專利名稱：布氏乳酸桿菌制劑、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于飼料領(lǐng)域，涉及一種功能菌種—布氏乳酸桿菌(L.buchneri)制劑、其制備方法，以及采用布氏乳酸桿菌制劑改善全株玉米青貯飼料開窖后穩(wěn)定性的用途。
背景技術(shù)：
青貯飼料種類繁多，具有來源廣，成本低，采集方便，適口性好和養(yǎng)分比較全面等特點(diǎn)，是有關(guān)食草性動(dòng)物的主要飼料，比如是牛、羊等的理想飼料。一般禾本科作物、豆科作物、塊根、塊莖以及水生飼料和樹葉等均可用來青貯。目前用得最多的是專門種植用于青貯的玉米(帶谷穗)，其次是摘穗后的玉米秸、高粱秸以及甘薯藤。
青貯的原理是在適宜的條件下，通過厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生酸性環(huán)境，抑制有害微生物的繁衍，從而達(dá)到保存飼料的目的。青貯飼料是一個(gè)復(fù)雜的微生物共生體系，主要包括乳酸菌，酵母菌，梭狀芽孢桿菌和芽孢桿菌，乙酸菌，霉菌，其中以乳酸菌的數(shù)量和種類最多，也是在青貯飼料發(fā)酵中起主要作用的微生物。乳酸菌產(chǎn)酸和耐酸能力都很強(qiáng)，它們能夠利用原料中的碳水化合物進(jìn)行乳酸發(fā)酵，形成乳酸和少量乙酸，可使青貯飼料中乳酸含量達(dá)到1.5％～2％，使得pH降低。由于青貯飼料中添加了天然快速發(fā)酵劑，所以在發(fā)酵前期，可以快速降低環(huán)境pH值，pH值的迅速下降，不僅抑制丁酸菌的繁殖，也能阻止其他不良菌，如絲狀真菌、酵母及霉菌的生長，從而有利于改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。
在制作時(shí)，整株秸稈(包括桿、莖、葉)都可用于青貯，秸稈的綠色和葉片可以保存下來。所以，能保存作物秸稈中85％以上的養(yǎng)分。而且由于青貯飼料柔軟多汁、氣味酸甜芳香，適口性好，十分適于飼喂肉牛，肉牛也很喜歡采食；并能促進(jìn)消化腺的分泌，對(duì)于提高飼料的消化率有良好作用。
玉米青貯飼料是養(yǎng)牛業(yè)必不可少的常用飼料，一頭牛平均每天采食20千克左右，青貯飼料由于可以全年均衡供給，因此可以克服冬春季節(jié)由于缺乏優(yōu)質(zhì)的青粗飼料對(duì)養(yǎng)牛業(yè)帶來的不利影響。玉米青貯飼料是我國養(yǎng)牛業(yè)的主要飼料，而全株玉米青貯在世界范圍內(nèi)已經(jīng)被廣泛采用，近年來隨著奶業(yè)的快速發(fā)展，在我國養(yǎng)牛業(yè)中已經(jīng)普遍被接受和采用。
全株玉米是一種制備青貯飼料的主要原料，其制備簡易，歷史久遠(yuǎn)。然而，傳統(tǒng)方法制備的玉米青貯飼料由于采用乳酸發(fā)酵，青貯完成后其乙酸、丙酸等濃度偏低，開窖后由于厭氧環(huán)境被破壞，耗氣性微生物重新大量滋生，引起其穩(wěn)定性急劇下降，主要特征是酵母、霉菌大量滋生，葡萄糖氧化速度加快，CO2產(chǎn)生量快速增加，不僅造成玉米青貯飼料品質(zhì)下降，而且由于霉菌大量滋生所產(chǎn)生的霉菌毒素給飼料安全帶來極大風(fēng)險(xiǎn)。如不及時(shí)利用或利用速度過慢，由于其穩(wěn)定性急劇下降會(huì)造成大量損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可改善青貯飼料開窖后穩(wěn)定性和提高全株玉米青貯品質(zhì)布氏乳酸桿菌(L.buchneri)制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種布氏乳酸桿菌制劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種布氏乳酸桿菌制劑在改善青貯飼料開窖后穩(wěn)定性方面的用途，能有效提高玉米青貯飼料的品質(zhì)，化解有害微生物大量增殖帶來的飼料安全風(fēng)險(xiǎn)。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種布氏乳酸桿菌制劑，每克含1×109～1×1011個(gè)布氏乳酸桿菌(L.buchneri)菌落形成單位(cfu/g)。
優(yōu)選為，每克含1×109～1×1010個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu/g)。
所述的布氏乳酸桿菌(L.buchneri)購自中國微生物菌種保藏中心(CICC)，CICC編號(hào)為6007。
