyme strand DNA(Cy5-17E-SH,5'-HS-(CH2)6-TTTCATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT-Cy5-3'）（濃度： 0.001M)的溶液，使得溶液浸沒材料。將離心管置于恒溫混勻儀中，500轉(zhuǎn)每分鐘，25°C恒溫， 振蕩反應(yīng)18小時，使DNA末端巰基與金、銀納米粒子共價形成金-硫鍵和銀-硫鍵，使DNA共價 連接到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片上。然后向溶液中分5次每隔2小時加一次 IM鹽溶液，使得鹽溶液最終濃度為0 . IM，過夜老化。將材料取出，與溶解于雜交緩沖液中 substrate strand DNA(17DS,5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3',rA(ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒溫混勾儀中混合孵 育18小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片。
[0086]實施例7:本發(fā)明所述芯片對不同濃度鉛離子的SERS試驗
[0087]將制備好的本發(fā)明芯片于室溫下，浸泡在IOOnM鉛離子溶液中，反應(yīng)70分鐘后，取 出芯片，隨機選擇40個點做mapping實驗，由圖3中a圖可知拉曼強度較為均勻，RSD值小于 12%，表明了該芯片具有較好的重現(xiàn)性。
[0088] 將制備好的本發(fā)明芯片于室溫下，分別浸泡在0、ΙΟρΜ、ΙΟΟρΜ、ΙηΜ、ΙΟηΜ、ΙΟΟηΜ、1μ M鉛離子溶液中，反應(yīng)70分鐘后，取出芯片，進行拉曼實驗，由圖3中b圖可知從IOpM到ΙμΜ鉛 離子的拉曼光譜圖，隨著鉛離子濃度增加拉曼強度也在增加，由圖3中c圖可知鉛離子的對 數(shù)濃度與歸一化的拉曼強度存在較好的線性關(guān)系(R 2 = O.997)，實驗結(jié)果表明該芯片可有 效檢測鉛離子濃度低至8.9ρΜ，靈敏度極高。
[0089] 實施例8:本發(fā)明所述芯片對同一濃度不同離子的SERS試驗
[0090] 將制備好的芯片于室溫下分別浸泡在InM的各種離子以及各種離子的混合溶液 中，反應(yīng)70分鐘后，取出芯片，分別進行拉曼實驗，由圖4中的a圖可知鉛離子和含有鉛離子 的混合溶液相比較其他離子溶液的拉曼光譜具有明顯的增強，從圖4中的b圖可以看出相應(yīng) 的拉曼峰1366CHT 1的強度可定量的比較不同離子之間的差別，結(jié)果顯示該芯片具有較好的 特異性可以準確識別實際體系中的鉛離子。
[0091] 實施例9:本發(fā)明所述芯片的重建以及循環(huán)使用試驗
[0092] 1、本發(fā)明所述芯片的重建
[0093]在一次檢測后，用PBS清洗芯片以除去殘余的DNA和鉛離子，將材料取出，與溶解于 雜交緩沖液中substrate strand DNA(17DS，5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATG-3'，rA (ribonucleotide adenosine)代表核糖核苷酸中的堿基A)(濃度:0.001M)，37°C恒溫，在恒 溫混勻儀中混合孵育24小時，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗幾次，氮 氣吹干，重建得到核(銀)_衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片的SERS芯片(參見圖5中a圖）。
[0094] 2、本發(fā)明所述芯片的循環(huán)使用試驗
[0095]將重建的芯片，于室溫下，浸泡在InM的鉛離子溶液中，反應(yīng)70分鐘后，取出芯片， 進行拉曼實驗，然后循環(huán)使用，每一次重建之后拉曼強度都會明顯的增強(每次重建后拉曼 強度都會明顯增強指的是剛重建后未使用的芯片的拉曼強度沒有或者很微弱，當加入鉛離 子之后拉曼信號會明顯的增強，參見圖5中b圖），為了定量的比較，由圖5中的c圖中拉曼峰 1366CHT1的強度計算得知三次循環(huán)后強度僅減弱了 11%，結(jié)果表明本發(fā)明芯片易于重建，可 多次使用，可循環(huán)性高，大大降低制備成本。
[0096]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種定量檢測實際水樣中鉛離子濃度的硅基SERS芯片，其特征在于，由銀納米顆粒 修飾的硅晶片、金納米顆粒、SEQIDN0 :1-2和SEQIDN0:4所示核苷酸序列，以及在SEQID NO: 3所不核昔酸序列5'端偶聯(lián)有疏基、3'端偶聯(lián)有焚光染料的序列片段組成； 其中，銀納米顆粒修飾的娃晶片與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列連接，金納米顆粒與 SEQ ID NO: 2所示核苷酸序列連接，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列彼此形成互補雙鏈連 接，在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段通過 末端巰基與金、銀納米顆粒共價連接，SEQ ID N0:4所示核苷酸序列與SEQ ID NO: 3所示核 苷酸序列彼此形成互補雙鏈連接。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述硅基SERS芯片，其特征在于，所述序列片段為在SEQ ID N0:3所 示核苷酸序列5'端偶聯(lián)有HS-(CH2)6-、3'端偶聯(lián)有Cy5熒光染料的序列片段。