專利名稱：含乳酸桿菌作為活性成分的活細菌制劑以及含有乳酸桿菌的食品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有乳酸桿菌作為活性成分用于徹底口腔護理的藥物(活細菌制劑)，用于預防和治療牙齦炎、牙周炎、牙周疾病、齲齒和口臭，以及涉及一種含有乳酸桿菌的食品及其應用。
背景技術(shù)：
根據(jù)日本厚生勞動省(Japanese Ministry of Health，Labor andWelfare)的調(diào)查報告，患有牙周疾病的患者數(shù)目占國民人口的總數(shù)根據(jù)調(diào)查由1975年的18.2％上升到1993年的61.8％和1999年的72.9％，其后該數(shù)字穩(wěn)定增長，而推測的病人數(shù)目已達到甚至9千萬，目前的形勢是從醫(yī)藥經(jīng)濟的觀點大量開支投入到牙科領(lǐng)域。
因此，當局在1988年決定在全國范圍內(nèi)致力于牙周疾病的預防，并開展和推動了所謂的“8020行動”。
然而，當前病人的數(shù)目仍然沒有減少，因此人們期望發(fā)展出該疾病預防和治療的突破性方法。
近年來，牙周疾病被指出不僅僅是牙齦器官的慢性感染疾病，也具有引起諸如由血管瘤導致的心臟梗塞和血管損傷等循環(huán)系統(tǒng)疾病的危險，而牙周疾病作為誘發(fā)糖尿病和早產(chǎn)的危險因素也引起了注意。迄今仍無牙周疾病的合適治療方法，實際上使用牙科方法治療，即發(fā)病部位的殺菌劑給藥，外科手術(shù)，和抗生素口服給藥。然而，長期連續(xù)給藥殺菌劑和抗生素進行治療會由于其使用產(chǎn)生新的耐藥細菌，同時帶來藥物副作用產(chǎn)生的許多嚴重問題。因此，目前的形勢是沒有建立起任何令人滿意的治療方法。
因此，為預防和治療牙周疾病和齲齒，作為殺菌劑和抗生素給藥的替代方法，人們研究了應用乳酸桿菌預防和治療上述疾病的可能性。
應用乳酸桿菌預防和治療牙周疾病的方法，應用糞腸球菌(Enterococcus faecium)，馬鏈球菌(Streptococcus equinus)，發(fā)酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)，唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)細胞或者水提取物作為活性成分的方法，公開于日本專利早期公開(Kokai)No.61-91126和日本專利公開(Kokoku)No.4-52249。此外，在國際專利公開WO99/07826中，研究了由乳酸桿菌(Lactobacillusspp.)V20和口腔鏈球菌(Streptococcus oralis)表達或者產(chǎn)生的阻遏葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶抑制活性和口臭發(fā)展的因子，和上述的抑制過氧化氫產(chǎn)生的乳酸桿菌。
同時，有400種或者更多種的細菌棲息于人類口腔，而細菌數(shù)目達到甚至100億。順便提及，唾液中檢測到108到109CFU/毫升(菌落形成單位/毫升)水平的細菌數(shù)目。因此，人類口腔中形成了復雜的微生物群落(口腔微生物群落)，因而基于簡單的體外系統(tǒng)所獲得結(jié)果的推斷討論人類牙周疾病和口臭的預防和治療效果是非常成問題的。此外，為討論假定對人給藥的效果，也需要考慮含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品中活細菌的活力，以及這種含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品的風味和物理化學特征。然而，在上述的關(guān)于使用乳酸桿菌預防和治療牙周疾病和口臭的文獻中，根本沒有公開使用人或者模型動物的體內(nèi)系統(tǒng)獲得的消除或者抑制牙周疾病和齲齒的數(shù)據(jù)，或者有關(guān)含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品中活細菌活力的數(shù)據(jù)，以及這種含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品的風味和物理化學特征。
因為預想用含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品對人給藥，用其中的細菌菌株作為預防和治療牙周疾病和口臭的手段，在使用人和模型動物的試驗中應當選擇能確切地消除或者抑制牙周疾病和齲齒的病原細菌(口腔病原細菌)的乳酸桿菌菌株。此外，當乳酸桿菌菌株用于含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品時，關(guān)鍵是乳酸桿菌菌株應當表現(xiàn)出高活力，優(yōu)選制劑或者食品表現(xiàn)出優(yōu)良的風味和物理化學特征。
發(fā)明的內(nèi)容考慮到目前涉及應用乳酸桿菌預防和治療上述牙周疾病和齲齒的技術(shù)水平，本發(fā)明的目的是提供能夠防止牙周疾病和/或齲齒發(fā)病、復發(fā)和惡化的乳酸桿菌菌株，其中引起疾病的細菌是牙周疾病致病細菌和生齲細菌。本發(fā)明的另一個目的是提供含有包括上述乳酸桿菌菌株的乳酸桿菌活細菌制劑和食品。
選擇如上所述的其效力被臨床證實的菌株是極其重要的，它能夠消除或者抑制牙周疾病和齲齒的病原細菌(口腔病原細菌)，以及使口腔微生物群落正?；苑乐箍诔舻漠a(chǎn)生，將唾液的pH值保持在正常的生理水平等等。