布氏乳酸桿菌的生物學(xué)特性(1)桿菌，通常短和直，0.7～1.0×2.0～4.0微米，兩端圓，單個(gè)或成短鏈。
(2)菌落一般粗糙或?yàn)橹虚g型，扁平，可能近乎透明。
(3)異型發(fā)酵，從高壓滅菌的葡萄糖培養(yǎng)基中產(chǎn)酸和氣，對(duì)分別滅菌的葡萄糖是好氧分解代謝。發(fā)酵產(chǎn)物為DL-乳酸(50％的葡萄糖的總碳量)，其他較重要的產(chǎn)物是乙酸鹽、乙醇和CO2。
(4)產(chǎn)生最大量酸的溫度是23～30℃，菌種生長最適溫度30℃。
為了便于運(yùn)輸使用并減少活菌凍干損失，延長乳酸菌劑產(chǎn)品貨架期，可將乳酸菌劑制成凍干粉。當(dāng)所述布氏乳酸桿菌制劑為凍干劑型時(shí)，還含有以制劑總重量計(jì)30～40％的凍干保護(hù)劑。
所述凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，甘油和脫脂奶的體積比1∶1～1∶2。
所述布氏乳酸桿菌制劑采用布氏乳酸桿菌(L.buchneri)經(jīng)活化、接種培養(yǎng)、離心、冷凍干燥而成。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的另一目的，本發(fā)明所述布氏乳酸桿菌制劑的制備方法，包括如下步驟1)將布氏乳桿菌種在活化培養(yǎng)基中28～32℃下活化培養(yǎng)15～20h；然后采用平板劃線法在28～32℃下純化培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)1～2天，得純化菌液；2)再將純化菌液以3～7％的接種量接種到發(fā)酵罐中，pH值控制在5.0～7.0，在發(fā)酵培養(yǎng)基中28～32℃下混合培養(yǎng)30～40h得發(fā)酵液；3)然后所述的發(fā)酵液在20～26℃下，轉(zhuǎn)速3000～4000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心處理30～40分鐘，得發(fā)酵菌泥；4)最后向發(fā)酵菌泥中加入所述凍干保護(hù)劑后，進(jìn)行冷凍干燥得乳酸菌凍干粉。
其中，所述的活化培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3～6.5。
所述的純化培養(yǎng)基為加碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3～6.5。在上述1000ml液體培養(yǎng)基中加入15～20g瓊脂，7.5g碳酸鈣，115℃高壓滅菌15～20mim備用。
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基也可采用MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3～6.5。
本發(fā)明純化培養(yǎng)時(shí)所采用的平板劃線法為本領(lǐng)域常用的方法。
本發(fā)明所采用的發(fā)酵罐為本領(lǐng)域常用的發(fā)酵罐，可為5L、10L或50L等規(guī)格。
所述發(fā)酵過程中pH值的控制可采用乳酸調(diào)控。
所述凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，甘油溶液的濃度為8～15％，脫脂奶溶液為8～15％，以容積比1∶1～1∶2混合。
所述菌泥(細(xì)胞糊狀物)與保護(hù)劑體積比1∶3～1∶4。
所用冷凍干燥工藝采用本領(lǐng)域常用的冷凍設(shè)備和工藝步驟即可。
比如，在-30～-40℃預(yù)凍5～7h，使其均勻凍結(jié)在瓶四周內(nèi)壁上，然后用ALPHA-2真空凍干機(jī)，等溫度降至-40～-50℃時(shí)，打開真空泵抽真空度至0.1mbar以下，裝入干燥瓶，干燥12～24h。將干粉制品保藏在4℃冰箱中。
具體地說，所述布氏乳酸桿菌制劑的制備方法為1)布氏乳桿菌的活化培養(yǎng)在無菌的情況下，將布氏乳桿菌菌粉接種到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，在28～32℃下?lián)u床培養(yǎng)15～20h。
MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3～6.5。
