專利名稱：胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基及喂食細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明，系關(guān)于包含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)所使用之喂食細(xì)胞之培育培養(yǎng)基、利用該培養(yǎng)基之喂食細(xì)胞之制造方法、以及藉此制得之胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞，系來自于囊胚中內(nèi)層細(xì)胞群之未分化細(xì)胞，具有能分化成全部組織之多樣性，而被期待于細(xì)胞培養(yǎng)、組織移植、新藥研究、及基因治療之領(lǐng)域中之應(yīng)用。再者，亦已獲知可由移植成體之體細(xì)胞核所得之復(fù)制胚胎，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞。近年來，將胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入以神經(jīng)組織為首之各種組織之技術(shù)已被報(bào)告出來，由于由胚胎干細(xì)胞所誘導(dǎo)之組織系無免疫排斥之遺傳性上相等之組織，故可期待其于移植醫(yī)療及基因治療之利用。又，亦有報(bào)告指出，胚胎干細(xì)胞之培育對(duì)象由實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物擴(kuò)展至包含人類之靈長(zhǎng)類，如獼猴胚胎干細(xì)胞之分離、由人類體外受精卵之胚胎干細(xì)胞之分離等。
又，末盛等人，由以往臨床試驗(yàn)有用之醫(yī)學(xué)研究中廣泛使用之長(zhǎng)尾猴(Macaca fascicularis)之顯微受精卵，成功地培育出新穎之胚胎干細(xì)胞，且證明其多樣性能長(zhǎng)期維持，并且，亦證明可由該長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)多巴胺神經(jīng)。
上述之含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞，為促進(jìn)其生長(zhǎng)，以往系與喂食細(xì)胞共同培養(yǎng)。特別是，由于若使用血清培養(yǎng)包含人類之靈長(zhǎng)類之胚胎干細(xì)胞，則無法維持未分化狀態(tài)，故探討以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)(參照專利文獻(xiàn)1)。
然而，僅以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)無法維持胚胎干細(xì)胞，而為了代替一部分血清之效果，必須與喂食細(xì)胞共同培養(yǎng)。該喂食細(xì)胞，例如，使用將由鼠之胎兒所調(diào)制出之纖維母細(xì)胞，以排多癌(Mitomycin-C)或放射線照射而使增殖停止之細(xì)胞，故因人類胚胎干細(xì)胞與來自鼠之喂食細(xì)胞之共同培養(yǎng)，而有感染人獸共通感染癥之虞。由于期待由該人類胚胎干細(xì)胞所誘導(dǎo)之組織，能作為移植醫(yī)療及基因治療之材料，故期盼能盡可能的排除獸共通感染癥等之疑慮。
因此，亦有報(bào)告指出，取代鼠之胎兒而以人類胎兒之纖維母細(xì)胞、成人輸卵管上皮細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)1)、來自人類新生兒之包皮之纖維母細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)2、3)、成人表皮纖維母細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)4)、人類骨髓細(xì)胞(非專利文獻(xiàn)5)作為喂食細(xì)胞利用之方法。
然而，此等大致皆系利用初代細(xì)胞，由于為了大量制得胚胎干細(xì)胞而需要來自復(fù)數(shù)供應(yīng)源之材料，故需要花費(fèi)一一檢查每供應(yīng)源之時(shí)間。又，培育此等來自人類之喂食細(xì)胞之培養(yǎng)基，由于使用牛胎兒血清(FBS)等之血清，故亦有由該血清傳播未知之感染源或普恩蛋白(prion)之未知病源體的危險(xiǎn)性。
