煙曲霉膜聯(lián)蛋白anxC4基因(anxC4基因)的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用煙曲霉膜聯(lián)蛋白anxC4及其基因（anxC4基因） 作為對(duì)煙曲霉檢測(cè)的靶標(biāo)，涉及anxC4基因作為核酸檢測(cè)、免疫檢測(cè)、生化檢測(cè)的檢測(cè)靶標(biāo) 的應(yīng)用，以及應(yīng)用中得到的煙曲霉的LAMP試劑盒及其引物、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其引 物和TaqMan探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙曲霉臨床感染及檢測(cè)現(xiàn)狀
[0003] 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是一種常見的機(jī)會(huì)致病菌，在環(huán)境中分布廣泛， 其孢子被免疫缺陷或免疫低下病人吸入后極易引發(fā)侵襲性曲霉病，由于其致病機(jī)理尚不清 楚，缺乏有效的治療方法，病死率高達(dá)90%。引起侵襲性曲霉病的主要真菌是煙曲霉，一般 病人只有到了患病晚期或死亡后才能檢測(cè)出煙曲霉感染，因此，對(duì)煙曲霉進(jìn)行早期診斷和 預(yù)防至關(guān)重要。在過去的幾十年里，隨著免疫抑制治療、廣譜抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致患者 體內(nèi)正常菌群失調(diào)以及屏障功能被破壞，從而引起真菌移位、定植以及感染等，煙曲霉感染 患者的數(shù)量也不斷上升[陳云茹，陳天艷，趙英仁.煙曲霉菌感染的研究進(jìn)展.臨床內(nèi)科雜 .2011,28(8):54-57.]。國內(nèi)外學(xué)者及臨床專家普遍認(rèn)為，對(duì)煙曲霉進(jìn)行早期診斷并加以及 時(shí)治療是預(yù)防侵襲性曲霉病相對(duì)有效的方法。因此，建立一種特異性高、準(zhǔn)確、靈敏、快速、 方便、成本低廉的煙曲霉檢測(cè)方法是降低侵襲性曲霉病發(fā)生和危害的重要途徑。
[0004] 現(xiàn)有的煙曲霉檢測(cè)方法主要為鏡檢和培養(yǎng)法，鏡檢法檢出率很低；而傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒 定方法需要對(duì)患者樣本先進(jìn)行48小時(shí)以上培養(yǎng)，然后對(duì)菌落和微觀形態(tài)進(jìn)行直接觀察 [Nouer SA,Nucci Μ,Kumar NS ,Grazziutti M,Barlogie B,Anaissie E. Earlier response assessment in invasive aspergillosis based on the kinetics of serum Aspergillus galactomannan:proposal for a new definition.Clin Infect Dis.2011, 53:671-676.]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法雖然簡(jiǎn)單、成本低，但耗時(shí)太長，靈敏度低，遠(yuǎn)不能滿足 臨床上對(duì)煙曲霉進(jìn)行快速準(zhǔn)確檢測(cè)的需要。目前，煙曲霉的檢測(cè)方法除了傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定 方法外，還有免疫學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。免疫學(xué)檢測(cè)方法主要是檢測(cè)半乳甘 露聚糖和l，3-i3-D-葡聚糖，這兩種物質(zhì)都是煙曲霉細(xì)胞壁的組成成分，當(dāng)煙曲霉菌絲在肺 組織中生長時(shí)這兩種物質(zhì)就會(huì)釋放到血液中。但是，由于病人自身的免疫低下以及進(jìn)行過 抗真菌治療，用免疫學(xué)檢測(cè)方法可能會(huì)產(chǎn)生假陰性或假陽性的結(jié)果[Sulahian A， Touratier S,Ribaud P.False positive test for aspergillus antigenemia related to concomitant administration of piperacillin and tazobactam.N Engl J Med. 2003，349:2366-2367.]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要是通過PCR技術(shù)(包括熒光定量PCR) 對(duì)煙曲霉的特異性基因進(jìn)行檢測(cè)，PCR技術(shù)具有特異性高、準(zhǔn)確、靈敏、快速等優(yōu)點(diǎn)，但是PCR 技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員及環(huán)境的要求很高，儀器設(shè)備昂貴，同時(shí)需要進(jìn)行嚴(yán)格的溫度控制，很難應(yīng) 用于煙曲霉的臨床快速檢測(cè)[Ostrosky-Zeichner L· Invasive mycoses : diagnostic challenges.Am J Med.2012，125:S14_24.]〇
[0005] LAMP技術(shù)介紹
[0006] 環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 由Notomi[Notomi T,et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Res. 2000; 28( 12): 63.]發(fā)明的一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。具體方法是針對(duì)靶基因 （DNA 或者cDNA)的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)4-6種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶，在60-65°C的恒溫條件 下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，40-50min即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，在LAMP反應(yīng)過程中可以形成明顯 的副產(chǎn)物一白色的焦磷酸鎂沉淀，可通過濁度觀察、熒光染料染色，或者對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳來對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定。LAMP技術(shù)具有特異性高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、快速 高效、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)直觀和對(duì)儀器設(shè)備要求低等特點(diǎn)。自2000年發(fā)明以來，LAMP技術(shù)已被 迅速用于病原微生物檢測(cè)、遺傳病診斷、食品安全等領(lǐng)域的分子生物學(xué)檢測(cè)。近年來，國外 已將LAMP技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)，符合疾病檢測(cè)的快速、準(zhǔn)確診斷需要，適合臨床推廣 應(yīng)用。
