專利名稱：：Bt蛋白Cry52Ba1、其編碼基因及應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種新的Bt蛋白及其編碼基因和應用。
背景技術：
：在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素，據(jù)FAO統(tǒng)計，全世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)每年因蟲害造成的經(jīng)濟損失高達14%，病害損失達12%，草害損失達11%。損失額高達1260億美元，相當于中國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的一半，英國的4倍多。另外，蚊媒病在預防醫(yī)學中占有重要位置，其中登革熱和黃熱病等蚊媒病傳播力強、流行面廣、發(fā)病率高、危害性大。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年感染登革熱人數(shù)多達8000萬，我國的海南省在1980和1986年曾經(jīng)暴發(fā)過兩次登革熱，發(fā)病分別達到437469例和U3589例。登革熱和黃熱病主要由埃及伊蚊傳播。為了減少這些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍釆用化學防治手段進行防治，但由于化學農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(5"c/〃m//zwr/"g/eraz:s，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididalcrystalproteins,簡稱ICPs)，ICPs是由cr_y基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作用。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981年Schnepf從菌株HD-lDipel中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來(AdangM.Jefa/，CharacterizedfUll-lengthandtruncatedplasmidclonesofthecrystalproteinof5a"7/"51^mn'"g/ms/ssubsp.HD-73andtheirtoxicitytoManducasexta，Gene，1985，36(3):289-300.),人們已經(jīng)分離克隆了390多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(CrickmoreN，ZeiglerDR,FeitelsonJ,&Revisionofthenomenclatureforthe5ac/〃usf/m〃'wg7.ms7'spesticidalcrystalproteins.MicrobiolMolBiolRev,1998，62:807陽813;http:〃www.biols.susx.ac.uk/Home/Nei1—Crickmore/Bt/)。一般而言,Cryl,Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應用于植物的鱗翅目害蟲的防治(Kozie,M.G.，Beland，G.L,Bowman,C.，da/.Fieldperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressinganinsecticidalproteinderivedfrom5a"7/wsf/mW"g/e"iBio/Technology,1993,11:194-200;Peiiak，F(xiàn).J.，Deaton，R.W"Armstrong,T.A.，a/.Insectresistantcottonplants,bio/technology,1990;8:939-943;VanFrankenhuyzen,K.,Gringorten,L.,andGauhier,D.1997.Cry9Caltoxin,a萬ac/〃ws血n'"g/ms7'sinsecticidalcrystalproteinwithhighactivityagainstthesprucebudworm(Choristoneurafnniferana),Appl.Environ,Microbviol.63:4132-4134;王飛，2001,蘇云金芽孢桿菌特異菌株生物學特性及co^新基因的研究，碩士論文，南開大學)。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(及Aw7'wg/e"w;ssubsp.^rae/e"w、簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛運用于紋蟲的防治(GoldbergLJ,andMargalitJ，1977.AbacterialsporedemonstratingrapidlarvicidalactivityagainstJwo/7/2e/essergew打7，C/ra"otoem.aM"gi^'cw/ato,CWexwm'Wto加s,aegy/",，andCWex;^/era.MosqitoNews,37:355-358;)。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Ciy蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性(Wu，D.,Johnson,J.J.,andFederici,B.A.1994.SynergismofmosquitocidaltoxicitybetweenCytAandCryIVDProteinsusinginclusionsproducedfromclonedgenesof5a"'腸^w/n'"g7'e"iMol.Microbiol.13:965-972;Wirth，M.C"Georghiou，G.P"andFedereci，B.A.1997.CytAenablesCrylVendotoxinsof5a"'〃ws翻W"g/e,StoovercomehighlevelsofCrylVresistanceinthemosquito,Cw/ex—"《we加c/a加.Proc.Natl.Acad.Sci.94:10536—10540)自本世紀初發(fā)現(xiàn)蘇云金芽胞桿菌至今己有ioo多年的歷史，在農(nóng)作物和園藝植物害蟲、森林害蟲以及衛(wèi)生害蟲的防治方面得到廣泛的應用，也起到良好的效果。