具有人源化信號調(diào)節(jié)蛋白基因的非人動(dòng)物的制作方法
【專利說明】具有人源化信號調(diào)節(jié)蛋白基因的非人動(dòng)物
[0001]對相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年9月23日提交的美國臨時(shí)申請No. 61 /881261的利益，在此通過 引用將它們的全部公開內(nèi)容合并入本文。
[0003] 背景
[0004] 免疫系統(tǒng)由幾種不同的細(xì)胞類型組成，它們涉及多個(gè)高度調(diào)節(jié)的過程，并且它們 一起產(chǎn)生免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)有效消除外來蛋白。進(jìn)一步，發(fā)現(xiàn)這些相同的免疫細(xì)胞具 有自我意識的屬性，其，特別是通過調(diào)節(jié)膜蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞間相互作用。這種通訊對于這種 生物體的存活是非常重要的，因?yàn)檫@些相同的蛋白被認(rèn)為是移入物移植的重要決定因素。 但是，還沒有體內(nèi)系統(tǒng)來研究清楚人免疫細(xì)胞間相互作用及其調(diào)節(jié)的分子方面。這種系統(tǒng) 為人造血和免疫系統(tǒng)相關(guān)功能的體內(nèi)測定、新的療法和疫苗的鑒別提供了來源。
[0005] 發(fā)明簡述
[0006] 本發(fā)明包括認(rèn)識到構(gòu)建非人動(dòng)物以允許改進(jìn)人造血干細(xì)胞的移入是合乎需要的。 本發(fā)明還包括認(rèn)識到具有人源化SIRPa基因和/或另外表達(dá)、含有、或產(chǎn)生人或人源化SIRPa 的非人動(dòng)物是合乎需要的，例如用于人造血干細(xì)胞的移入。
[0007] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物表達(dá)SIRPa多肽，所述SIRPa多肽包含人 SIRPa蛋白的胞外部分和小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分。
[0008] 在一些實(shí)施方案中，人SIRPa蛋白的胞外部分包含相應(yīng)于SEQ ID N0:4所示的人 SIRPa蛋白的殘基28-362的氨基酸。
[0009] 在一些實(shí)施方案中，人SIRPa蛋白的胞外部分與表3中所示的人SIRPa蛋白的相應(yīng) 胞外部分具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%或至少98%的同一性百分比。在一些實(shí)施方案中，人SIRPa蛋白 的胞外部分與表3中所示的人SIRPa蛋白的相應(yīng)胞外部分具有100%的同一性(或相同）。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物也不表達(dá)內(nèi)源非人SIRPa蛋白。在一些實(shí)施 方案中，非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物并且也不表達(dá)內(nèi)源嚙齒動(dòng)物SIRPa蛋白。在一些實(shí)施方案中， 非人動(dòng)物是小鼠并且也不表達(dá)具有表3所示序列的內(nèi)源小鼠 SIRPa蛋白。
[0011]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含SIRPa基因的非人動(dòng)物，所述SIRPa基因包含 與非人SIRPa啟動(dòng)子可操作連接的人SIRPa基因的外顯子2、3和4。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物的SIRPa基因包含非人SIRPa基因的外顯子 1、5、6、7和8〇
[0013] 在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。在一些特定的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的嚙齒動(dòng)物選自小鼠或大鼠。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本文所述的非人動(dòng)物的基因編碼的SIRPa多肽。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供從本文所述的非人動(dòng)物分離的細(xì)胞或組織。在一 些實(shí)施方案中，細(xì)胞選自淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞或T細(xì)胞）、骨髓細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞、嗜中性 粒細(xì)胞、粒細(xì)胞、骨髓樹突細(xì)胞和肥大細(xì)胞)和神經(jīng)元。在一些實(shí)施方案中，組織選自脂肪、 膀胱、腦、乳房、骨髓、眼、心、腸、腎、肝、肺、淋巴結(jié)、肌肉、胰腺、血衆(zhòng)、血清、皮膚、脾、胃、胸 腺、睪丸、卵和/或它們的組合。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離的小鼠細(xì)胞或組織，其基因組包括SIRPa基 因，所述SIRPa基因編碼與小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SIRPa蛋白的的胞外部分。在 一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的SIRPa基因與小鼠 SIRPa啟動(dòng)子可操作地連接。在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明的SIRPa基因包含人SIRPa基因的外顯子2、3和4。