專利名稱：一步誘導(dǎo)棗葉片體細(xì)胞胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種一步誘導(dǎo)棗葉片體細(xì)胞胚胎的方法。
技術(shù)背景植物體細(xì)胞胚發(fā)生是指體細(xì)胞或生殖細(xì)胞在特定條件下，未經(jīng)性細(xì)胞融合而通過與合子 胚發(fā)生相類似的途徑發(fā)育成新個體的形態(tài)發(fā)生過程。由于它是從體細(xì)胞分化而來，故稱為體 細(xì)胞胚胎或胚狀體。對體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)制的探討源于1902年Haberlandt提出的植物細(xì)胞全 能性假說，對體細(xì)胞胚胎的真正認(rèn)識是從1958年Steward等利用胡蘿卜根進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培 養(yǎng)，產(chǎn)生與合子胚相似的結(jié)構(gòu)，并長成完整植株開始的。通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑形成再生 植株在高等植物中己經(jīng)證明是普遍的現(xiàn)象，國內(nèi)外在裸子植物、雙子葉植物、單子葉植物重 要科的代表植物中多有報道，己有300多種植物獲得過體細(xì)胞胚胎。目前，大部分研究資料 來源于草本植物，在部分木本植物上也有報道，如針葉樹、樺樹等。在果樹上已有28科，43 屬，93種(雜種)獲得了體細(xì)胞胚。關(guān)于棗體細(xì)胞胚胎途徑誘導(dǎo)再生植株的報道較少，且多以幼胚或子葉為外植體。如最早 陳維倫等利用酸棗幼胚的子葉獲得胚狀體，以后李登科等，程佑發(fā)等，郝建平等也是利用幼 胚和子葉為外植體獲得胚狀體。到目前為止，以棗離體葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)均以不定芽方 式再生，通過體細(xì)胞胚胎途徑還未見報道。本研究旨在以冬棗離體葉片為外植體進(jìn)行體細(xì)胞 胚胎誘導(dǎo)，為建立高效穩(wěn)定的葉片體細(xì)胞胚發(fā)生系統(tǒng)奠定堅實(shí)基礎(chǔ)，這對于利用葉片進(jìn)行基 因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良等方面的研究都具有十分重要的意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明建立了棗離體葉片體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)技術(shù)體系，能保證高效率的獲得冬棗葉片的體 細(xì)胞胚胎，為深入開展棗的基因工程、遺傳轉(zhuǎn)化、品種改良等方面的研究提供了一種新的技 術(shù)平臺。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是首先采用合適的離體葉片剪切方法，再對 外植體進(jìn)行體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)，通過不同培養(yǎng)基成分、不同植物生長調(diào)節(jié)劑、不同培養(yǎng)環(huán)境 的調(diào)控，篩選出冬棗葉片體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，獲得冬麥離體葉片體細(xì)胞胚胎。本發(fā)明的具體內(nèi)容，即離體誘導(dǎo)冬棗葉片體細(xì)胞胚胎的方法如下外植體選擇與預(yù)處理選取苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，接種在MS+麥芽糖15 25 g/L+瓊月旨3 5 g/L+TDZ 5.0~10.0 mg/L+AgNO31.0~2.0 mg/L的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH值控制在5.0 6.0左右，環(huán)境溫度在25 3(TC條件下，能夠誘導(dǎo)出葉片體細(xì)胞胚胎。培養(yǎng)條件基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，麥芽糖1.5-2.5%,瓊脂0.3%~0.5%，培養(yǎng)基滅菌 前pH為5.0 6.0。黑暗環(huán)境，溫度控制在25 30。C。外植體接種方法選取生長健壯、苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，用已滅菌剪刀垂 直葉脈剪切數(shù)刀，然后正面向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。誘導(dǎo)培養(yǎng)將剪切好的葉片接種到MS +麥芽糖15~25g/L +瓊脂3.0~5.0 g/L+TDZ 5.0~10.0 mg/L + AgN031.0-2.0 mg/L的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)。誘導(dǎo)15-20天時產(chǎn)生大量淡黃色塊 狀的愈傷組織，誘導(dǎo)20-30天時開始從塊狀愈傷組織表面逐漸突起成瘤狀，分化出胚狀體。