一種降低濃香型白酒酒醅中尿素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種降低濃香型白酒酒醅中尿素的方法，屬于微生物生產(chǎn)利用領(lǐng)域。本發(fā)明在白酒酒醅入窖池發(fā)酵之前加入羅伊氏乳桿菌或其粗酶液，酒醅中EC的重要前體物質(zhì)尿素的含量減少了100％，而未加入菌株、未加酶液或者加入腐生葡萄球菌或其酶液，則基本沒(méi)有效果。本發(fā)明采用的羅伊氏乳桿菌是食品安全菌，應(yīng)用到酒醅中不會(huì)產(chǎn)生其它有害物質(zhì)。本發(fā)明提供的方法具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種降低濃香型白酒酒醅中尿素的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種降低濃香型白酒酒醅中尿素的方法，屬于微生物生產(chǎn)利用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)被世界衛(wèi)生組織歸為2A類致癌物質(zhì)，與丙稀 胺同等危險(xiǎn)。它能夠?qū)е路文[瘤、淋巴癌、肝癌、皮膚癌等嚴(yán)重性腫瘤疾病。氨基甲酸乙酯廣 泛存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，包括酒類、醬油等食品。此前檢測(cè)到中國(guó)白酒中含有氨基甲酸乙 酯，長(zhǎng)期過(guò)量飲用會(huì)增加致癌幾率。而國(guó)內(nèi)對(duì)白酒中氨基甲酸乙酯的降低方法未見(jiàn)報(bào)道。我 國(guó)是白酒消費(fèi)大國(guó)，消耗量巨大，人們?nèi)粘ｏ嬘昧枯^大，次數(shù)較多。白酒中中氨基甲酸乙酯 前體物質(zhì)主要有乙醇、瓜氨酸、尿素。對(duì)中國(guó)江蘇一家白酒廠的濃香型白酒研究結(jié)果表明： 入窖酒醅中尿素含量為20-30mg/kg，糧食原料中也會(huì)帶有尿素，含量為51.5mg/kg。基于國(guó) 人的健康考慮，及早地開(kāi)展研究，降低白酒酒醅中尿素，減少健康隱患，勢(shì)在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)尿 素的方法，是在酒醅入窖發(fā)酵之前加入羅伊氏乳桿菌和/或羅伊氏乳桿菌所產(chǎn)的脲酶，降低 白酒酒醅中尿素的含量。
[0004] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述羅伊氏乳桿菌是在酒醅入窖發(fā)酵之前加入，使 酒醅中羅伊氏乳桿菌的濃度達(dá)到IO7~l〇 8CFU/g。
[0005] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述羅伊氏乳桿菌所產(chǎn)的脲酶是以粗酶液的形式在 酒醅入窖發(fā)酵之前加入，使酶活達(dá)到是〇.19U/g。
[0006] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述羅伊氏乳桿菌選用Lactobacillus reuteri，購(gòu) 買于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)CICC6124。
[0007] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述白酒可以是濃香型白酒。
[0008] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法的具體步驟為：（1)菌種活化；（2)粗酶液制 備:將培養(yǎng)好的菌液用洗滌懸浮，破壁，收集破壁液上清中的粗酶液；（3)發(fā)酵:取入窖大茬 酒醅，加入菌液或的粗酶液，發(fā)酵釀酒。
[0009] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法的具體步驟為：（1)菌種活化:羅伊氏乳桿 菌接入MRS培養(yǎng)基，30 °C厭氧培養(yǎng)72h; (2)粗酶液制備:將培養(yǎng)好的菌液用20mM，pH7.0的PBS 緩沖液洗滌懸浮，加入直徑〇 . Imm的玻璃珠，進(jìn)行機(jī)械破碎，1000 Orpm離心10分鐘，取上清 液，即為粗酶液；（3)發(fā)酵:取入窖大茬酒醅，加入用生理鹽水懸浮的菌液或制備好的粗酶 液，攪拌均勾，30 °C厭氧發(fā)酵15天。