本發(fā)明的發(fā)明人從上述觀點出發(fā)篩選了各種屬于乳酸桿菌屬的乳酸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液乳酸桿菌具有上述特征，從而實現(xiàn)了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品，其中含有作為活性成分的乳酸桿菌，唾液乳酸桿菌(Lactobacillussalivarius)。本發(fā)明的含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品能夠用于使口腔內(nèi)微生物群落正?；乐寡例l炎、牙周炎和牙周疾病的發(fā)作，防止齲齒的發(fā)作，防止口臭的發(fā)生和消除口臭，等等。
本發(fā)明還提供了唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)作為特別優(yōu)選的唾液乳酸桿菌菌株，及其細胞細胞和干燥細胞。本發(fā)明上述的含有乳酸桿菌的活細菌制劑和食品尤其優(yōu)選含有唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)作為唾液乳酸桿菌菌株。
本發(fā)明還提供了用于制備含有唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERMBP-7974)的活細菌制劑和食品的，乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)的應用，以及一種含有乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI2711菌株(FERM BP-7974)和具有不同于該菌株作用機制的活性成分的組合物。
附圖的簡要說明

圖1是顯示唾液乳酸桿菌TI 2711菌株對小鼠口腔牙齦卟啉單胞菌JCM 8525菌株抑制效果(體內(nèi))的圖。
圖2是顯示唾液乳酸桿菌TI 2711菌株對小鼠口腔變異鏈球菌(S.mutans)MT8148菌株抑制效果(體內(nèi))的圖。
圖3是顯示人口腔內(nèi)細菌總數(shù)變化的圖。
圖4是顯示人口腔牙周炎致病細菌(黑色-著色厭氧桿菌，BPAR)數(shù)目變化的圖。
圖5是顯示人口腔變異鏈球菌數(shù)目變化的圖。
圖6是顯示口腔內(nèi)乳酸桿菌數(shù)目變化的圖。
圖7是顯示人唾液pH值變化的圖。
圖8是顯示人唾液中不溶解葡聚糖的量的變化的圖。
圖9是顯示使用口氣分析儀(Halimeter)測定口臭結(jié)果的圖。
圖10是顯示試驗實施例2中實驗1和2的實驗程序概要的圖。
圖11是顯示試驗實施例3中臨床試驗的試驗程序概要的圖。
實施本發(fā)明的最佳方式為選擇滿足本發(fā)明上述目的的乳酸桿菌菌株，本發(fā)明的發(fā)明人根據(jù)下述程序測試了分離自健康對象口腔的許多乳酸桿菌屬母株(30種菌株)并選擇出最適宜菌株。
1.選擇與一般的乳酸桿菌相比在最短時間內(nèi)增殖的菌株(參見試驗實施例1，(1))。
2.將乳酸桿菌屬的各個母株(30個菌株)和臨床上分離的主要牙周疾病致病細菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)，中間普雷沃菌(Prevotella intermedia)和黑色普雷沃菌(Prevotellanigrescens)(例如見試驗實施例1，(2)使用牙齦卟啉單胞菌)的培養(yǎng)物混合，選擇能夠強烈地抑制牙周疾病致病細菌生長的菌株。
3.然后，將上述第1部分的乳酸桿菌屬各個母株(30個菌株)和臨床上分離的引起齲齒的主要細菌菌株變異鏈球菌(Streptococcusmutans)和茸毛鏈球菌(Streptococcus sobrinus)(例如見試驗實施例1，(3)使用變異鏈球菌)的培養(yǎng)物分別混合，選擇能夠明顯抑制致齲齒細菌生長的菌株。
4.進一步地，為了證實對于齲齒的效果，對混合培養(yǎng)物中不溶葡聚糖(齲齒的主要致病物質(zhì))進行了定量，選擇顯著抑制不溶葡聚糖產(chǎn)生的菌株(見試驗實施例1，(3))。
5.然后，為了證實上述體外試驗1到4部分選擇的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株的效果，進行了無菌小鼠感染模型試驗(見試驗實施例2)。程序概要如下。
1)將牙周疾病致病細菌牙齦卟啉單胞菌接種到無菌小鼠口腔并在其中繁殖。然后，口腔給予唾液乳酸桿菌TI 2711菌株，對牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目進行計數(shù)以確證致病細菌生長受到明顯抑制(見實驗1)。
2)將致齲齒細菌變異鏈球菌接種到無菌小鼠口腔并在其中繁殖。然后，口腔給予唾液乳酸桿菌TI 2711菌株，對變異鏈球菌細胞數(shù)目進行計數(shù)以確證致病細菌生長受到明顯抑制(見實驗2)。
6.作為臨床試驗，在知情同意的情況下對健康志愿者(n＝57)進行接種并從他們收集口腔內(nèi)唾液。分別計數(shù)細菌總數(shù)，牙周疾病致病細菌數(shù)目(革蘭氏陰性BPAR菌落(黑色-著色厭氧桿菌))，致齲齒細菌變異鏈球菌數(shù)目，和有益細菌乳酸桿菌數(shù)目。此外，測定唾液的pH值和唾液中不溶解葡聚糖的量，使用口氣分析儀測量口腔的口臭程度。
此后，志愿者在8個星期的服用期內(nèi)服用唾液乳酸桿菌TI 2711片劑(糖味片劑)。在服用4周后和8周后，即在服用期結(jié)束測定所有上述項目，通過詢問測驗服用后的效果和副作用。用Wilcoxon法統(tǒng)計處理所有項目的結(jié)果。結(jié)果所有項目在服用前后客觀觀察到明顯差異。此外，基于詢問的綜合結(jié)果進行了總體評價，并清楚地確證了臨床試驗的效果(見實驗3)。