專利文獻(xiàn)1國(guó)際公開第98/30679號(hào)非專利文獻(xiàn)1Nat.Biotechnol.20933-936(2002)非專利文獻(xiàn)2Biol.Reprod.682150-2156(2003)非專利文獻(xiàn)3Hum.Reprod.181404-1409(2003)非專利文獻(xiàn)4Stem.Cells.21546-556(2003)非專利文獻(xiàn)5Stem.Cells.21131-142(2003)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明之課題，系提供一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(以下，稱為喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基)，系將培養(yǎng)包含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞所使用之喂食細(xì)胞，由特定供體之材料有效率地建立、并能以感染機(jī)會(huì)少之狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)。并且，提供一種與含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)亦較安全之喂食細(xì)胞之制造方法，以及由此方法制得之喂食細(xì)胞。
本發(fā)明人等，為解決上述問題而持續(xù)研究之結(jié)果發(fā)現(xiàn)，于基本培養(yǎng)基中，由至少含有血清白蛋白及胰島素之胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基，可將含有選自由胚胎干細(xì)胞之喂食細(xì)胞所得之胎兒表皮纖維母細(xì)胞、胎兒肌肉纖維母細(xì)胞、胎兒肺纖維母細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、成體表皮纖維母細(xì)胞、成體肺纖維母細(xì)胞、成體上皮細(xì)胞、成體內(nèi)皮細(xì)胞中之至少1種細(xì)胞種源之細(xì)胞集團(tuán)安定地進(jìn)行增殖，而完成本發(fā)明。
亦即，本發(fā)明系以下所述者1.一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基，其含有血清白蛋白、胰島素及基本培養(yǎng)基，該血清白蛋白之量為2g/L～50g/L，該胰島素之量為1mg/L～100mg/L，而該基本培養(yǎng)基系由選自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201及MCDB202中之至少一種所構(gòu)成。
2.如上述1所記載之培養(yǎng)基，其中，進(jìn)一步含有細(xì)胞黏連因子。
3.如上述2所記載之培養(yǎng)基，其中該細(xì)胞黏連因子，系選自膠原(collagen)、明膠(gelatine)、纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白(fibronectin)、粘連蛋白(Vitronectin)、層粘連蛋白(laminin)、聚離胺酸(polylysine)、聚鳥胺酸(polyornithine)、及聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine)中之至少1種。
4.如上述1、2或3所記載之培養(yǎng)基，其中，進(jìn)一步含有細(xì)胞增殖因子。
5.如上述4所記載之培養(yǎng)基，其中，該細(xì)胞增殖因子，系選自纖維母細(xì)胞增殖因子及上皮細(xì)胞增殖因子中之至少一種。
6.一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞之制造方法，其包括培養(yǎng)增殖步驟，將含有選自胎兒表皮纖維母細(xì)胞、胎兒肌肉纖維母細(xì)胞、胎兒肺纖維母細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、成體表皮纖維母細(xì)胞、成體肺纖維母細(xì)胞、成體上皮細(xì)胞、成體內(nèi)皮細(xì)胞中之至少1種細(xì)胞種源之細(xì)胞集團(tuán)，以上述1～5任一項(xiàng)記載之胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增殖；及停止增殖步驟，將該培養(yǎng)增殖之細(xì)胞集團(tuán)，以排多癌或放射線照射而使增殖停止。
7.如上述6所記載之制造方法，其中該培養(yǎng)增殖步驟，系于以細(xì)胞黏連因子涂布之培養(yǎng)容器中進(jìn)行。
8.如上述7所記載之制造方法，其中該細(xì)胞黏連因子，系選自膠原、明膠、纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種。
9.如上述6、7或8所記載之制造方法，于該培養(yǎng)增殖步驟中，使培養(yǎng)細(xì)胞平均細(xì)胞分裂20次以上。
10.一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞，系由上述6～9之任一項(xiàng)記載之制造方法所制得。