本發(fā)明專利的有益效果是，通過對冬棗葉片外植體適宜的剪切方法，然后接種到誘導(dǎo)培 養(yǎng)基上，不經(jīng)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基即可獲得冬棗葉片體細(xì)胞胚胎，首次實(shí)現(xiàn)了棗離體葉片的體細(xì)胞胚 胎再生，并在棗葉片體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，將非胚性愈傷誘導(dǎo)、胚性愈傷誘導(dǎo)、體胚分化 三個步驟合為一步，即在同一種培養(yǎng)基上實(shí)現(xiàn)了愈傷組織和胚狀體分化，利用此方法不僅簡 化了試驗步驟、不需要多次更換培養(yǎng)基、節(jié)省了人力物力，而且與分步誘導(dǎo)相比縮短了誘導(dǎo) 時間。因此，本研究建立的葉片體胚發(fā)生體系對棗再生體系的研究具有重要指導(dǎo)意義。


圖1是冬棗葉片初始接種狀態(tài)。圖2是冬棗葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)15~20天時產(chǎn)生淡黃色塊狀的愈傷組織。圖3是冬棗葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)25~35天時從塊狀愈傷組織表面逐漸分化出胚狀體。圖4是冬棗葉片分化出的球形胚。 圖5是冬棗葉片分化出的心形胚。 圖6是冬棗葉片分化出的子葉胚。
具體實(shí)施方式
選取苗齡20天的冬棗組培苗葉片，在無菌操作臺用已滅菌剪刀垂直葉脈剪切數(shù)刀，然后 正面向上接種于接種在MS+麥芽糖15~25 g/L+瓊脂3.0-5.0 g/L+TDZ 5.0-10.0 mg/L+AgN03 1.0~2.0 mg/L的固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)基pH值控制在5.0~6.0左右，環(huán)境溫度 在25 3(TC條件下，誘導(dǎo)15-20天時產(chǎn)生大量淡黃色塊狀的愈傷組織，誘導(dǎo)20-30天時開始 從塊狀愈傷組織表面逐漸突起成瘤狀，分化出胚狀體。分化率為84.9%.
權(quán)利要求
1.一步誘導(dǎo)棗葉片體細(xì)胞胚胎的方法，其特征在于通過對冬棗葉片進(jìn)行離體培養(yǎng)，不經(jīng)過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基即可一步實(shí)現(xiàn)愈傷組織誘導(dǎo)和胚狀體分化。
2. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于包括以下培養(yǎng)步驟(1) 選取生長健壯、苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，在無菌操作臺用己滅菌剪刀 垂直葉脈剪切數(shù)刀。(2) 將經(jīng)步驟(1)獲得的冬棗離體葉片接種在MS +麥芽糖 15~20g/L+TDZ5.0~10.0mg/L+AgNO31.0~2.0mg/L的培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)15-20天時 產(chǎn)生大量透明、淡黃色塊狀的愈傷組織，誘導(dǎo)20-30天時開始從塊狀愈傷組織表面逐漸突 起成瘤狀，逐漸分化出胚狀體。
3. 按照權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于基本培養(yǎng)基為MS、含麥芽糖15~25g/L、 瓊脂3 5g/L、 TDZ5.0~10.0mg/L、 AgNO31.0 2.0mg/L，培養(yǎng)基滅菌前pH為5.5~6.0，培養(yǎng) 溫度控制在25 35。C。
全文摘要
一步誘導(dǎo)棗葉片體細(xì)胞胚胎的方法，即通過冬棗葉片的組織培養(yǎng)獲得其體細(xì)胞胚胎，包括外植體選擇、剪切、離體培養(yǎng)，葉片愈傷組織胚狀體分化率達(dá)84.9％。選取生長健壯、苗齡為15-20天的冬棗組培苗葉片，用已滅菌剪刀垂直葉脈剪切數(shù)刀。然后正面向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+麥芽糖15～25g/L+瓊脂3.0～5.0g/L+TDZ 5.0～10.0mg/L+AgNO₃.0～2.0mg/L)上進(jìn)行暗培養(yǎng)。誘導(dǎo)15-20天時葉片產(chǎn)生大量淡黃色塊狀的愈傷組織，不經(jīng)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基在20-30天時開始從塊狀愈傷組織表面逐漸突起成瘤狀，分化出胚狀體。以上培養(yǎng)基滅菌前pH為5.0～6.0，培養(yǎng)溫度控制在25～30℃。利用該方法，可誘導(dǎo)在20～30天后獲得大量葉片胚狀體，為用于棗葉片的離體再生。
文檔編號A01H4/00GK101248763SQ200810089510
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者麗 代, 劉孟軍, 娜 王, 秦子禹 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)