上述1到4部分所選擇的作為滿足本發(fā)明目的的菌株的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株的細菌學特征如下。
A形態(tài)學特征細胞形態(tài)桿狀細菌細胞大小0.6～0.9×1.7～5.2微米運動性無芽孢發(fā)生無革蘭氏染色陽性B生理學特征(陽性+，陰性-)氣體產(chǎn)生-過氧化氫酶-凝膠液化能力-氧化特性兼性需氧吲哚產(chǎn)生-硝酸鹽還原能力-硫化氫產(chǎn)生-產(chǎn)生的乳酸旋光異構(gòu)體L-異構(gòu)體C糖的同化作用(同化作用陽性+，同化作用陽性-)
阿拉伯糖-苦杏苷-纖維二糖-七葉苷-半乳糖+葡萄糖+果糖+葡萄糖酸-乳糖+麥芽糖+甘露醇+甘露糖+蜜二糖+棉子糖+松三糖-鼠李糖+核糖-山梨醇+蔗糖+木糖-水楊苷-海藻糖+基于前述的細菌學特征，并根據(jù)伯杰氏細菌分類學手冊，卷2(1986)和Tomotari Mitsuoka，Chonaikin no Sekai(World ofEnterobacteriaceae)，Soubunsha，(1980)，本發(fā)明上述1到4部分選擇的菌株被鑒定為唾液乳酸桿菌，該菌株被命名為唾液乳酸桿菌TI 2711菌株。該菌株于2002年3月26日保存于獨立的管理機構(gòu)，國立高等工業(yè)科技研究所，國際專利生物保藏機構(gòu)(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵政編碼305-8566)，保藏號為FERM BP-7974。
本發(fā)明的乳酸桿菌菌株，唾液乳酸桿菌TI 2711菌株口腔給藥時能夠抑制或者阻止牙周疾病致病細菌和致齲齒細菌附著到齒齦組織，牙周袋和牙齒，以及抑制或者阻止這些致病菌的生長，并且能夠抑制或者消除存在于口腔中的病原細菌。因此，本發(fā)明提供了預防和治療可稱為全國性疾病的牙周疾病和齲齒的非常有效的手段。自然界中廣泛觀察到這種宿主和口腔內(nèi)微生物的相互作用，這種相互關(guān)系可理解為宿主和微生物之間的共生，寄生或拮抗現(xiàn)象。
后面將描述本發(fā)明的乳酸桿菌菌株(唾液乳酸桿菌TI 2711菌株)的應用。
本發(fā)明的乳酸桿菌菌株(唾液乳酸桿菌TI 2711菌株)能夠作為活性成分給藥或者作為單獨活性成分的制劑與合適添加劑一起給藥，或者可以單獨或者作為混合物與其它活性組分，例如其它具有不同于該菌株作用機制的口腔護理藥物同時給藥。優(yōu)選的劑型包括例如粉劑，顆粒劑，片劑，膠囊劑，針劑等等，且菌株能夠安全地口服給藥。當本發(fā)明的乳酸桿菌菌株用于這些劑型時，優(yōu)選將本發(fā)明乳酸桿菌菌株的干燥細胞配制成制劑。本發(fā)明乳酸桿菌菌株的干燥細胞(活細菌)能夠通過傳統(tǒng)的方式來獲得，例如培養(yǎng)本發(fā)明乳酸桿菌菌株純培養(yǎng)物，通過例如離心方法收集細胞，向細胞中加入合適的穩(wěn)定劑并凍干細胞。
上述各種制劑也可通過傳統(tǒng)的方式來制備，且可以通過使用諸如賦形劑，粘合劑，崩解劑，包被劑，脫模劑，穩(wěn)定劑，反佐藥，增溶助劑，潤滑劑，懸浮劑和稀釋劑等已知的藥用添加劑與作為活性成分的本發(fā)明的乳酸桿菌菌株來制備。
上述各種制劑的劑量變化依賴于給藥對象病癥的類型和嚴重性，例如依據(jù)癥狀可以以每天一次或者幾次，給予大約1毫克到2,000毫克量的本發(fā)明乳酸桿菌菌株干燥細胞制劑。
另外，本發(fā)明的乳酸桿菌菌株可以通過添加到廣泛范圍的各種食品包括例如諸如糖味片劑，口香糖和糖果等糖食，和諸如朝鮮泡菜等泡菜中，從而提供含有乳酸桿菌的食品。同時當本發(fā)明的乳酸桿菌菌株用于食品時，優(yōu)選使用本發(fā)明乳酸桿菌菌株的干燥細胞(活細菌)，它能夠可選擇地和食品中容許的添加劑一起添加到廣泛范圍的食品中。
此外，本發(fā)明的乳酸桿菌菌株能夠以諸如酸奶等發(fā)酵食品的方式攝取。通過例如將本發(fā)明的乳酸桿菌菌株和作為酸奶生產(chǎn)發(fā)酵細菌的制酪業(yè)乳酸桿菌諸如嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)，瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)，嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和乳鏈球菌(Streptococcus lactis)一起接種到諸如牛奶和羊奶等發(fā)酵原料中，并在發(fā)酵原料中將各種細菌混合培養(yǎng)或者單獨培養(yǎng)后混合培養(yǎng)物，從而來制備這些發(fā)酵食品。
為了尋找對本發(fā)明的乳酸桿菌菌株顯示輔助或協(xié)同效應的物質(zhì)從而增強本發(fā)明乳酸桿菌菌株的效果，本發(fā)明發(fā)明人用齲齒作為指標研究了含有寡聚糖或者糖醇和本發(fā)明乳酸桿菌菌株的組合物的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當糖醇赤蘚糖醇和本發(fā)明的乳酸桿菌菌株一起使用時，和各種物質(zhì)單獨的抗齲齒效果比較表現(xiàn)出抑制不溶解葡聚糖產(chǎn)生的協(xié)同效應(見試驗實施例4)。
人們廣泛了解糖醇(木糖醇，麥芽糖醇，山梨醇，赤蘚糖醇等)和寡聚糖(果糖寡聚糖，木糖寡聚糖，蔗果三糖，棉子糖等)對齲齒有效。然而，然而這些糖醇和寡聚糖和乳酸桿菌菌株提供的協(xié)同效應或者輔助效應依賴于選擇的乳酸桿菌菌株而有極大差異。
這些有益的糖醇和寡聚糖能分別被單獨使用或者以組合物形式用于本發(fā)明含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品中。這些糖醇和寡聚糖能夠起賦形劑或者甜味劑的作用。這些糖醇和寡聚糖的類型和混合比例沒有特別限制，任意糖醇或者寡聚糖能夠以任意比例使用。例如，就糖味片劑來說通過合適地選擇片劑組成，諸如糖味片劑的壓縮壓力和硬度等條件并使用傳統(tǒng)的片劑制造技術(shù)能夠很容易地制備含有任意比例任意糖醇或者寡聚糖的產(chǎn)品。