藉由本發(fā)明之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基，即使與含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)，亦可建立較安全之喂食細(xì)胞，而能長(zhǎng)期培養(yǎng)。喂食細(xì)胞之材料，由于系來自例如胎兒表皮纖維母細(xì)胞、胎兒肌肉纖維母細(xì)胞、胎兒肺纖維母細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、成體表皮纖維母細(xì)胞、成體肺纖維母細(xì)胞、成體上皮細(xì)胞、成體內(nèi)皮細(xì)胞等特定之供體，故對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)之可能性系有用。藉此，可將含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞與喂食細(xì)胞共同培養(yǎng)，于作為移植或基因治療等材料之胚胎干細(xì)胞使用時(shí)，可提供人畜共通感染癥疑慮少之胚胎干細(xì)胞。


圖1，系顯示以實(shí)施例2所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞之第10天之群落(40倍)之圖。
圖2，系顯示以實(shí)施例2所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞繼代后之第4天之群落(100倍)之圖。
圖3，系顯示以實(shí)施例2所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞之增殖之圖。
圖4，系顯示以實(shí)施例2所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞繼代后之第4天之群落其SSEA-4免疫染色相片(100倍)之圖。
圖5，系顯示以實(shí)施例3所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞之第10天之群落(40倍)之圖。
圖6，系顯示以實(shí)施例3所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞繼代后之第4天之群落(100倍)之圖。
圖7，系顯示以實(shí)施例3所培育之喂食細(xì)胞培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞之增殖之圖。
圖8，系顯示實(shí)施例4中組合涂布明膠與喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)之MRC-5之增殖之圖。記載有培養(yǎng)開始時(shí)之PDL、與以之后繼代培養(yǎng)時(shí)之細(xì)胞數(shù)測(cè)定所算出之培養(yǎng)結(jié)束時(shí)之PDL。
圖9，系顯示實(shí)施例5中組合涂布膠原與喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)之MRC-5之增殖之圖。記載有培養(yǎng)開始時(shí)之PDL、與以之后繼代培養(yǎng)時(shí)之細(xì)胞數(shù)測(cè)定所算出之培養(yǎng)結(jié)束時(shí)之PDL。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所使用之基本培養(yǎng)基，可單獨(dú)使用選自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201、MCDB202，及/或亦可組合復(fù)數(shù)使用，而以利用于纖維母細(xì)胞之無血清培養(yǎng)基之DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB201、MCDB202為佳，而利用于靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞之無血清培養(yǎng)中之DMEM∶Ham F12為1∶1之混合培養(yǎng)基，由培養(yǎng)基之營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、喂食細(xì)胞培育后之與胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)之生存率之觀點(diǎn)考慮則較佳。
再者，本發(fā)明所利用之基本培養(yǎng)基之詳細(xì)組成，系根據(jù)表1所記載之出處。
表1基本培養(yǎng)基之出處


本發(fā)明所使用之喂時(shí)細(xì)胞培育培養(yǎng)基，系含有血清白蛋白及胰島素作為必須成分。該培養(yǎng)基亦可再含有其它成分。然而，其它成分若含有牛胎兒血清(FBS)等未知成分或夾雜物，因感染癥等之疑慮高，故為不宜。