2)布氏乳桿菌的分離純培養(yǎng)(平板劃線法)將已加入碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌接種環(huán)蘸取已搖好的菌液進(jìn)行劃線，每個(gè)菌種做三個(gè)平皿，劃好后，用封口膠封住平皿，倒置在28～32℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1～2天。選取個(gè)體均勻的單一菌落純化培養(yǎng)，試驗(yàn)備用。平皿可以在4℃冰箱保存。
加碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3～6.5。在上述1000ml液體培養(yǎng)基中加入15～20g瓊脂，7.5g碳酸鈣，115℃高壓滅菌15～20mim備用。
3)純化菌液擴(kuò)繁，培養(yǎng)將純化菌液以布氏乳桿菌3～7％的接種量，接種于1000ml的錐形瓶中，錐形瓶中培養(yǎng)基的體積為475ml，則相應(yīng)的接種菌液量為25ml；在28～32℃下pH值為5.0～7.0，培養(yǎng)30～40h；4)離心在20～26℃下，轉(zhuǎn)速3000～4000轉(zhuǎn)/分離心30～40分鐘，棄上清液，得菌泥；5)冷凍干燥先將8～15％甘油溶液與8～15％脫脂奶粉溶液，以容積比為1∶1～1∶2混合作為保護(hù)劑，滅菌處理，再與菌泥(細(xì)胞糊狀物)，以菌泥與保護(hù)劑體積比為1∶3～1∶4混合均勻；最后在-40～-50℃冷凍干燥12～24小時(shí)，制得菌粉。
本發(fā)明所述的布氏乳酸桿菌制劑可用于改善青貯飼料開窖后穩(wěn)定性，能有效提高玉米青貯飼料的品質(zhì)，化解有害微生物大量增殖帶來的飼料安全風(fēng)險(xiǎn)。
布氏乳酸桿菌制劑用于制備青貯飼料的方法，包括飼料切割、每層飼料添加微生物添加劑，壓實(shí)后密封發(fā)酵，青貯時(shí)接菌量為每克飼料含106～108個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu)。
所述的飼料為新鮮玉米秸稈或全株玉米。
所述的微生物添加劑采用布氏乳酸桿菌制劑加去離子水配成懸浮液，濃度控制在1％～5％之間，邊青貯邊噴灑該懸浮液，按照常規(guī)青貯飼料的制備步驟即可。
也就是說，本發(fā)明所述的青貯飼料制備方法是以玉米秸稈或全株玉米為原料，在常溫下經(jīng)切碎、填充、接種、壓實(shí)、密封、發(fā)酵、貯存等工序生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)安全穩(wěn)定的玉米青貯飼料。
具體步驟如下先將蠟熟期收獲的全株玉米切割成約2～3cm；然后將切割后的玉米填充到青貯窖中；在填充青貯窖的過程中，邊青貯，邊添加專用微生物添加劑，每千克玉米物料添加25克用去離子水混勻的微生物添加劑的懸浮溶液，使接菌量達(dá)到每克飼料含106～108個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu)；在填充物料的過程中壓實(shí)物料，盡量消除青貯窖內(nèi)空氣；填充完畢后，密封所青貯的物料；發(fā)酵3個(gè)月后即可開窖利用。
本發(fā)明采用布氏乳酸桿菌(L.buchneri)用于玉米青貯飼料的制備，解決了傳統(tǒng)方法制備的玉米青貯飼料在開窖后穩(wěn)定性急劇下降的問題，并能有效提高玉米青貯飼料的品質(zhì)，化解有害微生物大量增殖帶來的飼料安全風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明所制備的玉米青貯飼料優(yōu)質(zhì)安全穩(wěn)定，適口性好，其pH值為3.8～4.31，干物質(zhì)26～30％，乙醇0.6～1.4％，乙酸5.0～7.2％，乳酸2.0～13.5％，丙酸0.5～0.9％，丙醇1.1～2.0％。在青貯窖的中心部位，玉米青貯飼料中酵母和霉菌均無檢出；而頂層酵母菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值小于3.0，無霉菌檢出。與傳統(tǒng)青貯方法相比，以重量為單位計(jì)算，玉米青貯飼料中乳酸菌菌落總量提高10～100倍，而酵母數(shù)量減少到1/8～1/10。在常溫下穩(wěn)定性提高1倍以上(溫度升高1℃所需時(shí)間為260小時(shí)以上)。


圖1為不同處理的青貯飼料貯存期間干物質(zhì)損失。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1布氏乳酸桿菌制劑采用布氏乳酸桿菌(L.buchneri)發(fā)酵培養(yǎng)、冷凍干燥而成；每克含9.5×1010個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu/g)。