本發(fā)明將參考下述實施例和試驗實施例進行更具體地說明。然而，本發(fā)明不受這些實施例限制。
試驗實施例1篩選適于抑制口腔內(nèi)病原細菌的乳酸桿菌菌株(乳酸桿菌屬)(1)測定增殖特性的試驗將顯示于表1中的30株屬于乳酸桿菌屬的乳酸桿菌分別以1×107CFU/毫升(菌落形成單位/毫升)的量接種到MRS肉湯(Difico)中，37℃在無氧條件下培養(yǎng)6小時，然后使用瓊脂平板法對有活力的細菌進行計數(shù)。
即1毫升的各個菌株的培養(yǎng)物肉湯在培養(yǎng)6小時后用無氧稀釋緩沖液(4.5克/升KH2PO4，6.0克/升Na2HPO4，0.5克/升的鹽酸半胱氨酸，0.5克/升的瓊脂，0.5克/升的吐溫80)進行系列稀釋，將0.1毫升的各種稀釋液接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基(向MRS肉湯(Difico)中加入1.5％瓊脂的瓊脂平板)上并在無氧條件下在37℃培養(yǎng)48小時。然后對菌落數(shù)進行計數(shù)并乘以稀釋倍數(shù)得到有活力細菌的數(shù)目。結(jié)果顯示于表1。
(2)對主要牙周疾病致病細菌牙齦卟啉單胞菌JCM 8525菌株抑制活性的試驗牙齦卟啉單胞菌JCM 8525菌株單獨(細胞數(shù)1×106CFU/毫升)(對照)或者它們分別和表1中顯示的30株乳酸桿菌(細胞數(shù)1×106CFU/毫升)的混合物接種到10毫升由GAM(Nissui)肉湯組成含有0.7％葡萄糖的液體培養(yǎng)基中。細胞在無氧條件下在37℃培養(yǎng)12小時后，使用瓊脂平板法對各個培養(yǎng)物肉湯中的牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)進行計數(shù)，得到由含有乳酸桿菌屬細菌的混合培養(yǎng)物獲得的有活力牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目，相對于由單獨培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌獲得的有活力牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目(對照，100％)的比例。
為了使用瓊脂平板法對牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目計數(shù)，通過使用由含有10微克/毫升慶大霉素的EG瓊脂培養(yǎng)基(Nissui)組成的EG-CM培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)基令只有牙齦卟啉單胞菌細胞生長，然后對細菌數(shù)目進行計數(shù)。即取1毫升的牙齦卟啉單胞菌單獨培養(yǎng)或者和各個乳酸桿菌菌株混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物肉湯，用上述的無氧稀釋緩沖液進行系列稀釋，將0.1毫升的各種稀釋液用Conradi棒涂布到上述的EG-CM瓊脂平板上并在無氧條件下在37℃培養(yǎng)48到72小時。然后對獲得的菌落數(shù)進行計數(shù)并乘以稀釋倍數(shù)得到有活力細菌的數(shù)目。
含有乳酸桿菌屬細菌的混合培養(yǎng)物獲得的有活力牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目，相對于單獨培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌獲得的有活力牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目(對照，100％)的比例，被視作牙齦卟啉單胞菌的生存率，生存率根據(jù)下述公式計算。牙齦卟啉單胞菌生存率的結(jié)果顯示于表1。據(jù)此用由對照的生存率(100％)減去牙齦卟啉單胞菌的生存率(％)獲得的值(％)來表示乳酸桿菌屬細菌對牙齦卟啉單胞菌的抑制率。
生存率＝(牙齦卟啉單胞菌混合培養(yǎng)物中的細胞數(shù))/(牙齦卟啉單胞菌單獨培養(yǎng)物中的細胞數(shù))×100(3)主要齲齒致病細菌變異鏈球菌MT 8148菌株和不溶解葡萄糖產(chǎn)生的抑制試驗將5毫升體積的包含含有0.7％葡萄糖和3％蔗糖GAM肉湯(Nissui)的液體培養(yǎng)基裝入離心樣品收集管中，用變異鏈球菌MT 8148菌株單獨(細胞數(shù)1×106CFU/毫升)(對照)或者它們分別和表1中顯示的30株乳酸桿菌(細胞數(shù)1×106CFU/毫升)的混合物接種。細菌在無氧條件下在37℃培養(yǎng)24小時后，使用瓊脂平板法對各個培養(yǎng)物肉湯中有活力的變異鏈球菌細胞數(shù)進行計數(shù)，得到含有乳酸桿菌屬細菌的混合培養(yǎng)物獲得的有活力變異鏈球菌細胞數(shù)目，相對于單獨培養(yǎng)變異鏈球菌獲得的有活力變異鏈球菌細胞數(shù)目(對照，100％)的比例。
為了使用瓊脂平板法對變異鏈球菌細胞數(shù)目計數(shù)，通過用TCYSB瓊脂培養(yǎng)基(40克/升胰蛋白胨大豆瓊脂(BBL)，0.3克/升半胱氨酸，5克/升酵母提取物，200克/升蔗糖，5克/升瓊脂，10單位/毫升桿菌肽)作為篩選培養(yǎng)基使得只有變異鏈球菌細胞生長，然后對細菌數(shù)目進行計數(shù)。即取1毫升的各種上述培養(yǎng)物肉湯，用上述的無氧稀釋緩沖液進行系列稀釋，將0.1毫升的各種稀釋液涂布到上述選擇培養(yǎng)基平板上并在無氧條件下在37℃培養(yǎng)72小時。然后對產(chǎn)生的菌落進行計數(shù)并乘以稀釋倍數(shù)得到有活力的細菌數(shù)目。