但是，由于大規(guī)模和反復使用蘇云金芽胞桿菌，許多昆蟲種群己相繼在不同程度上對殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGaughey，W.H.1985.Insectresistancetothebiologicalinsecticide5ac〃/M51^mr/wg/ew^.Science.229:193-195),原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985年，McGaughey報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Btsubsp.kurstaikHD-1的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik，B.E.,Finson，N，Groeters,F.R.，W1994.ReversalofresistancetoBa"7/附翻W"g/e;w/w."尸/她〃axy/o他〃a.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124),上世紀90年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.廣東小菜蛾對蘇云金桿菌的抗性研究.昆蟲學報，39(3).'238-244;Hofte，H.，VanRie,J.,Jansens，S.,VanHoutven,A.，Vanderbruggen,H.,andVaeck,M.,1988.Monoclonalantibodyanalysisandinsecticidalspectrumofthreetypesoflepidopteran-specificinsecticidalcrystalproteinsof5"c/〃ms//2w"/"g/e"iAppl.Environ.Microbiol.54:2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學模型預測到，在Bt轉基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性(Schnepf，E.，Crickmore，N.，VanPie,J.，etal.1998.5a"7/MS^mn'"g/e,ianditspesticidalCrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806)。另外，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題(RegisL，Wa/.，2000.TheuseofbacteriallarvicidesinmosquitoandblackflycontrolprogramsinBrazil.Mem./ra故wtoOswa/cfoOwz,95:207-210.)，但是紋蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(xiàn)(GeorghiouGP，andWirthMC，1997.Influenceofexposuretosingleversusmultipletoxinsof5ac/〃tw翻n'"g/e聰isubsp.^rae/em^ondevelopmentofresistanceinthemosquitoCWex拜'"《we加c/a加(Diptera:Culicidae).J/7p/zWE)Wraw膨wto/Mz'cra6/o/ogy'63:1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力基因資源是解決6這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。
發(fā)明內容本發(fā)明的第一個目的在于針對上述不足提供一種新的BT毒力蛋白資源。本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼所述蛋白的基因。本發(fā)明的目的還在于提供上述蛋白及基因的應用。本發(fā)明從四川省成都平原土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(5""'〃msAwW"g/era^)新菌株BM59-2。通過對BM59-2的毒力測試表明，BM59-2對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等等，均具有極高的毒力。根據(jù)c^y52類基因保守序列設計1對特異引物，擴增其基因組DNA，結果表明該菌株存在cr;;52類基因，進一步設計其全長基因引物，克隆得到co;52Ba基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.l所示，該序列全長2112bp,分析表明，GC含量為36.9。/。，編碼703個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。在softberry網(wǎng)站采用bacterialsigma7.0promoter程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為co;52^L7。本發(fā)明進一步分析了Cry52Bal蛋白的氨基酸組成(見表l)。表lCry52Bal蛋白的氨基酸組成<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>應當理解，本領域技術人員可根據(jù)本發(fā)明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第75位的Ala替換為Met。