作為其它成分，有該基本培養(yǎng)基中未含有之成分、或該基本培養(yǎng)基中已含有但量不足夠之成分。具體而言，例如，細(xì)胞黏連因子、細(xì)胞增殖因子、運(yùn)鐵蛋白等含有金屬之蛋白質(zhì)、其它之聚及蛋白質(zhì)、胺基酸類、維他命類等。將此等成分配合于基本培養(yǎng)基中，以制造喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基。又，亦可將市售之稱為血清代替物者配合于基本培養(yǎng)基中，來制造喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基。該血清代替物，通常系含有血清白蛋白及胰島素，且含有如上所述之其它成分。因此，可于基本培養(yǎng)基中，將血清代替物以配合目的之量使用適當(dāng)量之血清白蛋白及胰島素。作為血清代替物，例如，于上述專利文獻(xiàn)1所記載血清代替物。
本發(fā)明之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基中，以含有細(xì)胞黏連因子作為其它成分為佳。又，以含有細(xì)胞增殖因子為佳。再者，以含有運(yùn)鐵蛋白等含金屬之蛋白質(zhì)為佳。作為細(xì)胞黏連因子，以選自膠原、明膠、纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種為佳，特別是以膠原、明膠、纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白、粘連蛋白等為更佳。作為細(xì)胞增殖因子，以選自纖維母細(xì)胞增殖因子(FGF)、及上皮細(xì)胞增殖因子(EGF)中之至少1種為佳。
本發(fā)明之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基中，必須含有血清白蛋白2g/L～50g/L及胰島素1mg/L～100mg/L之比例。更佳之血清白蛋白的量為4g/L～25g/L、胰島素的量為5mg/L～30mg/L。
再者，細(xì)胞黏連因子以含有0.3mg/L～50mg/L左右為佳。惟于后述之將細(xì)胞黏連因子涂布于培養(yǎng)容器內(nèi)面使用之場(chǎng)合，于喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基中不一定須配合細(xì)胞黏連因子。細(xì)胞增殖因子，于喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基中，以含有0.01μg/L～100μg/L之比例為佳，特別是含有纖維母細(xì)胞增殖因子0.1μg/L～10μg/L為佳、含有上皮細(xì)胞增殖因子0.5μg/L～50μg/L為佳。運(yùn)鐵蛋白等含有金屬之蛋白質(zhì)，以含有1mg/L～50mg/L之比例為佳。
本發(fā)明之用以建立胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞可使用之細(xì)胞，例如，可選自胎兒表皮纖維母細(xì)胞、胎兒肌肉纖維母細(xì)胞、胎兒肺纖維母細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、成體表皮纖維母細(xì)胞、成體肺纖維母細(xì)胞、成體上皮細(xì)胞、成體內(nèi)皮細(xì)胞中之至少1種。將含有所選擇之細(xì)胞種別之細(xì)胞集團(tuán)，于含有本發(fā)明之喂時(shí)細(xì)胞培育用培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)，以3％～10％之CO2、溫度35℃～40℃之條件下，培養(yǎng)1日～30日，可使其增殖。使上述之細(xì)胞集團(tuán)增殖后，以排多癌或放射線照射使細(xì)胞之增殖停止，藉此制得大量之喂食細(xì)胞。
如上所述，藉由含有細(xì)胞增殖步驟、及增殖停止步驟之制造方法，可于無血清培養(yǎng)下進(jìn)行育成，而制造大致無動(dòng)物感染之安全的胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞。該細(xì)胞增殖步驟，可于細(xì)胞培養(yǎng)容器中事先以細(xì)胞黏連因子涂布。該細(xì)胞增殖步驟中，藉由使培養(yǎng)細(xì)胞平均細(xì)胞分裂20次以上，可大量制造喂食細(xì)胞。
實(shí)施例以下，說明本發(fā)明之實(shí)施例及比較例，但本實(shí)施例系顯示以輔助本發(fā)明之再現(xiàn)為目的之其中一實(shí)施樣態(tài)，并無法以本實(shí)施例作為本發(fā)明之界限或限制事項(xiàng)。又，以下之實(shí)施例等中，喂食細(xì)胞，系使用以含有牛胎兒血清(FBS)增殖之株化人類細(xì)胞。此系由于直接由人體得到人類細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料極為困難，而成為將已提供為研究用之株化人類細(xì)胞使用于實(shí)驗(yàn)之狀況。