[0010]本發(fā)明在白酒酒醅入窖池發(fā)酵之前加入羅伊氏乳桿菌或其粗酶液，酒醅中EC的重 要前體物質(zhì)尿素的含量減少了100%，而未加入菌株、未加酶液或者加入腐生葡萄球菌或其 酶液，則基本沒(méi)有效果。本發(fā)明采用的羅伊氏乳桿菌是食品安全菌，應(yīng)用到酒醅中不會(huì)產(chǎn)生 其它有害物質(zhì)。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1單菌株和商品脲酶對(duì)酒醅中尿素的降解效果;A不添加羅伊氏乳桿菌或腐生葡 萄球菌及其菌液的對(duì)照組的起始狀態(tài);B不添加羅伊氏乳桿菌或腐生葡萄球菌及其菌液的 對(duì)照組的發(fā)酵終了狀態(tài);C羅伊氏乳桿菌;D腐生葡萄球菌M3;E腐生葡萄球菌M26;F腐生葡萄 球囷M39;G商品脈酶。
[0012] 圖2不同粗酶液和商品脲酶對(duì)酒醅中尿素的降解效果;A不添加羅伊氏乳桿菌或腐 生葡萄球菌及其菌液的對(duì)照組的起始狀態(tài);B不添加羅伊氏乳桿菌或腐生葡萄球菌及其菌 液的對(duì)照組的發(fā)酵終了狀態(tài);C羅伊氏乳桿菌;D腐生葡萄球菌M3; E腐生葡萄球菌M26; F腐生 葡萄球菌M39;G商品脲酶。
【具體實(shí)施方式】
[0013]脲酶活性檢測(cè)方法：
[0014] 測(cè)量所需試劑：
[0015] 顯色劑I:將30g苯酚和1.25g亞硝基鐵氰化鈉溶于超純水，定容至500mL。
[0016] 顯色劑II:將26.25g氫氧化鈉和15mL次氯酸鈉溶于超純水，定容至500mL。
[0017] 終止劑:稱取50g三氯乙酸溶于超純水，定容至500mL。
[0018] 酶活定義:在常壓、37°C、pH 7.0的條件下，每分鐘分解尿素生成Ιμπιο?氨為一個(gè)酶 活力單位(U)。
[0019] 測(cè)定原理:脲酶降解尿素生成二氧化碳和NH3,根據(jù)NH3與苯酚-次氯酸鈉的顯色反 應(yīng)，于分光光度計(jì)625nm處測(cè)量OD值，根據(jù)NH 3的生成量計(jì)算酶活。
[0020] 測(cè)量方法:取ImL粗酶液和ImL超純水，各加入ImL 4%的尿素溶液。37°C恒溫水浴 反應(yīng)15min后加入ImL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，震蕩混勻。加入ImL的顯色劑I和顯色劑II， 混勻后于37°C水浴20min。顯色反應(yīng)結(jié)束后用超純水稀釋至10mL，于分光光度計(jì)625nm處測(cè) 定吸光值。
[0021] 酶活計(jì)算公式:酶活
[0022]式中AOD625為樣品與空白對(duì)照吸光值之差，η為酶液稀釋倍數(shù)，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率 倒數(shù)，15為反應(yīng)的時(shí)間(min)。
[0023]白酒酒醅中尿素含量的檢測(cè)：
[0024] 樣品處理:取發(fā)酵后酒醅20g，用30mL超純水溶解，超聲30min，離心，取上清液400μ 1，加入600μ1 0.02mol/L占頓醇，再加入100yll.5mol/L HC1，避光反應(yīng)30min。反應(yīng)后樣品 過(guò)0 · 22um濾頭過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)。
[0025]檢測(cè)條件:安捷倫液相色譜儀Agilent 1260(美國(guó)安捷倫公司）；分析方法:采用占 頓醇在酸性避光條件下與尿素發(fā)生衍生化反應(yīng)，通過(guò)FLD檢測(cè)衍生化產(chǎn)物，得到尿素含量。 色譜柱:Gemini-NX 5u C18110A(250X4.6mm)，柱溫:35°C;流速熒光檢測(cè)器:λ 6叉=213]1111，人6111 = 308111]1。流動(dòng)相八相：稱取1.64(^無(wú)水乙酸鈉于10001111^燒杯中，加入10001111^ 超純水溶解，將pH調(diào)至7.20,過(guò)0.22μπι水系濾膜，超聲15min備用；流動(dòng)相Β:純乙腈(HPLC); 流動(dòng)相C:取500mL超純水過(guò)0.22μπι水系濾膜，備用。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