其中，布氏乳酸桿菌購自中國微生物菌種保藏中心(CICC)，CICC編號(hào)為6007。
布氏乳酸桿菌制劑中含33％的凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，體積比為1∶1。
具體制備過程如下1.布氏乳桿菌的活化培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將接種環(huán)在酒精燈內(nèi)焰處灼燒，接種布氏乳桿菌菌粉到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，灼燒試管口和膠塞，塞好試管。將布氏乳桿菌放入30℃的搖床培養(yǎng)18h。
MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3。
2、布氏乳桿菌的分離純培養(yǎng)(平板劃線法)將已加入碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌接種環(huán)蘸取已搖好的菌液進(jìn)行劃線，每個(gè)菌種做三個(gè)平皿，劃好后，用封口膠封住平皿，倒置在30℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。選取個(gè)體均勻的單一菌落純化培養(yǎng)，試驗(yàn)備用。平皿可以在4℃冰箱保存。
其中，加碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.5。在上述1000ml液體培養(yǎng)基中加入20g瓊脂，7.5g碳酸鈣，115℃高壓滅菌15mim備用。
3、純化菌液擴(kuò)繁，培養(yǎng)將純化菌液以布氏乳桿菌5％的接種量，接種于1000ml的錐形瓶中，錐形瓶中培養(yǎng)基的體積為475ml，則相應(yīng)的接種菌液量為25ml；在30℃下PH值為6.0，培養(yǎng)36h；4、離心在26℃，4000轉(zhuǎn)/分下離心30分鐘，棄上清液，得菌泥；5、冷凍干燥先將10％甘油溶液與10％脫脂奶粉溶液，以容積比為1∶1混合作為保護(hù)劑，滅菌處理，再與菌泥(細(xì)胞糊狀物)，以保護(hù)劑與菌泥體積比為3∶1混合均勻；最后在-50℃冷凍干燥24小時(shí)，制得菌粉。
實(shí)施例2布氏乳酸桿菌制劑采用布氏乳酸桿菌(L.buchneri)發(fā)酵培養(yǎng)、冷凍干燥而成；每克含1.2×1010個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu/g)。
其中含40％的凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，體積比為1∶2。
具體制備過程如下1.布氏乳桿菌的活化培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)中，將接種環(huán)在酒精燈內(nèi)焰處灼燒，接種布氏乳桿菌菌粉到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，灼燒試管口和膠塞，塞好試管。將布氏乳桿菌放入32℃的搖床培養(yǎng)15h。
MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.5。
2、布氏乳桿菌的分離純培養(yǎng)(平板劃線法)將已加入碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌接種環(huán)蘸取已搖好的菌液進(jìn)行劃線，每個(gè)菌種做三個(gè)平皿，劃好后，用封口膠封住平皿，倒置在30℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天。選取個(gè)體均勻的單一菌落純化培養(yǎng)，試驗(yàn)備用。平皿可以在4℃冰箱保存。
其中，加碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.3。在上述1000ml液體培養(yǎng)基中加入15g瓊脂，7.5g碳酸鈣，115℃高壓滅菌18mim備用；3、純化菌液擴(kuò)繁，培養(yǎng)將純化菌液以布氏乳桿菌3％的接種量，接種于1000ml的錐形瓶中，錐形瓶中培養(yǎng)基的體積為475ml，則相應(yīng)的接種菌液量為25ml；在30℃下PH值為5.0，培養(yǎng)30h；4、離心在26℃，5000轉(zhuǎn)/分下離心30分鐘，棄上清液，得菌泥；5、冷凍干燥先將8％甘油溶液與12％脫脂奶粉溶液，以容積比為1∶2混合作為保護(hù)劑，滅菌處理，再與菌泥(細(xì)胞糊狀物)，以保護(hù)劑與菌泥體積比為4∶1混合均勻；最后在-50℃冷凍干燥24小時(shí)，制得菌粉。