實(shí)施例1以添加FBS 10v/v％之MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)至41.77PDL(populationdoubling level，細(xì)胞集團(tuán)倍增值(日本組織培養(yǎng)學(xué)會(huì)編「組織培養(yǎng)之技術(shù)」第3版(基礎(chǔ)編)1996年p42))，將由細(xì)胞庫分讓之人類正常2倍肺纖維母細(xì)胞株(MRC-5)，使用以下之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(A)使細(xì)胞數(shù)懸濁成2.4×106cells，而于涂布明膠之培養(yǎng)皿上，以1次之繼代培養(yǎng)培養(yǎng)至42.99PDL。
喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(A)之組成添加牛血清白蛋白(BSA)5g/L、EGF 10μg/L、胰島素1mg/L、皮質(zhì)醇(hydrocortisone)1mg/L之RITC80-7培養(yǎng)基。
接著，將上述培養(yǎng)之MRC-5，使用含有最終濃度為10μg/mL之排多癌(Mitomycin-C，MMC)之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(A)，培養(yǎng)2～3小時(shí)，使細(xì)胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(A)，將細(xì)胞以磷酸緩沖溶液(PBS)洗凈3次。將洗凈后之細(xì)胞，藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶、1mM EDTA)由培養(yǎng)皿剝離，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果，可制得約5.5×106cells之喂食細(xì)胞。
實(shí)施例2將由與實(shí)施例1相同之細(xì)胞庫分讓之MRC-5，使用以下之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)使細(xì)胞數(shù)懸濁成2.1×105cells，而于涂布明膠之培養(yǎng)皿上，進(jìn)行4次之繼代培養(yǎng)培養(yǎng)至53.47PDL。
接著，將上述培養(yǎng)之MRC-5，使用含有最終濃度為10μg/mL之MMC之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)，培養(yǎng)2～3小時(shí)，使細(xì)胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)，以PBS將細(xì)胞洗凈3次制成喂食細(xì)胞。將該喂食細(xì)胞，于涂布明膠之直徑60mm培養(yǎng)皿上，以每1枚約4×105個(gè)之活細(xì)胞數(shù)接種附著。
喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)之組成添加有含白蛋白83g/L及胰島素100mg/L之血清代替物(Knock outSerum Replacement，印皮多露建公司(專利文獻(xiàn)1))20v/v％、MEM非必須胺基酸溶液(印皮多露建公司)1v/v％、丙酮酸鈉1mmol/L、L-麩酰胺2mmol/L、2-乙基硫醇(mercaptoethanol)0.1mmol/L、EGF 10μg/L、及FGF 1μg/L之DMEM∶Ham＝1∶1之混合培養(yǎng)基。
將冷凍保存之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞解凍后，將以下述之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞用培養(yǎng)基(A)使活細(xì)胞數(shù)懸濁成約2×105cells/ml之濃度后者，接種至已附著前述喂食細(xì)胞之培養(yǎng)皿。于5％CO2、37℃之培養(yǎng)箱內(nèi)，每日進(jìn)行長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞用培養(yǎng)基(A)之交換進(jìn)行培養(yǎng)，至長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞之群落成長(zhǎng)至可繼代培養(yǎng)為止(10天)。
長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞用培養(yǎng)基(A)之組成添加有含白蛋白83g/L及胰島素100mg/L之血清代替物(專利文獻(xiàn)1)20v/v％、MEM非必須胺基酸溶液(印皮多露建公司)1v/v％、丙酮酸鈉1mmol/L、L-麩酰胺2mmol/L、2-乙基硫醇0.1mmol/L之DMEM∶Ham＝1∶1之混合培養(yǎng)基。