含有乳酸桿菌屬細菌的混合培養(yǎng)物獲得的有活力變異鏈球菌細胞數(shù)目，相對于單獨培養(yǎng)變異鏈球菌獲得的有活力變異鏈球菌細胞數(shù)目(對照，100％)的比例，被看作變異鏈球菌的生存率，生存率根據(jù)和上述(2)同樣的方法計算。變異鏈球菌生存率的結(jié)果顯示于表1。據(jù)此用由對照的生存率(100％)減去變異鏈球菌的生存率(％)獲得的值(％)來表示乳酸桿菌屬細菌對變異鏈球菌的抑制率。
此外，為測量不溶解葡聚糖，用刮鏟充分地鏟刮這些含有上述培養(yǎng)物肉湯有不溶解葡聚糖附著的樣品收集管，將培養(yǎng)物肉湯3,000rpm離心15分鐘以收集沉淀物。用PBS(磷酸鹽緩沖溶液)清洗沉淀物兩次，添加5毫升的PBS以獲得測量樣品。用酚/硫酸法對不溶解葡聚糖進行定量(Reiko Takahashi，生物化學實驗方法，23卷，附錄，研究糖的方法，蛋白質(zhì)和糖鏈)。獲得由和每種乳酸桿菌屬細菌的混合培養(yǎng)物得到的不溶解葡聚糖量相對于由單獨變異鏈球菌培養(yǎng)物得到的不溶解葡聚糖量的比例(產(chǎn)生不溶解葡聚糖的比例(％))，這些結(jié)果顯示于表1。據(jù)此，用由變異鏈球菌產(chǎn)生的不溶解葡聚糖的產(chǎn)率減去由對照產(chǎn)生的不溶解葡聚糖的比率(100％)獲得的值(％)來表示乳酸桿菌屬細菌對變異鏈球菌產(chǎn)生不溶解葡聚糖的抑制率(％)。
表1各種乳酸桿菌屬的產(chǎn)乳酸桿菌的增殖特性，對牙齦卟啉單胞菌JCM 8525菌株和變異鏈球菌MT 8148菌株(體外)抑制效果和抑制不溶解葡聚糖產(chǎn)生的效果


*對照被作為100％，是各種通過單獨培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌和變異鏈球菌得到的細胞數(shù)目。
從表1顯示的結(jié)果可以清楚地知道，在30株乳酸桿菌屬的細菌中，顯示出最好的增殖特性，最強烈地抑制牙周疾病致病細菌牙齦卟啉單胞菌和致齲齒細菌變異鏈球菌的繁殖，使其產(chǎn)生最少量不溶解葡聚糖的優(yōu)良菌株是26號唾液乳酸桿菌TI 2711菌株。
試驗實施例2唾液乳酸桿菌TI 2711菌株在無菌小鼠口腔中對牙齦卟啉單胞菌(牙周疾病致病細菌)和變異鏈球菌(致齲齒細菌)的體內(nèi)抑制效果
(1)試驗方法實驗1將4周大的無菌BALB/C小鼠分成對照組(感染后非給藥組，n＝10)和牙周疾病致病細菌感染后給藥組(n＝10)。將1×109CFU/0.5毫升的牙周疾病致病細菌牙齦卟啉單胞菌JCM 8525分別接種到感染后給藥組和對照組小鼠的口腔，連續(xù)三天，總共三次。然后在感染確立一周后，再將本發(fā)明的乳酸桿菌菌株唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(細胞數(shù)1×109CFU/0.5毫升)同樣給予感染后給藥組，連續(xù)三天，總共三次。
此后，在1周，2周和4周后分別用飽含無菌稀釋緩沖液的無菌棉拭充分地擦拭各個感染小鼠口腔內(nèi)部以收集口腔的全部唾液，對唾液中含有的牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目進行計數(shù)。以和試驗實施例1，(2)中的同樣方法對牙齦卟啉單胞菌細胞數(shù)目進行計數(shù)。
實驗2將4周大的無菌BALB/C小鼠分成對照組(感染后非給藥組，n＝10)和致齲齒細菌感染后給藥組(n＝10)。將1×109CFU/0.5毫升的致齲齒細菌變異鏈球菌MT 8148分別接種到感染后給藥組和對照組小鼠的口腔，連續(xù)三天，總共三次。然后在感染確立一周后，再將本發(fā)明的乳酸桿菌菌株唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(細胞數(shù)1×109CFU/0.5毫升)同樣給予感染后給藥組，連續(xù)三天，總共三次。
此后，在1周，2周和4周后分別用飽含無菌稀釋緩沖液的無菌棉拭充分地擦拭各個感染小鼠口腔內(nèi)部以收集口腔的全部唾液，對唾液中含有的變異鏈球菌細胞數(shù)目進行計數(shù)。以和試驗實施例1，(3)中的同樣方法對變異鏈球菌細胞數(shù)目進行計數(shù)。
如上所述的實驗1和2體內(nèi)實驗方案的要點顯示于圖10中。另外，實驗1和2的結(jié)果顯示于圖1和圖2中。
(試驗結(jié)果)實驗1的結(jié)果清楚地顯示于圖1中，比較本發(fā)明的乳酸桿菌菌株唾液乳酸桿菌TI 2711菌株對無菌BALB/C小鼠給藥前后牙周疾病致病細菌牙齦卟啉單胞菌的細菌數(shù)，牙齦卟啉單胞菌的細菌數(shù)給藥后明顯減少，基于Wilcoxon法在顯著性檢驗中具有P＜0.001的顯著差異。
從顯示于附圖2的實驗2的結(jié)果可以清楚地看出，當用本發(fā)明的乳酸桿菌菌株唾液乳酸桿菌TI 2711菌株對無菌小鼠(BALB/C)給藥4周時，研究了致齲齒細菌變異鏈球菌MT 8148菌株細胞數(shù)目的變化，結(jié)果顯示細菌數(shù)給藥4周后和給藥前比較已經(jīng)明顯減少，甚至在第4周后細胞數(shù)目仍繼續(xù)減少并具有統(tǒng)計顯著性(P＜0.001)。
試驗實施例3臨床試驗程序根據(jù)下述程序在書面知情同意的情況下對57名健康志愿者進行了臨床試驗。