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述硅基SERS芯片，其特征在于，所述硅晶片為0.01~20 Ω處一勺口型 或η型硅晶片。4. 權(quán)利要求1所述硅基SERS芯片的制備方法，其特征在于，包括： 步驟1、制備銀納米顆粒修飾的硅晶片以及金納米顆粒； 步驟2、將已制備好的銀納米顆粒修飾的硅晶片與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列恒溫混合孵育，然后向其中加入鹽溶液，過夜老化，得到SEQ ID NO: 1 所示核苷酸序列連接的銀納米顆粒修飾的硅晶片； 將所制備的金納米顆粒與溶解于磷酸鹽緩沖液中的SEQ ID N0:2所示核苷酸序列恒溫 混合孵育，然后向溶液中加入鹽溶液，過夜老化，得到SEQ ID N0:2所示核苷酸序列連接的 金納米顆粒； 步驟3、將步驟2所得硅晶片和金納米顆粒置于雜交緩沖液中恒溫混合孵育，通過SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)，用PBS沖洗，然后氮氣吹干，得到核 (銀)-衛(wèi)星(金)納米顆粒修飾的硅晶片； 步驟4、將核(銀)_衛(wèi)星（金）納米顆粒修飾的硅晶片與在SEQ ID N0:3所示核苷酸序列 5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段恒溫混勻并振蕩反應(yīng)，使SEQ ID N0:3所 示核苷酸序列末端巰基與金、銀納米粒子共價連接形成金-硫鍵和銀-硫鍵，然后向溶液中 加入鹽溶液，過夜老化； 將老化后的材料取出，與溶解于雜交緩沖液中SEQ ID N0:4所示核苷酸序列恒溫混合 孵育，通過DNA互補配對形成DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，然后用PBS沖洗，氮氣吹干，得到所述硅基SERS芯 片。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，所述銀納米顆粒修飾的硅晶片由以下方 法制備獲得： 將單晶硅片依次用去離子水、丙酮、去離子水進行超聲清洗，然后再用濃硫酸和過氧化 氫混合溶液清洗； 清洗后的單晶硅片加入到氫氟酸溶液中進行硅-氫化反應(yīng)，得到表面覆蓋Si-H鍵的硅 晶片，然后光面朝上，放入硝酸銀和氫氟酸的混合溶液中，緩慢振蕩反應(yīng)，銀離子被Si-H鍵 還原，在硅晶片表面原位生長上一層均勻的銀納米顆粒，得到銀納米顆粒修飾的硅晶片，最 后用氮氣吹干表面。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述的過氧化氫質(zhì)量濃度為40%，濃硫 酸和40 %過氧化氫體積比為1: (0.01~100)。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述氫氟酸溶液中氫氟酸的質(zhì)量濃度為 1 ~40%〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述硅-氫化反應(yīng)的時間為1~60分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述硝酸銀和氫氟酸的混合溶液由1M的 硝酸銀溶液和質(zhì)量濃度為40%的氫氟酸溶液按體積比為1:(0.01~100)配制而成。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于，所述振蕩反應(yīng)時間為1~60分鐘。11. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，所述納米金顆粒通過檸檬酸還原法制 備獲得。12. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，SEQ ID NO: 1-2所示核苷酸序列濃度均 為0.001~1M。13. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟2所述恒溫混合孵育為在25°C孵育 16小時。14. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟2和步驟4所述加入鹽溶液為將初 始濃度為1M的鹽溶液，每隔兩小時分3-5次加入，鹽溶液最終濃度為0.01~1M。15. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟3所述恒溫混合孵育為在37°C孵育 24小時。16. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4所述振蕩反應(yīng)為在100~600轉(zhuǎn)每 分鐘、25 °C下反應(yīng)1~24小時。17. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4所述恒溫混合孵育為在37°C孵育 1~24小時。18. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于，步驟4中在SEQ ID NO: 3所示核苷酸序 列5'端偶聯(lián)有巰基、3'端偶聯(lián)有熒光染料的序列片段、SEQ ID N0:4所示核苷酸序列濃度均 為0.001~1M。
【文檔編號】G01N21/65GK105842225SQ201610179491
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】何耀, 史宇, 王后禹
【申請人】蘇州大學(xué)