實(shí)施例3布氏乳酸桿菌制劑采用布氏乳酸桿菌(L.buchneri)發(fā)酵培養(yǎng)、冷凍干燥而成；每克含1.0×1011個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu/g)。
其中含30％的凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，體積比為1∶1。
具體制備過程如下1.布氏乳桿菌的活化培養(yǎng)在超靜工作臺(tái)中，將接種環(huán)在酒精燈內(nèi)焰處灼燒，接種布氏乳桿菌菌粉到MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，灼燒試管口和膠塞，塞好試管。將布氏乳桿菌放入28℃的搖床培養(yǎng)20h。
MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.5。
2、布氏乳桿菌的分離純培養(yǎng)(平板劃線法)將已加入碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌接種環(huán)蘸取已搖好的菌液進(jìn)行劃線，每個(gè)菌種做三個(gè)平皿，劃好后，用封口膠封住平皿，倒置在30℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。選取個(gè)體均勻的單一菌落純化培養(yǎng)，試驗(yàn)備用。平皿可以在4℃冰箱保存。
其中，加碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲(MgSO4·7H2O 11.5g+MnSO4·4H2O 2.8g+蒸餾水100ml)5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，校正pH值為6.5。在上述1000ml液體培養(yǎng)基中加入18g瓊脂，7.5g碳酸鈣，115℃高壓滅菌20mim備用。
3、純化菌液擴(kuò)繁，培養(yǎng)將純化菌液以布氏乳桿菌7％的接種量，接種于1000ml的錐形瓶中，錐形瓶中培養(yǎng)基的體積為475ml，則相應(yīng)的接種菌液量為25ml；在28℃下PH值為7.0，培養(yǎng)40h；4、離心在26℃，3000轉(zhuǎn)/分下離心40分鐘，棄上清液，得菌泥；
5、冷凍干燥先將8％甘油溶液與15％脫脂奶粉溶液，以容積比為1∶1混合作為保護(hù)劑，滅菌處理，再與菌泥(細(xì)胞糊狀物)，以保護(hù)劑與菌泥體積比為3∶1混合均勻；最后在-50℃冷凍干燥24小時(shí)，制得菌粉。
實(shí)施例4制備方法同實(shí)施例1，不同的是，所述布氏乳酸桿菌制劑每克含1.0×109個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu)。其中含35％的凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，體積比為1∶1。
實(shí)施例5制備方法同實(shí)施例1，不同的是，所述布氏乳酸桿菌制劑每克含1.3×1011個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu)。其中含40％的凍干保護(hù)劑，凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，體積比為1∶2。
實(shí)驗(yàn)例1采用實(shí)施例1獲得的布氏乳酸桿菌制劑制備青貯飼料，其制備方法如下將蠟熟期收獲的全株玉米切割成2cm，將切割后的玉米填充到青貯窖中，在填充過程中，按照每千克玉米物料添加25克用去離子水混勻的布氏乳酸桿菌制劑的懸浮溶液，每克玉米物料提供1×106個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu)；用鏟車壓實(shí)物料，注意不留死角，目的是盡量消除青貯窖內(nèi)空氣；填充完畢后，用黑色的聚乙烯塑料薄膜蓋嚴(yán)所青貯的物料，沿青貯窖的四周用土或其它物料壓實(shí)塑料薄膜，目的是防止發(fā)酵過程中由于產(chǎn)生氣體而導(dǎo)致漏氣，造成青貯厭氧環(huán)境的破壞；發(fā)酵3個(gè)月后即可開窖利用。