制備每片含有140毫克(細菌數(shù)1×108CFU/毫升)本發(fā)明的乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株凍干細胞粉末的糖味片劑，并令各個志愿者在飯間服用，每次5片每天5次，即每天總共25片。各個志愿者在總共兩個月的服用期每天服用片劑，收集唾液，測量口臭并進行醫(yī)生問訊。
在服用前進行第1次檢查，收集唾液，測量口臭(口氣分析儀C21，由美國Interscan公司制造)并進行醫(yī)生問訊。在服用4周后同樣進行第2次檢查，在服用8周后進行第3次最終檢查。
這個試驗實施例中的臨床試驗程序要點顯示于圖11。
(a)對唾液中細胞數(shù)目進行計數(shù)的方法向100微升體積從每個健康志愿者(n＝57)收集的唾液中加入900微升無菌無氧稀釋緩沖液(見試驗實施例1，(1))得到貯存溶液(×1倍溶液)，將此溶液系列稀釋得到×3，×5和×6倍稀釋溶液。定量0.1毫升體積的每種稀釋溶液，用Conradi棒涂布并鋪展在預先制備的如下所示選擇培養(yǎng)基的瓊脂平板培養(yǎng)基上。此后，在無氧條件下在37℃培養(yǎng)72小時，對出現(xiàn)菌落數(shù)進行計數(shù)得到總細菌數(shù)目，乳酸桿菌數(shù)目，致牙周疾病細菌數(shù)目和致齲齒細菌組的細菌數(shù)目。然后挑取一接種環(huán)各個菌落并進行革蘭氏染色，在顯微鏡下確證結(jié)果。
選擇培養(yǎng)基總細菌數(shù)目BL瓊脂培養(yǎng)基和EG瓊脂培養(yǎng)基乳酸桿菌改良的LBS瓊脂培養(yǎng)基致牙周疾病細菌(BPAR＝革蘭氏陰性黑色-著色厭氧桿菌)EG-GM瓊脂培養(yǎng)基，BL瓊脂培養(yǎng)基致齲齒細菌組細菌(變異鏈球菌，茸毛鏈球菌)TCYSB瓊脂培養(yǎng)基(b)不溶解葡聚糖的定量測定使用酚/硫酸法。
(c)口臭的測量使用口氣分析儀C21(由美國Interscan公司制造)，且測定溫度20℃(d)pH值的測定小型pH計(Horiba Seisakusho公司制造)(試驗結(jié)果)(1)口腔總細菌數(shù)得到的總細菌數(shù)結(jié)果顯示于圖3中。如圖3所示，服用糖味片劑之前和服用4周后人口腔細菌總數(shù)目沒有顯著差異。
(2)口腔牙周疾病致病細菌數(shù)目的變化(BPAR＝革蘭氏陰性黑色-著色厭氧桿菌)得到的口腔牙周疾病致病細菌數(shù)目顯示于圖4中。如圖4所示，服用前8人顯示出細胞數(shù)低于檢測極限，平均值為106.6±1.3CFU/總唾液，而在服用4周后，具有細胞數(shù)目低于檢測極限的人的數(shù)目顯著增加為30，而平均值為105.3±1.6CFU/總唾液(P＜0.0001)。因此，服用乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株顯示出能消除和抑制病原細菌即致齲齒細菌。
(3)口腔致齲齒細菌數(shù)目的變化(革蘭氏陽性變異鏈球菌)齲齒細菌組細胞數(shù)目得到的結(jié)果顯示于圖5。如圖5所示，服用前后唾液中變異鏈球菌細胞數(shù)目沒有表現(xiàn)出顯著差異。
(4)口腔乳酸桿菌數(shù)目的變化口腔乳酸桿菌細胞數(shù)目得到的結(jié)果顯示于圖6。如圖6所示，服用前后口腔乳酸桿菌細胞數(shù)目沒有表現(xiàn)出顯著差異。
(5)唾液pH值的變化唾液pH值變化的測量結(jié)果顯示于圖7。在服用前，57人顯示出pH值的顯著分布(pH值偏差度)，平均值為pH 7.0±0.7。然而在服用4周后，觀察到pH值的分布范圍減小，平均值變?yōu)閜H 7.0±0.2，即大約和血液相同的pH值。即顯示出唾液pH值保持在正常水平。服用8周后也觀察到這一現(xiàn)象，pH值保持在正常水平，分布范圍更小。這些結(jié)果構(gòu)成的數(shù)據(jù)完全消除了對給予乳酸桿菌后會促進乳酸產(chǎn)生而增進齲齒發(fā)展的懷疑。因此這些結(jié)果具有非常重要的臨床意義。
(6)唾液中產(chǎn)生的不溶解葡聚糖量的變化唾液中產(chǎn)生的不溶解葡聚糖量的測量結(jié)果顯示于圖8。如圖8所示，服用前唾液中不溶解葡聚糖的量平均為9.9±6.0毫克/總唾液，然而，在服用4周后，平均值變?yōu)?.6±5.8毫克/總唾液(P＜0.05)。因此可以看出統(tǒng)計學的顯著性差異。此外，在8周后，平均值變?yōu)?.4±2.2毫克/總唾液(P＜0.001)，因此可以看出服用乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株的劑量反應相關(guān)性。這構(gòu)成由此臨床試驗確立的作為本發(fā)明乳酸桿菌菌株有效性的部分證據(jù)。即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的乳酸桿菌菌株能夠防止作為牙菌斑主要物質(zhì)的不溶解葡聚糖的產(chǎn)生，根除厭氧的牙周疾病致病細菌和致齲齒細菌棲居部位，因此可能是抑制諸如齲齒和牙周疾病等臨床感染性疾病發(fā)展、復發(fā)和惡化的手段。此外，強烈暗示長期服用乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株可使唾液pH值處于如上所述的正常水平并使牙菌斑難以形成，因此能夠抑制口腔細菌在牙菌斑內(nèi)部產(chǎn)生酸，可用于預防齲齒和牙周疾病和治療發(fā)病較輕的病例。
(7)使用口氣分析儀測量口臭的結(jié)果為測量口臭，使用口氣分析儀測量健康志愿者呼出的揮發(fā)性硫化物。產(chǎn)生口臭的一個主要原因是牙周疾病致病細菌降解蛋白質(zhì)。即，既然牙周疾病致病細菌具有明顯高的蛋白酶活性，它們很容易降解口腔內(nèi)構(gòu)成細菌主要營養(yǎng)來源的食品碎屑中的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生導致口臭的物質(zhì)，即諸如硫醇和硫化物(包括H2S和CH3SH)等揮發(fā)性硫化合物(VSC)。