將上述培養(yǎng)之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞群落，藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶)由培養(yǎng)皿分離。將部分培養(yǎng)皿中之細(xì)胞再接種至含有新喂食細(xì)胞之培養(yǎng)皿中，之后以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4天，將剩余培養(yǎng)皿中細(xì)胞由培養(yǎng)皿剝離，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。
將繼代之胚胎干細(xì)胞群落培養(yǎng)結(jié)束后，將部分培養(yǎng)皿中之細(xì)胞與上述同樣地由培養(yǎng)皿剝離，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)皿中剩余之細(xì)胞，以4w/v％聚甲醛固定后，以FITC標(biāo)記之SSEA-4抗體(圣克魯斯公司)免疫染色，再以熒光顯微鏡以BP460-490nm、BA515nm進(jìn)行觀察。
其結(jié)果，長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞群落之形態(tài)，繼代時(shí)或培養(yǎng)結(jié)束時(shí)之任一者，皆與以來自鼠胎兒纖維母細(xì)胞之喂食細(xì)胞培養(yǎng)者相等(圖1、圖2)，長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞系已增殖(圖3)。又，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)之免疫染色中，觀察到為靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞標(biāo)志(marker)之一之SSEA-4之熒光(圖4)，故證明系靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞之群落。
藉此，說明了以本發(fā)明方法培育之由MRC-5培養(yǎng)之喂食細(xì)胞，可進(jìn)行胚胎干細(xì)胞之培養(yǎng)。
實(shí)施例3將由與實(shí)施例1相同之細(xì)胞庫分讓之MRC-5，使用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)使細(xì)胞數(shù)懸濁成2.4×106cells，而于涂布明膠之培養(yǎng)皿上，進(jìn)行4次之繼代培養(yǎng)培養(yǎng)至53.68PDL。接著，將上述培養(yǎng)之MRC-5，使用含有最終濃度為10μg/mL之MMC之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)，培養(yǎng)2～3小時(shí)，使細(xì)胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)，以PBS將細(xì)胞洗凈3次制成喂食細(xì)胞。
將該喂食細(xì)胞，于涂布明膠之直徑60mm培養(yǎng)皿上，以每1枚約4×105個(gè)之活細(xì)胞數(shù)接種附著。于已附著前述喂食細(xì)胞之培養(yǎng)皿，將冷凍保存之長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞解凍后，以長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞用培養(yǎng)基(A)使活細(xì)胞數(shù)懸濁成約2×105cells/ml之濃度進(jìn)行接種。于5％CO2、37℃之培養(yǎng)箱內(nèi)，每日進(jìn)行長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞用培養(yǎng)基(A)之交換進(jìn)行培養(yǎng)，至長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞之群落成長(zhǎng)至可繼代培養(yǎng)為止(10天)。藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶)，將胚胎干細(xì)胞群落分離，并將部分培養(yǎng)皿中之細(xì)胞再接種至含有新喂食細(xì)胞之培養(yǎng)皿中，之后以相同條件繼續(xù)培養(yǎng)4天，將剩余之培養(yǎng)皿中細(xì)胞由培養(yǎng)皿剝離，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。
將繼代之胚胎干細(xì)胞群落培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞由培養(yǎng)皿剝離，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果，長(zhǎng)尾猴胚胎干細(xì)胞群落之形態(tài)，繼代時(shí)或培養(yǎng)結(jié)束時(shí)之任一者，皆與以鼠喂食細(xì)胞培養(yǎng)者相等(圖5、圖6)，細(xì)胞系已增殖(圖7)。