所制備的玉米青貯飼料優(yōu)質(zhì)安全穩(wěn)定，適口性好，其pH值為4.3，干物質(zhì)26％，乙醇0.8％，乙酸6.2％，乳酸2.0％，丙酸0.9％，丙醇2.0％。在青貯窖的中心部位，玉米青貯飼料中酵母和霉菌均無檢出；而頂層酵母菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值小于3.0，無霉菌檢出。
實(shí)驗(yàn)例2本實(shí)驗(yàn)例目的在于研究本發(fā)明所述玉米青貯飼料開窖后穩(wěn)定性(Aerobicstability)。
1、穩(wěn)定性定義為溫度升高1℃所需要的時(shí)間，單位小時(shí)(h)。
2、測定方法取0.3kg玉米青貯飼料裝于開口的塑料瓶內(nèi)，放置在20℃的室溫下，連續(xù)260小時(shí)測定青貯飼料中心位置的溫度變化。
3、衡量開窖后穩(wěn)定性的指標(biāo)(1)、主要指標(biāo)穩(wěn)定性(Aerobic stability)使用添加劑后穩(wěn)定性由135小時(shí)提高的260小時(shí)以上，生物學(xué)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)差異極顯著(p＜0.01)。
(2)、參考指標(biāo)開窖后微生物的數(shù)量變化，單位log cfu g-1A有益菌乳酸菌總量(LAB)數(shù)量的對(duì)數(shù)值由8.31增加到9.07，生物學(xué)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)差異極顯著(p＜0.01)；B有害菌酵母(Yeast)數(shù)量的對(duì)數(shù)值由3.23減少到2.46，生物學(xué)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)差異不顯著(p＞0.01)；霉菌(Mould)未檢出三、其他發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物中乙酸、丙酸含量明顯增加(p＜0.01)，而這兩個(gè)產(chǎn)物對(duì)有害菌均有抑制作用。
四、飼料中乳酸菌的添加量為每千克玉米物料添加25克用去離子水混勻的專用微生物添加劑的懸浮溶液，為每克玉米物料提供106～108個(gè)L.buchneri菌落形成單位(cfu)。即每噸用菌種約1～2千克。
五、試驗(yàn)處理說明青貯時(shí)共有6個(gè)試驗(yàn)處理，每個(gè)處理3袋。
Con＝對(duì)照組，每kg青貯料添加25g去離子水；g1＝葡萄糖處理1組，每kg青貯料添加37.5g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖12.5g)；g2＝葡萄糖處理2組，每kg青貯料添加75g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖25g)；L.b＝布氏乳桿菌(L.buchneri)處理組，每kg青貯料添加25g L.buchneri懸浮溶液(可為每g青貯料提供106cfu L.buchneri)；L.b+g1＝布氏乳桿菌(L.buchneri)+葡萄糖處理1組，每kg青貯料添加25g L.buchneri懸浮溶液(可為每g青貯料提供106cfu L.buchneri)+每kg青貯料添加37.5g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖12.5g)L.b+g2＝布氏乳桿菌(L.buchneri)+葡萄糖處理2組，每kg青貯料添加25g L.buchneri懸浮溶液(可為每g青貯料提供106cfu L.buchneri)+每kg青貯料添加75g葡萄糖溶液(其中含葡萄糖25g)表1 供試全株玉米的成分測定與微生物組成

表2 玉米青貯飼料貯存91天時(shí)的化學(xué)組成、發(fā)酵產(chǎn)物濃度、微生物組成(青貯裝置為聚乙烯雙層塑料袋，每袋有2-kg全株玉米)


a，b，c，d，e，f同行肩注不同小寫字母者表示差異顯著(p＜0.05)A，B，C，D，E，F(xiàn)同行肩注不同大寫字母者表示差異極顯著(p＜0.01)結(jié)論圖1為不同處理的青貯飼料貯存期間干物質(zhì)損失，采用布氏乳桿菌比對(duì)照組干物質(zhì)損失少，而且玉米青貯飼料中采用布氏乳桿菌比對(duì)照組乳酸菌菌落總量提高10～100倍，而酵母數(shù)量減少到1/8～1/10。在常溫下穩(wěn)定性提高1倍以上(溫度升高1℃所需時(shí)間為260小時(shí)以上)。
權(quán)利要求
1.一種布氏乳酸桿菌制劑，其特征在于每克含1×109～1×1011個(gè)布氏乳酸桿菌(CICC編號(hào)為6007)菌落形成單位。