使用口氣分析儀在室溫(20℃)測量在服用含有本發(fā)明乳酸桿菌菌株的糖味片劑前57個健康志愿者呼出的揮發(fā)性硫化物量，在服用后對20個志愿者的繼續(xù)測量顯示出較服用前有65ppb(ppb＝十億分之一)或者更大的RU值(反應單位)。結(jié)果顯示于圖9。
如圖9所示，這20個志愿者口臭的RU值在服用前處于164±96ppb(平均值±標準方差)的范圍內(nèi)，但是在服用后，該值減小為94±21ppb，可看出統(tǒng)計學上非常顯著的差異(P＜0.005)。
此外，在8周后測量，RU值減小為90±21ppb，有13個正常的志愿者顯示出65ppb或者更小的值(P＜0.001)而沒有口臭。
即基于服用前具有口臭的志愿者數(shù)目，被看作是100％，該數(shù)目在服用4周后減小到52％，而在服用8周后更減少到38％。
這些結(jié)果充分地顯示出劑量反應相關(guān)性，其表明了長期服用本發(fā)明的乳酸桿菌菌株能夠消除口臭。
另外，本發(fā)明的乳酸桿菌菌株唾液乳酸桿菌TI 2711菌株抑制牙周疾病致病細菌的事實和抑制口臭產(chǎn)生的事實顯示出良好的相關(guān)性。
57個志愿者的醫(yī)生詢問的結(jié)果，在所有病例中沒有發(fā)現(xiàn)腹部癥狀。
試驗實施例4添加不同的寡聚糖和糖醇和接種唾液乳酸桿菌TI 2711菌株對抑制變異鏈球菌不溶解葡聚糖產(chǎn)生(體外)的效果。
試驗方法將5％的木糖醇，赤蘚糖醇和山梨醇等糖醇，和果糖-寡聚糖和蔗果三糖等寡聚糖分別加到含有GAM肉湯(Nissui)作為基本培養(yǎng)基以及含有0.7％葡萄糖和0.3％蔗糖的液體培養(yǎng)基中，將1×107CFU/毫升的變異鏈球菌MT 8148菌株分別接種到各個培養(yǎng)基中。然后含氧的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24小時。
另一方面，將1×107CFU/毫升的變異鏈球菌MT 8148菌株接種到上述分別含有5％糖醇或者寡聚糖的培養(yǎng)基中，再將1×107CFU/毫升的乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株接種到培養(yǎng)基中。然后，同樣將含氧的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)結(jié)束后，測定兩種類型培養(yǎng)物的變異鏈球菌MT 8148菌株細胞數(shù)和不溶解葡聚糖的量(根<p>這些制劑的OSCAR分析在下傳感器給出相對低的透射光值，表明為穩(wěn)定懸浮液，具有較低的絮凝特性。初始評價表明具有0.3％PEG 1000的0.001％w/w PVP顯示最佳的懸浮特性。
進一步評價具有0.3％w/w恒定濃度PEG 1000的多個PVP K25濃度的制劑OSCAR、Turbiscan以及照相方法用來評價這些制劑。OSCAR和Turbiscan技術(shù)前面已經(jīng)描述。分析各種PVP濃度的樣品以測定懸浮穩(wěn)定性隨時間的變化。
照相分析對于照相分析，將樣品配制在PET瓶中，并用暗背景隨時間進行數(shù)碼照相。這些照片(其中一些在這里顯示)顯示了隨時間變化的懸浮特性，并且很容易比較各種濃度PVP的有效性。PVP的濃度在0.0001～0.05％w/w之間變化。照片從左至右，PVP的濃度如下

制劑的數(shù)字照片顯示分散度隨時間的變化圖9、10和11顯示具有各種PVP K25濃度以及0.3％PEG 1000的布地奈德160μg/噴射、福莫特羅4.5μg/噴射的制劑在0、15、30、和60秒放置時間的分散度。
圖12、13和14顯示具有各種PVP K25濃度和0.3％PEG 1000的布地奈德80μg/噴射福莫特羅4.5μg/噴射的制劑在0、30和60秒放置時間的分散度。
懸浮液分散度隨時間的變化表(所有樣品)在0、15、30、60、90秒以及2、5和10分鐘對所有的劑量(320μg/4.5μg～40μg/4.5μg)的制劑進行照相。由于得到許多照片，這里繪制了圖表來表示分散度隨時間的變化。
實施例2藥用活細菌制劑(片劑)的制備根據(jù)第12次修定的日本藥典指南，用于藥物制劑的總則，“片劑”的規(guī)定，將2克在實施例1中制備的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株干燥細胞粉末(細胞數(shù)5×109CFU/克)，161克的乳糖(JapanesePharmacopoeia)，116克淀粉(Japanese Pharmacopoeia)20克的粘合劑聚乙烯基吡咯烷酮(Japanese Pharmacopoeia)和作為潤滑劑的0.8克硬脂酸鎂(Japanese Pharmacopoeia)加到一起并均勻混合，用片劑制造設(shè)備將混合物壓縮成模以得到290克的普通藥片(每片300毫克)。
實施例3含有乳酸桿菌的食品的制備(糖味片劑)參考第12次修定的日本藥典指南，用于藥物制劑的總則，“片劑”的規(guī)定，將0.7克在實施例1中制備的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株干燥細胞粉末(細胞數(shù)5×109CFU/克)，47克赤蘚糖醇，47克山梨醇，2.5克1-薄荷醇，1.5克調(diào)味劑(酸橙)和作為潤滑劑的1.3克在日本規(guī)定為食品添加劑的脂肪酸糖酯，加到一起并均勻混合，用片劑制造設(shè)備將混合物壓縮成模以得到95克的普通藥片(每片300毫克)。