[0026]表1流動(dòng)相之間的比例及時(shí)間
[0028]實(shí)施例1白酒釀制流程
[0029] 五糧(大米、糯米、玉米、小麥、高粱，比例為24:18:10:11:17)加水潤(rùn)料后，加入出 窖大茬酒醅，混勻后入甑蒸餾出酒，攤晾，加水(90°C)，待溫度降至常溫（18~19°C)，拌入大 曲，同時(shí)分別加入腐生葡萄球菌、羅伊氏乳桿菌或者粗酶液或者商品脲酶(商品脲酶購(gòu)買自 生物工程（上海）股份有限公司，編號(hào)A003885，生產(chǎn)廠家Worthington Biotecnical Corperation)，腐生葡萄球菌接種量為IO7~IO8CFlVg，羅伊氏乳桿菌接種量為IO 7~ IO8CFlVg，腐生葡萄球菌的酶液加入量為43.9~45.6U/g，羅伊氏乳桿菌的酶液加入量為 0.19U/g，商品脲酶的加入量為0.19U/g。以不加菌株或酶為對(duì)照，設(shè)置3個(gè)平行樣，每個(gè)質(zhì)量 100g?？販?0°C，厭氧發(fā)酵70天，取發(fā)酵15天樣品測(cè)定尿素含量。
[0030] 實(shí)施例2白酒酒醅中尿素含量與加入不同菌株的關(guān)系
[0031] (1)腐生葡萄球菌和羅伊氏乳桿菌濃菌液準(zhǔn)備
[0032] 3株腐生葡萄球菌（腐生葡萄球菌從白酒大曲中篩選，分別是Staphylococcus saprophyt i cus strain M3、Staphylococcus saprophyt i cus strain M26、 Staphylococcus saprophyticus strain M39)接入發(fā)酵培養(yǎng)基（ρΗ6·8)，30°C220rpm搖床 培養(yǎng)24h，離心收集菌體，用0.9%的生理鹽水懸浮配制腐生葡萄球菌濃菌液（IO 9~IOlt3CFU/ mL)。羅伊氏乳桿菌接入MRS培養(yǎng)基(pH自然），厭氧培養(yǎng)3d，離心收集菌體，用0.9%生理鹽水 懸浮配制羅伊氏乳桿菌濃菌液(1〇 9~101()CFU/mL)。
[0033] (2)將濃菌液加入入窖酒醅
[0034] 在酒醅入窖之前分別將3株腐生葡萄球菌和羅伊氏乳桿菌濃菌液加入酒醅，每 100g酒醅加40mL，攪拌均勻，以不加菌液為對(duì)照，每組3個(gè)平行，30°C厭氧發(fā)酵15d。每種添加 方式酒醅中尿素含量取3個(gè)平行的平均值。
[0035] (3)酒醅中尿素含量的檢測(cè)
[0036]不同菌株對(duì)酒醅中氨基甲酸乙酯前體尿素的含量影響如圖1，發(fā)酵起始時(shí)尿素含 量為21.13mg/kg，分別添加三株腐生葡萄球菌、羅伊氏乳桿菌、商品脲酶進(jìn)行厭氧發(fā)酵15天 后，不添加菌株的酒醅中尿素含量為21.13mg/kg，添加腐生葡萄球菌的酒醅中尿素含量分 別為21.13mg/kg、24.0 2mg/kg，2 2 · O 9mg/kg，沒(méi)有明顯效果;添加商品脲酶的酒醅中尿素含 量為20.60mg/kg，沒(méi)有明顯效果;添加羅伊氏乳桿菌的酒醅中尿素含量降為Omg/kg，效果顯 著。
[0037] 實(shí)施例3白酒酒醅中尿素含量與加入不同粗酶液的關(guān)系
[0038] (1)腐生葡萄球菌和羅伊氏乳桿菌粗酶液制備
[0039] 腐生葡萄球菌接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基(pH6.8)，30°C220rpm搖床培養(yǎng)24h，離心收集 菌體，用PBS緩沖液(pH7.0)洗滌菌體3次，懸浮至30mL，加入0.1 mm玻璃珠，用FastPrep細(xì)胞 破碎儀進(jìn)行機(jī)械破碎80s，用低溫冷凍離心機(jī)1000 Orpm，4 °C離心10min，獲取上清液，酶活為 153.9~159.5U/mL。羅伊氏乳桿菌接入200mL MRS培養(yǎng)基，30°C厭氧培養(yǎng)3d，離心收集菌體， 用I3BS緩沖液(pH7.0)洗滌菌體3次，懸浮至80mL，加入0.1 mm玻璃珠，用FastPrep細(xì)胞破碎儀 進(jìn)行機(jī)械破碎100s，用低溫冷凍離心機(jī)lOOOOrpm，4°C離心10min，獲取上清液，酶活為 0.6537U/mL〇