2.如權(quán)利要求1所述的布氏乳酸桿菌制劑，其特征在于每克含1×109～1×1010個(gè)L.buchneri菌落形成單位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的布氏乳酸桿菌制劑，其特征在于含有以制劑總重量計(jì)30～40％的凍干保護(hù)劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的布氏乳酸桿菌制劑，其特征在于所述的凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，甘油和脫脂奶的體積比1∶1～1∶2。
5.一種制備權(quán)利要求1～4中任一權(quán)利要求所述的布氏乳酸桿菌制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟1)將布氏乳桿菌種在活化培養(yǎng)基中28～32℃下活化培養(yǎng)15～20h；然后采用平板劃線法在28～32℃下純化培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)1～2天，得純化菌液；2)再將純化菌液以3～7％的接種量接種到發(fā)酵罐中，pH值控制在5.0～7.0，在發(fā)酵培養(yǎng)基中28～32℃下混合培養(yǎng)30～40h得發(fā)酵液；3)然后所述的發(fā)酵液在20～26℃下，轉(zhuǎn)速3000～4000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心處理30～40分鐘，得發(fā)酵菌泥；4)最后向發(fā)酵菌泥中加入所述凍干保護(hù)劑后，進(jìn)行冷凍干燥得乳酸菌凍干粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述布氏乳酸桿菌制劑的制備方法，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，pH值為6.3～6.5。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述布氏乳酸桿菌制劑的制備方法，其特征在于，所述的純化培養(yǎng)基為加碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS瓊脂培養(yǎng)基成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，pH值為6.3～6.5；在上述1000mi液體培養(yǎng)基中加入15～20g瓊脂，7.5g碳酸鈣，115℃高壓滅菌15～20mim備用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述布氏乳酸桿菌制劑的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，其成分為蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐溫-801ml，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，鹽酸甲5ml，將各成分加溫溶解于蒸餾水中，過濾，加入葡萄糖20g，蒸餾水加至1000ml，pH值為6.3～6.5。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述布氏乳酸桿菌制劑的制備方法，其特征在于，所述凍干保護(hù)劑為甘油和脫脂奶，甘油溶液的濃度為8～15％，脫脂奶溶液為8～15％，以容積比1∶1～1∶2混合，所述菌泥與保護(hù)劑體積比1∶3～1∶4。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述布氏乳酸桿菌制劑在用于制備玉米秸稈或全株玉米青貯飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種布氏乳酸桿菌制劑，其每克含1×10
文檔編號(hào)A23K3/02GK1831111SQ200610011558
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2006年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月24日
發(fā)明者管武太, 楊金波 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)