因此，本發(fā)明Bt蛋白還包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有Cry52Bal蛋白同等活性的由Cry52Bal衍生得到的蛋白質。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發(fā)明的基因和蛋白質可以從菌株BM59-2中克隆或分離得到，或者通過DNA或肽合成的方法得到?？蓪⒈景l(fā)明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發(fā)明蛋白的重組表達載體，進而可以通過諸如農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等轉基因方法，將所述表達載體導入宿主，得到轉cr^2^/基因的轉化體，例如農(nóng)作物或者果樹等植物，使其具備抗蟲活性。此外，還可以通過發(fā)酵本發(fā)明菌株BM59-2，得到含有Cry52Bal蛋白的發(fā)酵液，將其制備成殺蟲劑，用于農(nóng)作物害蟲的防治。本領域技術人員還可以將上述基因轉化細菌或真菌，通過大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)本發(fā)明Bt蛋白。本領域技術人員還可以根據(jù)本發(fā)明公開的基因，將其轉化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應的抗蟲活性。從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應用前景。圖1顯示的是co^25a/全長基因克隆，其中M,marker;1，co;52Ba7基因。圖2顯示的是重組質粒pET-52Ba的酶切鑒定圖譜，其中1重組質粒pET-52Ba;2，用A^eI+五coiI雙酶切pET-30a;3，iVcfeI+Eco/I雙酶切pET-52Ba;4，插入的DNA;Ml、M2為Marker。圖3顯示的是在Kco//BL21(DE3)中表達Cry52Bal的SDS-PAGE檢測，其中M為蛋白marker;1.陰性對照(co/iBL21(DE3)(pET-30a));2.裂解上清；3.Cry52Bal包涵體。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例lctj525W基因的克隆本發(fā)明從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(5""7/mAi/n'"g/m^)新菌株，該菌株已于2009年1月12日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京巿朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(Bac〃/"sAMW"gz'em^),保藏號為CGMCCNo.2871。本例通過如下方法克隆得到cr;;52萬a7基因的全長序列。BM59-2的總DNA。設計引物序列如下p1:5，atgaattcatatcaaaataaaaatg3，p2:5'ttacctcctacttcagtacatacttt3'PCR反應體系:10xbuffer2^1MgCl2(25mM)Taq酶dNTPs(2,5mM)引物模板2^125pl終反應體積熱循環(huán)反應94。C預變性5min;94。C變性lmin,52。C退火lmin，72。C延伸2min，30個循環(huán)；72。C延伸5min;4。C停止反應。擴增反應產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR擴增結果。結果如圖l所示，通過擴增得到了約為2000bp的序列，將該序列進行測序，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示，與目的序列一致。實施例2co;52^1/基因的表達及殺蟲活性測定根據(jù)c/7"^^基因開放閱讀框兩端序列，設計并合成一對特異性引物cry53F:5'-GCGCATATG,I)ATGAATTCATATCAAAATAAAAATG-3，cry53R:5'-CGGAATTC(五coRI)TTACCTCCTACTTCAGTACATACTTT-3',分另!]在5'端引物7V^I和五coRI酶切位點。以BM59-2質粒為模板進行擴增，擴增的產(chǎn)物釆用7V&I和五coRI進行雙酶切，酶切產(chǎn)物與同樣進行雙酶切后的載體pET-30a(+)連接，轉化￡.co/z'DH5a感受態(tài)細胞，提取其質粒酶切電泳驗證了插入片斷大小符合預期目的后(圖2),再轉入受體菌五.co/Z.BL21(DE3)。將重組質粒命名為pET-52Ba，含重組質粒的重組子命名為五.co/Z.BL21(52Ba)。SDS-PAGE分析表明co;52^/基因的表達產(chǎn)物在菌體超聲破碎后的沉淀中(圖3),分子量約為76kDa左右，與預測的蛋白分子量相符。C^52萬a/基因表達產(chǎn)物分別對甜菜夜蛾，棉鈴蟲及伊紋的生測結果表明表達產(chǎn)物對這三種蟲都具有較好的殺蟲活性。對甜菜夜蛾殺蟲活性最高，￡<^0為25.2嗎/mL;對伊紋的丄C^為34.63嗎/mL;對棉鈴蟲殺蟲活性最低，ZC^為58.19pg/mL。蛋白對鱗翅目殺蟲活性的的測定方法參見(SongFP，ZhangJ，GuAX，etal"2003.Identificationofcr_y//-typegenesfromf/^Wwg/e/w/sstrainsandcharacterizationofanovelcr_y//-typegene.Appl.Environ.Microbiol69:5207-5211),蛋白對雙翅目殺蟲活性的的測定方法參見(IbarraJE,delRinc6nMC,SergioOrdiiz，etal.，102003.Diversityof5"cz.