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供非人胚胎干(ES)細(xì)胞，其基因組包含本文所述的 SIRPa基因。在一些實(shí)施方案中，ES細(xì)胞包含與非人SIRPa啟動(dòng)子可操作連接的人SIRPa基因 的外顯子2、3和4。在一些特定的實(shí)施方案中，ES細(xì)胞是嚙齒動(dòng)物ES細(xì)胞。在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明的非人胚胎干細(xì)胞是小鼠或大鼠胚胎干細(xì)胞。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供非人胚胎，所述非人胚胎含有包含本文所述的 SIRPa基因的非人胚胎干細(xì)胞，由包含本文所述的SIRPa基因的非人胚胎干細(xì)胞制備，由其 獲得或由其產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人胚胎是嚙齒動(dòng)物胚胎。在一些實(shí)施方案 中，本文所述的嚙齒動(dòng)物胚胎是小鼠或大鼠胚胎。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備表達(dá)來自內(nèi)源SIRPa基因座的SIRPa蛋白的非 人動(dòng)物的方法，其中SIRPa蛋白包含人序列，所述方法包括用包含編碼全部或部分人SIRPa 蛋白的核苷酸序列的基因組片段靶向非人ES細(xì)胞中的內(nèi)源SIRPa基因座；獲得包含內(nèi)源 SIRPa基因座的改造的非人ES細(xì)胞，所述內(nèi)源SIRPa基因座包含所述人序列；以及，使用所述 改造的ES細(xì)胞產(chǎn)生非人動(dòng)物。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列包含人SIRPa基因的外顯子2、3和4。在一些實(shí) 施方案中，所述核苷酸序列包含人SIRPa基因的外顯子2、3和4,所述人SIRPa基因具有與表3 中所示的人SIRPa基因至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同的序列。
[0021 ]在一些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼人SIRPa蛋白的氨基酸殘基28-362。在一 些實(shí)施方案中，所述核苷酸序列編碼人SIRPa蛋白的氨基酸殘基28-362,所述人SIRPa蛋白 具有與表3中所示的人SIRPa蛋白至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%相同的序列。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了提供小鼠的方法，該小鼠的基因組包括編碼與 小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SIRPa蛋白的胞外部分的SIRPa基因，所述方法包括改 造小鼠的基因組，使其包含編碼與小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SIRPa蛋白的胞外部 分的SIRPa基因，由此提供所述小鼠。在一些實(shí)施方案中，SIRPa基因是本文所述的SIRPa基 因。在一些實(shí)施方案中，SIRPa基因包含人SIRPa基因的外顯子2、3和4。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供將人細(xì)胞移入到小鼠中的方法，所述方法包括以 下步驟:提供小鼠，該小鼠的基因組包含編碼與小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SIRPa 蛋白的胞外部分的SIRPa基因；并將一個(gè)或多個(gè)人細(xì)胞移入到小鼠中。在一些特定的實(shí)施方 案中，所述方法進(jìn)一步包括測定一個(gè)或多個(gè)人細(xì)胞在小鼠中的移入的步驟。在一些特定的 實(shí)施方案中，測定步驟包括將一個(gè)或多個(gè)人細(xì)胞的移入與在一個(gè)或多個(gè)野生型小鼠中的移 入相比較。在一些特定的實(shí)施方案中，測定的步驟包括將一個(gè)或多個(gè)人細(xì)胞的移入與在一 個(gè)或多個(gè)其基因組不包含SIRPa基因的小鼠中的移入相比較，所述SIRPa基因編碼與小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SIRPa蛋白的胞外部分。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，人細(xì)胞是造血干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，人細(xì)胞被靜脈內(nèi)移 植。在一些實(shí)施方案中，人細(xì)胞被腹膜內(nèi)移植。在一些實(shí)施方案中，人細(xì)胞被皮下移植。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，其包括以下步驟:提供一個(gè)或多個(gè)細(xì) 胞，所述細(xì)胞的基因組包括編碼與小鼠 SI RPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SI RPa蛋白的胞外部 分的SIRPa基因；將所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞與標(biāo)記的底物溫育;并測量所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞對 標(biāo)記的底物的吞噬作用。