藉此，與實(shí)施例2相同，說明了使用涂布明膠之培養(yǎng)皿，則藉由制成之由MRC-5培養(yǎng)之喂食細(xì)胞，可進(jìn)行胚胎干細(xì)胞之培養(yǎng)。
實(shí)施例4將由與實(shí)施例1相同之細(xì)胞庫分讓之MRC-5，使用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)使細(xì)胞數(shù)懸濁成2.1×105cells，而于涂布明膠之培養(yǎng)皿上，反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)至增殖情況變差為止，以無血清培養(yǎng)調(diào)查增殖界限。其結(jié)果，由本發(fā)明培養(yǎng)基之喂食細(xì)胞作成之纖維母細(xì)胞，由41.77PDL起亦可增殖至4次之繼代培養(yǎng)，并確認(rèn)可分裂成約53PDL(圖8)。
藉此，說明了由1種之細(xì)胞株可培育相當(dāng)量之喂食細(xì)胞。
實(shí)施例5將由與實(shí)施例1相同之細(xì)胞庫分讓之MRC-5，使用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)使細(xì)胞數(shù)懸濁成2.1×105cells，而于涂布膠原之培養(yǎng)皿上，反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)至增殖情況變差為止，以無血清培養(yǎng)調(diào)查增殖界限。
其結(jié)果，由本發(fā)明培養(yǎng)基之喂食細(xì)胞所得之纖維母細(xì)胞，由41.77PDL起亦可增殖至7次之繼代培養(yǎng)，并確認(rèn)可將纖維母細(xì)胞分裂成接近有限分裂細(xì)胞之界限之約60PDL(圖9)。
藉此，說明了藉由將本發(fā)明之培養(yǎng)基與涂布膠原組合，可培育更多之喂食細(xì)胞。
實(shí)施例6以添加FBS 10v/v％之MEM培養(yǎng)基，將由細(xì)胞庫分讓之人類正常2倍肺纖維母細(xì)胞株(TIG-3)培養(yǎng)至28.76PDL，使用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)，使細(xì)胞數(shù)懸濁成1.8×105cells，而于涂布膠原之培養(yǎng)皿上，以2次之繼代培養(yǎng)培養(yǎng)至35.51PDL。
接著，以含有最終濃度為10μg/mL之MMC之喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基(B)，培養(yǎng)2～3小時(shí)，使細(xì)胞分裂惰性化。之后，除去含有MMC之培養(yǎng)基，將細(xì)胞以PBS洗凈3次。藉由胰蛋白酶處理(0.25w/v％胰蛋白酶、1mM EDTA)，將洗凈后之細(xì)胞由培養(yǎng)皿剝離，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。其結(jié)果，可制得約2.1×107cells之喂食細(xì)胞。
藉此，說明了藉由本發(fā)明之培養(yǎng)基，亦可由MRC-5以外之纖維母細(xì)胞株，培育大量之喂食細(xì)胞。
比較例1將由與實(shí)施例1相同之細(xì)胞庫分讓之MRC-5，改變成使用添加了FGF1μg/L、胰島素5mg/L且不含血清白蛋白之MCDB202初代纖維母細(xì)胞用培養(yǎng)基(以下稱「FGM」，Cambrex公司)，懸濁成2.2×105cells，于涂布明膠之培養(yǎng)皿上，進(jìn)行1次之繼代培養(yǎng)。然而，繼代后細(xì)胞之增殖停止，且無法進(jìn)行MMC處理，而難以培育喂食細(xì)胞。
比較例2將由與實(shí)施例1相同之細(xì)胞庫分讓之MRC-5，使用FGM懸濁成2.2×105cells，于涂布明膠之培養(yǎng)皿上，進(jìn)行1次之繼代培養(yǎng)。然而與比較例1相同，繼代后細(xì)胞之增殖停止，且無法進(jìn)行MMC處理，而難以培育喂食細(xì)胞。
藉由本發(fā)明，可以來自動(dòng)物之感染疑慮少之無血清培養(yǎng)基，生產(chǎn)含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞所使用之喂食細(xì)胞。再者，藉由與明膠及膠原等細(xì)胞黏連因子組合，可長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，故可將來自特定供體之材料作極致利用，而能將因改變喂食細(xì)胞供應(yīng)源而產(chǎn)生之混入感染源之危險(xiǎn)降至非常低。又，根據(jù)實(shí)施例，確認(rèn)本發(fā)明可利用復(fù)數(shù)之細(xì)胞株，故可利用于多種類之來自動(dòng)物之胚胎干細(xì)胞所適合之各種喂食細(xì)胞之培育。