[0040] (2)將粗酶液加入入窖酒醅
[0041] 在酒醅入窖之前分別將3株腐生葡萄球菌和羅伊氏乳桿菌的粗酶液加入酒醅，每 100g酒醅加40mL，攪拌均勻，以不加菌液為對(duì)照，每組3個(gè)平行，30°C厭氧發(fā)酵15d。每種添加 方式酒醅中尿素含量取3個(gè)平行的平均值。
[0042] (3)酒醅中尿素含量檢測(cè)
[0043]不同菌株粗酶液對(duì)酒醅中氨基甲酸乙酯前體尿素的含量影響如圖2,發(fā)酵起始時(shí) 尿素含量為21.13mg/kg，分別加入三株腐生葡萄球菌、羅伊氏乳桿菌的粗酶液以及商品脲 酶進(jìn)行厭氧發(fā)酵15天后，不添加粗酶液的酒醅中尿素含量為22.09mg/kg;添加腐生葡萄球 菌粗酶液的酒醅中尿素含量分別為21 · 13mg/kg、22.09mg/kg、22.09mg/kg，無(wú)明顯效果；添 加商品脲酶的酒醅中尿素含量為20.60mg/kg，沒(méi)有明顯效果；添加羅伊氏乳桿菌粗酶液的 酒醅中尿素含量降為〇mg/kg，效果顯著。
[0044] 從上述結(jié)果可以看出，雖然來(lái)源于白酒大曲的腐生葡萄球菌產(chǎn)生的粗酶液的活力 遠(yuǎn)高于羅伊氏乳桿菌的，但是將兩菌或其所產(chǎn)粗酶液分別添加到酒醅中進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，腐生 葡萄球菌或其產(chǎn)生的粗酶液能夠發(fā)揮的效果可以忽略不計(jì)，而羅伊氏乳桿菌卻能徹底去除 尿素。原因可能是，體外測(cè)定脲酶活力的條件下，腐生葡萄球菌的脲酶活力保持在較高的水 平，而在白酒釀造那個(gè)菌種復(fù)雜的條件下，腐生葡萄球菌的脲酶不能發(fā)揮其活性。
[0045] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種降低白酒酒醅中氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)的方法，其特征在于，是在酒醅入窖發(fā) 酵之前加入羅伊氏乳桿菌和/或羅伊氏乳桿菌所產(chǎn)的脲酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)是尿素。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述羅伊氏乳桿菌是在酒醅入窖發(fā)酵之前 加入，使酒醅中羅伊氏乳桿菌的濃度達(dá)到1〇 7~l〇8CFU/g。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述羅伊氏乳桿菌所產(chǎn)的脲酶是以粗酶液 的形式在酒醅入窖發(fā)酵之前加入，使酶活達(dá)到〇.19U/g。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟為：（1)菌種活 化；（2)粗酶液制備:將培養(yǎng)好的菌液用洗滌懸浮，破壁，收集破壁液上清中的粗酶液；（3)發(fā) 酵:取入窖大茬酒醅，加入菌液或的粗酶液，發(fā)酵釀酒。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，（1)菌種活化:羅伊氏乳桿菌接入MRS培養(yǎng) 基，30°C厭氧培養(yǎng)72h; (2)粗酶液制備:將培養(yǎng)好的菌液用20mM，pH7.0的roS緩沖液洗滌懸 浮，加入直徑0.1mm的玻璃珠，進(jìn)行機(jī)械破碎，lOOOOrpm離心10分鐘，取上清液，即為粗酶液； (3)發(fā)酵:取入窖大茬酒醅，加入用生理鹽水懸浮的菌液或制備好的粗酶液，攪拌均勻，30°C 厭氧發(fā)酵15天。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述白酒是濃香型白酒。
【文檔編號(hào)】C12R1/225GK105861235SQ201610453534
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】方芳, 孟慶達(dá), 陳堅(jiān), 堵國(guó)成
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)