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是小鼠細(xì)胞。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，底物是熒光標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，底物用抗體標(biāo)記。在 一些實(shí)施方案中，底物是一個(gè)或多個(gè)紅細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，底物是一個(gè)或多個(gè)細(xì)菌細(xì) 胞。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，其包括以下步驟:提供小鼠，該小鼠的 基因組包括編碼與小鼠 SIRPa蛋白的胞內(nèi)部分連接的人SIRPa蛋白的胞外部分的SIRPa基 因；將該小鼠暴露于抗原;并測量小鼠的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞對抗原的吞噬作用。在一些實(shí)施方 案中，暴露的步驟包括將小鼠暴露于熒光標(biāo)記的抗原。在一些實(shí)施方案中，暴露的步驟包括 將小鼠暴露于一個(gè)或多個(gè)包含抗原的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，暴露的步驟包括將小鼠暴 露于一個(gè)或多個(gè)包含抗原的人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，暴露的步驟包括將小鼠暴露于一 個(gè)或多個(gè)包含抗原的細(xì)菌細(xì)胞。
[0028]在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的SIRPa基因包含人SIRPa基因的外顯子2、3和4。在 不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人SIRPa蛋白的胞外部分包含相應(yīng)于表3所示的人SIRPa蛋白 的殘基28-362的氨基酸。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的SIRPa基因與小鼠 SIRPa啟動(dòng)子可 操作地連接。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明所述的方法可獲得的非人動(dòng)物。在一些 特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物不以可檢測到的水平表達(dá)內(nèi)源SIRPa蛋白的胞外部 分。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鑒別或驗(yàn)證藥物或疫苗的方法，所述方法包括將 藥物或疫苗遞送到本文所述的非人動(dòng)物中，并監(jiān)測對該藥物或疫苗的一種或多種免疫反 應(yīng)、該藥物或疫苗的安全性狀況或它們對疾病或病況的效果的步驟。在一些實(shí)施方案中，監(jiān) 測安全性狀況包括確定非人動(dòng)物是否由于遞送該藥物或疫苗而表現(xiàn)出副作用或不良反應(yīng)。 在一些實(shí)施方案中，副作用或不良反應(yīng)選自發(fā)病、死亡、體重改變，一種或多種酶的水平(例 如肝)的改變、一個(gè)或多個(gè)器官的重量的改變、功能喪失(例如感覺、運(yùn)動(dòng)、器官等）、對一種 或多種疾病的易感性增加、對非人動(dòng)物基因組的改變、食物消耗的增加或減少以及一種或 多種疾病的并發(fā)癥。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的非人動(dòng)物在開發(fā)用于醫(yī)藥(例如用作藥 劑)的藥物或疫苗中的用途，
[0032] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本文所述的非人動(dòng)物用于評價(jià)靶向人細(xì)胞的治療 藥物的效力的用途。在不同的實(shí)施方案中，給本發(fā)明的非人動(dòng)物移植人細(xì)胞，并給動(dòng)物施用 靶向這種人細(xì)胞的候選藥物。通過在施用藥物之后監(jiān)測非人動(dòng)物中的人細(xì)胞，確定藥物的 效力。
[0033] 在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的非人動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物，優(yōu)選是小鼠或大鼠。
[0034]如本申請中所使用的，術(shù)語"約（about)"和"大致(approximately)"等同使用。本 申請中使用的用或不用約/大致修飾的任何數(shù)值都覆蓋了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的任 何正常波動(dòng)。
[0035] 在下述的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的。但是，應(yīng)當(dāng) 理解，雖然詳細(xì)描述表明了本發(fā)明的實(shí)施方案，但它僅僅是以舉例說明的方式給出的，并非 是限制。根據(jù)詳細(xì)描述，本發(fā)明范圍內(nèi)的各種變化和修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將變得 顯而易見。
[0036] 附圖簡述
[0037] 本文包括的附圖僅僅是為了舉例說明的目的，而非限制。