權(quán)利要求
1.一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基，其含有血清白蛋白、胰島素及基本培養(yǎng)基；該血清白蛋白之量為2g/L～50g/L，該胰島素之量為1mg/L～100mg/L，而該基本培養(yǎng)基系由選自MEM、α-MEM、DMEM、IMDM、Ham F10、Ham F12、Medium199、RPMI1640、RITC 80-7、MCDB104、MCDB105、MCDB153、MCDB201及MCDB202中之至少一種所構(gòu)成。
2.如申請(qǐng)專利范圍第1項(xiàng)之培養(yǎng)基，其中，進(jìn)一步含有細(xì)胞黏連因子。
3.如申請(qǐng)專利范圍第2項(xiàng)之培養(yǎng)基，其中該細(xì)胞黏連因子，系選自膠原、明膠、纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種。
4.如申請(qǐng)專利范圍第1、第2或第3項(xiàng)之培養(yǎng)基，其中，進(jìn)一步含有細(xì)胞增殖因子。
5.如申請(qǐng)專利范圍第4項(xiàng)之培養(yǎng)基，其中該細(xì)胞增殖因子，系選自纖維母細(xì)胞增殖因子及上皮細(xì)胞增殖因子中之至少一種。
6.一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞之制造方法，其包含培養(yǎng)增殖步驟，將含有選自胎兒表皮纖維母細(xì)胞、胎兒肌肉纖維母細(xì)胞、胎兒肺纖維母細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、成體表皮纖維母細(xì)胞、成體肺纖維母細(xì)胞、成體上皮細(xì)胞、成體內(nèi)皮細(xì)胞中之至少1種細(xì)胞種源之細(xì)胞集團(tuán)，以申請(qǐng)專利范圍第1～第5項(xiàng)中任一項(xiàng)之胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)增殖；及停止增殖步驟，將該培養(yǎng)增殖之細(xì)胞集團(tuán)，以排多癌(Mitomycin-C)或放射線照射而使增殖停止。
7.如申請(qǐng)專利范圍第6項(xiàng)之制造方法，其中該培養(yǎng)增殖步驟，系于涂布細(xì)胞黏連因子之培養(yǎng)容器中進(jìn)行。
8.如申請(qǐng)專利范圍第7項(xiàng)之制造方法，其中該細(xì)胞黏連因子，系選自膠原、明膠、纖維結(jié)合素結(jié)合蛋白、粘連蛋白、層粘連蛋白、聚離胺酸、聚鳥胺酸、及聚乙烯亞胺中之至少1種。
9.如申請(qǐng)專利范圍第6、第7或第8項(xiàng)之制造方法，于該培養(yǎng)增殖步驟中，使培養(yǎng)細(xì)胞平均細(xì)胞分裂20次以上。
10.一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞，其特征在于，系由申請(qǐng)專利范圍第6～第9項(xiàng)中任一項(xiàng)之制造方法所制得。
全文摘要
本發(fā)明系提供一種胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基，系將培養(yǎng)包含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞所使用之喂食細(xì)胞，由來自特定供體之材料有效率地建立、并能以感染機(jī)會(huì)少之狀態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)。并且，提供一種與包含人類胚胎干細(xì)胞之胚胎干細(xì)胞共同培養(yǎng)亦較安全之喂食細(xì)胞之制造方法，以及由此方法制得之喂食細(xì)胞。于基本培養(yǎng)基中，由至少含有血清白蛋白及胰島素之胚胎干細(xì)胞用喂食細(xì)胞培育培養(yǎng)基，將含有選自由胚胎干細(xì)胞之喂食細(xì)胞所得之胎兒表皮纖維母細(xì)胞、胎兒肌肉纖維母細(xì)胞、胎兒肺纖維母細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、成體表皮纖維母細(xì)胞、成體肺纖維母細(xì)胞、成體上皮細(xì)胞、成體內(nèi)皮細(xì)胞中之至少1種細(xì)胞種源之細(xì)胞集團(tuán)安定地進(jìn)行增殖。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1914313SQ20058000379
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月13日
發(fā)明者中辻憲夫, 末盛博文, 淺香勛, 菅井晴美, 岡本玲子 申請(qǐng)人:旭科技玻璃股份有限公司, 田邊制藥股份有限公司, 瑞伯喜爾有限公司