實施例4含有乳酸桿菌的食品(口香糖)的制備將0.7克量的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株干燥細胞粉末(細胞數(shù)5×109CFU/克)，160克赤蘚糖醇，160克山梨醇，20克作為調(diào)味劑的薄荷油和150克膠基(食品添加劑)預先稱重。使用揉面團機將膠基充分揉和以生產(chǎn)口香糖，在膠基揉和時依次部分加入預先制備的作為甜味劑的赤蘚糖醇和山梨醇的均勻混合物，和唾液乳酸桿菌TI 2711菌株干燥細胞粉末，均勻揉和，最后加入作為調(diào)味劑的薄荷油并均勻揉和。在揉和結(jié)束后，從揉面團機中移去一定量的口香糖并使用滾軋機滾軋，以制備具有3毫米厚度的口香糖片?？谙闾瞧诤銣厥抑嘘惢?天，切成一定大小的銷售的口香糖片以制備口香糖。
實施例5含有乳酸桿菌的食品(發(fā)酵牛奶)的制備使用發(fā)酵細菌嗜酸乳酸桿菌和唾液乳酸桿菌TI 2711菌株混合培養(yǎng)物制備將發(fā)酵牛奶的發(fā)酵細菌嗜酸乳酸桿菌接種到含有23克脫脂牛奶，1.0克酵母提取物，0.06克抗壞血酸的減脫脂培養(yǎng)基中，在37℃靜置培養(yǎng)16小時以獲得大量的發(fā)酵劑。
將實施例1中獲得的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株培養(yǎng)物肉湯和如上制備的大量發(fā)酵劑培養(yǎng)物肉湯各以5％的量接種到含有新鮮牛奶和脫脂牛奶的原材料混合物中，在37℃培養(yǎng)16小時以獲得發(fā)酵牛奶。用本發(fā)明的菌株制備的發(fā)酵牛奶顯示出優(yōu)良的氣味和味道，且是被高度接受的產(chǎn)品。
工業(yè)實用性用本發(fā)明的唾液乳酸桿菌TI 2711菌株，使用無菌小鼠進行體外試驗的結(jié)果，以及長期臨床試驗的結(jié)果(n＝57)表明，在所有這些試驗中證實了該菌株對于口腔微生物群落正常化，抑制牙周疾病致病細菌和致齲齒細菌和防治口臭產(chǎn)生的效果。
即通過服用或者攝取本發(fā)明的菌株，口腔微生物群落能夠正?；?，結(jié)果牙周疾病致病細菌和致齲齒細菌能夠被抑制，而因此口臭的產(chǎn)生能夠被抑制。因此，本發(fā)明的菌株可用作含有乳酸桿菌的活細菌制品或者食品的成分，以用來保持唾液的pH值在生理正常的水平，預防和治療牙齦炎、牙周炎和牙周疾病，預防和治療齲齒，預防口臭的產(chǎn)生并消除口臭。
權(quán)利要求
1.一種含有乳酸桿菌用于使口腔內(nèi)微生物群落正常化的活細菌制劑或者食品，其含有作為活性成分的乳酸桿菌唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)。
2.一種含有乳酸桿菌用于預防和治療牙齦炎、牙周炎和牙周疾病的活細菌制劑或者食品，其含有作為活性成分的乳酸桿菌唾液乳酸桿菌。
3.一種含有乳酸桿菌用于預防或者治療齲齒的活細菌制劑或者食品，其含有作為活性成分的乳酸桿菌唾液乳酸桿菌。
4.一種含有乳酸桿菌用于防止口臭產(chǎn)生和消除口臭的活細菌制劑或者食品，其含有作為活性成分的乳酸桿菌唾液乳酸桿菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項的含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品，其中乳酸桿菌是唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)。
6.一種乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)。
7.一種由乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)純培養(yǎng)獲得的細胞。
8.一種通過干燥乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERMBP-7974)的細胞獲得的干細胞。
9.乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)在制備含有乳酸桿菌的活細菌制劑或食品中的應用。
10.一種含有乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI 2711菌株(FERM BP-7974)，以及具有不同于該菌株作用機制的活性成分的組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物，其含有乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI2711菌株(FERM BP-7974)，以及選自糖醇和寡聚糖的物質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其含有乳酸桿菌唾液乳酸桿菌TI2711菌株(FERM BP-7974)，以及赤蘚糖醇。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有乳酸桿菌，唾液乳酸桿菌作為活性成分的活細菌制劑或者食品。提供了含有乳酸桿菌的活細菌制劑或者食品，其中乳酸桿菌通過使口腔內(nèi)微生物群落正常化，能夠防止由牙周疾病致病細菌和致齲齒細菌導致的牙周疾病和/或齲齒的發(fā)生、復發(fā)和惡化，能夠防止口臭產(chǎn)生和保持唾液的pH值在生理正常的水平。
文檔編號C12R1/225GK1625345SQ0282869
公開日2005年6月8日 申請日期2002年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者古賀泰裕 申請人:富朗泰國際股份有限公司