[0038]圖1顯示內(nèi)源鼠 SIRPa基因（上部）的簡圖，但并非成比例的，其中每一個(gè)外顯子被 編號。人源化內(nèi)源SIRPa基因（下部）顯示含有人SIRPa基因的外顯子2-4和新霉素選擇盒 (Ub-Neo)，其側(cè)翼具有位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)（例如ΙοχΡ)。人SIRPa基因的外顯子2-4 的靶向插入獲得表達(dá)人源化SIRPa基因的內(nèi)源基因，所述人源化SIRPa基因具有相應(yīng)于人 SIRPa蛋白的胞外域。
[0039] 圖2顯示野生型和人源化SIRPa基因雜合小鼠的SIRPa表達(dá)的覆蓋(overlay)。
[0040] 圖3顯示移入⑶34+細(xì)胞的不同小鼠株中⑶45+細(xì)胞的百分比。
[0041 ] 圖4顯示移入⑶34+細(xì)胞的不同小鼠株中⑶45+⑶3+細(xì)胞的百分比。
[0042] 圖5顯示移入⑶34+細(xì)胞的不同小鼠株中⑶45+⑶19+細(xì)胞的百分比。
[0043] 圖6顯示在移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠中，Ab 1以劑量依賴的方式抑制Raji腫瘤 的生長。在腫瘤植入后第3、6、9、13、16、20、23、27、30和34天測量1^於腫瘤體積。給出了個(gè)體 動(dòng)物的數(shù)據(jù)(A-D圖）。在第0天給移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠皮下施用2xl0 6個(gè)Raji腫瘤細(xì) 胞。對照組所接受的沒有抗體(載體對照）(A圖）。對于實(shí)驗(yàn)組，在第0天對小鼠通過腹膜內(nèi)給 藥進(jìn)行治療，給予0.4mg/kg的非結(jié)合性對照Ab(對照Ab5) (B圖），或0.4mg/kg(C圖）或 0.04mg/kg(D圖）的Ab 1，然后在研究期限內(nèi)每周兩次給藥。所有個(gè)體測試組的綜合數(shù)據(jù)顯 示在圖7中。
[0044] 圖7顯示在移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠中，與對照相比，Ab 1顯著抑制Raji腫瘤的 生長。數(shù)據(jù)表示來自每組n = 4-5只小鼠的綜合數(shù)據(jù)，如圖6所示。數(shù)據(jù)用平均值(SEM)表示， 并使用方差分析(AN0VA)和事后檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以檢查顯著效果（用于兩因素方差分析的 Tukey's檢驗(yàn)）。載體對照組、對照Ab 5組和Ab 1 0.4mg/kg組中的一只小鼠由于早期死亡而 被排除在該綜合圖之外，以通過雙因素 AN0VA分析數(shù)據(jù)。
[0045] 圖8顯示在移入hCD34+的SIRPaBRG小鼠中，Ab 1不影響體重。在腫瘤植入后第3、6、 9、13、16、20、23、27、30和34天測量體重。測量個(gè)體動(dòng)物的數(shù)據(jù)(4-0圖）。在第0天給移入 hCD34+的SIRPaBRG小鼠皮下施用2x106個(gè)Raj i腫瘤細(xì)胞。對照組所接受的沒有抗體(載體對 照）(A圖）。對于實(shí)驗(yàn)組，在第0天對小鼠通過腹膜內(nèi)給藥(IP dose)進(jìn)行處理，給予0.4mg/kg 的IgGl非結(jié)合性對照Ab 5(B圖），或0.4mg/kg(C圖）的Ab 1或0.04mg/kg(D圖）的Ab 1，然后 在研究期限內(nèi)每周兩次給藥。
[0046] 定義
[0047] 本發(fā)明不限于所描述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@些方法和條件可以變化。還 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅僅是為了描述具體實(shí)施方案，不是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的 范圍由權(quán)利要求定義。
[0048]除非另有定義，本文使用的所有術(shù)語和短語包括該術(shù)語和短語在本領(lǐng)域中所具有 的含義，除非明確給出相反說明或者從使用該術(shù)語和短語的上下文中明確表現(xiàn)出是相反含 義。雖然在實(shí)施或測試本發(fā)明時(shí)可以使用與本文所述類似或等同的任何方法和材料，現(xiàn)在 描述具體的方法和材料。提及的所有出版物在此通過引用的方式合并入本文。
[0049]在本文中應(yīng)用在感興趣的一個(gè)或多個(gè)值上的術(shù)語"大致"，指與所述參考值類似的 值。在特定的實(shí)施方案中，術(shù)語"大致"或"約"指落入所述參考值任一方向（大于或小于）的 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、 5 %、4 %、3 %、2 %、1 %或更小的值的范圍（除了這些數(shù)字會(huì)超過可能值的100 %的情況）。
[0050] 本文中所使用的術(shù)語"生物活性"指在體外或體內(nèi)（例如在生物體中），在生物系統(tǒng) 中具有活性的任何試劑的特性。例如，當(dāng)在生物體中時(shí)，在該生物體中具有生物學(xué)作用的試 劑被視為是有生物活性的。在特定的實(shí)施方案中，如果蛋白質(zhì)或多肽具有生物學(xué)活性，該蛋 白或多肽的具有至少一種該蛋白或多肽的生物活性的部分通常被稱為"生物活性"部分。
[0051] 術(shù)語"可比的"，如本文中所使用的，指兩種或更多種試劑、實(shí)體、情況、條件設(shè)置 等，它們可以彼此不相同，但是足夠相似，以允許在它們之間進(jìn)行比較，以使得可以根據(jù)所 觀察到的差異或相似性合理地得到結(jié)論。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合上下文，對于兩種 或更多種試劑、實(shí)體、情況、條件設(shè)置等來說，在任何給定的環(huán)境中需要何種相同程度才能 被視為是可比的。
[0052] 本文中所使用的描述保