〃w51f/mn."g/e"&^StrainsfromLatinArtiericawithInsecticidalActivityagainstDifferentMosquitoSpecies.ApplEnvironMicrobiol69:5269-5274)。序列表<110>四川農(nóng)業(yè)大學〈120〉蘇云金芽胞桿菌BM59-2及其應用<130〉KHP09112216.2<160>6<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211>2111<212>DNA<213>BacillusthuringiensisBM59-2〈220〉<221>CDS<222>(1)..(2109)<400>1atgaatteatatcaaaataaaaatgaatatgaaatattggatgettea48MetAsnSerTyrGinAsnLysAsnGluTyrGlulieLeuAspAlaSer151015caaaacaactctaatatgtctaatcgttatccaaggtatccattagca96GinAsnAsnSerAsnMetSerAsnArgTyrProArgTyrProLeuAla202530aatgatccacaagettctatgcagaatacgaattata犯gattggttg144AsnAspProGinAlaSerMetGinAsnThrAsnTyrLysAspTrpLeu354045getacgtgcaacggaacgcctgccccgctttataattctteacaaeta192AlaThrCysAsnGlyThrProAlaProLeuTyrAsnSerSerGinLeu505560cttaaaattteaggaaatgtagtttctagggetetcggaatgcttccc240LeuLyslieSerGlyAsnValValSerArgAlaLeuGlyMetLeuPro65707580attcctgggattgetcctcttttaagttttetctctactttgctttgg288lieProGlylieAlaProLeuLeuSerPheLeuSerThrLeuLeuTrp85.9095ccaagtggateatecggaaatactatttgggaategttgatg犯ag犯336ProSerGlySerSerGlyAsnThrlieTrpGluSerLeuMetLysGlu100105110getgcggatttgatagaccaaaagttagaggagaatatattacgccaa384AlaAlaAspLeulieAspGinLysLeuGluGluAsnlieLeuArgGin115120125gcaacggccaatttagccggattacaaggaetattgggateatataac432AlaThrAlaAsnLeuAlaGlyLeuGinGlyLeuLeuGlySerTyrAsn130135140agegettttgetteatgggaagcaggcggcaatgcaactcctgatctg480SerAlaPheAlaSerTrpGluAlaGlyGlyAsnAlaThrProAspLeu145150155160gta犯aggt城atggetgagecttcatcgtacgtttgtgcaggatatt528ValLysGlyTyrMetGluSerLeuHisArgThrPheValGinAsplie165170175ataggcagettcacgataccaggttatgaaa犯atattattacctacc576lieGlySerPheThrlieProGlyTyrGluLyslieLeuLeuProThr180185190tatgcgattaccgccaeittttcatttgatgttattacgtgacattgaaTyrAlalieThrAlaAsnPheHisLeuMetLeuLeuArgAsplieGlu195200205atttatggaggtaaaaaaaccccagaaggtaaagatggcctgaatttt672lieTyrGlyGlyLysLysThrProGluGlyLysAspGlyLeuAsnPhe210215220ga_t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4<212>DNA〈213>人工序列<400>5gcgcatatgatgaattcat3tcaaaataaa肌tg<210〉6〈211>34<212〉DNA<213>人工序列<400〉6cggaattcttacctcctacttcagtacatacttt34342權利要求1、一種Bt蛋白Cry52Ba1，其氨基酸序列是1)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的蛋白。2、編碼權利要求l所述蛋白的基因。3、如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。4、含有權利要求2或3所述基因的表達載體。5、由權利要求4所述表達載體轉化的宿主細胞。6、如權利要求5所述的宿主細胞，其為植物宿主細胞。7、含有權利要求所述蛋白的殺蟲劑。8、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述表達載體在制備轉基因植物中的應用。9、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述表達載體在提高植物抗蟲性中的應用。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cry52Ba1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的蛋白。本發(fā)明蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，所述基因可以轉化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應用前景。文檔編號A01N63/02GK101531711SQ20091008159公開日2009年9月16日申請日期2009年4月13日優(yōu)先權日2009年4月13日發(fā)明者劉懷年,軍朱,平李,李雙成,王世全,王玲霞,鄧其明,鄭愛萍申請人:四川農(nóng)業(yè)大學