[0007] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)介紹
[0008] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qPCR)是 1996年由美國 Applied Biosystems公司推出的，該技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入焚光基團(tuán)，利用焚光信 號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[Heid CA， Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.19960ct； 6(10) :986-94.]。與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度 高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研 究的各個(gè)領(lǐng)域。通過該技術(shù)可快速、靈敏的檢測(cè)病毒RNA和DNA以及細(xì)菌DNA，該方法已被應(yīng) 用于人類傳染病的診斷和病原定量，以及動(dòng)物病原體基因的檢測(cè)，畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫，生 物制品的鑒定等領(lǐng)域[Jozefczuk J，Adjaye J.Quantitative real-time PCR-based analysis of gene expression.Methods Enzymol·2011;500:99-109·]〇
[0009] 煙曲霉anxC4基因介紹
[0010]煙曲霉膜聯(lián)蛋白anxC4為真菌膜聯(lián)蛋白家族的新成員，具體功能尚不清楚[Khalaj V,Smith L,Brookman J,Tuckwell D.Identification of a novel class of annexin genes.FEBS Lett.2004Mar 26；562(1-3):79-86.Khalaj V,Azarian B,Enayati S,Vaziri B.Annexin C4in A.fumigatus:a proteomics approach to understand the function.J Proteomics·2011Sep 6;74(10):1950-8·]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 發(fā)明人分析得知煙曲霉的anxC4基因序列與其它真菌及人類的基因序列有顯著差 異，因此其能作為煙曲霉的理想特異性檢測(cè)靶標(biāo)。
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供煙曲霉膜聯(lián)蛋白anxC4基因（anxC4基因）作為煙曲霉 檢測(cè)靶標(biāo)的應(yīng)用，所述檢測(cè)包括分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物化學(xué)等檢測(cè)方法。
[0013] 所述anxC4基因序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。
[0014]所述應(yīng)用是以anxC4基因作為核酸檢測(cè)靶標(biāo)，是指將anxC4基因序列或其互補(bǔ)序 列、anxC4蛋白或多肽及其抗體應(yīng)用于煙曲霉檢測(cè)，包括以anxC4基因作為對(duì)煙曲霉進(jìn)行核 酸擴(kuò)增檢測(cè)的引物和探針的設(shè)計(jì)模板而擴(kuò)增得到擴(kuò)增子為anxC4基因部分或全部序列的過 程;所述的核酸擴(kuò)增檢測(cè)包括普通PCR、熒光定量PCR、等溫?cái)U(kuò)增及其他通過擴(kuò)增anxC4基因 序列對(duì)煙曲霉的核酸檢測(cè)。
[0015] 所述的應(yīng)用是以anxC4蛋白作為檢測(cè)靶標(biāo)，是指將anxC4蛋白或其多肽，或其抗體 應(yīng)用于煙曲霉檢測(cè)。
[0016] 本發(fā)明另一目的在于以煙曲霉anxC4基因序列作為設(shè)計(jì)模板，提供了用于對(duì)煙曲 霉進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物，以實(shí)現(xiàn)煙曲霉的批量檢測(cè)，提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。
[0017] 本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)煙曲霉的LAMP引物，是根據(jù)煙曲霉膜聯(lián)蛋白anxC4基因 (anxC4，序列表中SEQ ID NO: 1所示）設(shè)計(jì)的，用以定性檢測(cè)痰、血液、支氣管肺泡灌洗液等 待測(cè)樣品中的煙曲霉基因組DNA，所述LAMP引物是由四條引物組成的引物組合，包括外引物 ?3、83和內(nèi)引物？1?、81?按摩爾比5:40的組合。
[0018] 具體來講，所述用于對(duì)煙曲霉進(jìn)行LAMP檢測(cè)的四條引物的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0:2(F3)、SEQ ID N0:3(B3)、SEQ ID N0:4(FIP)和SEQ ID N0:5(BIP)所示。
[0019] 對(duì)煙曲霉進(jìn)行LAMP檢測(cè)的試劑盒也屬于本發(fā)明。該試劑盒中包括上述用于對(duì)煙曲 霉進(jìn)行LAMP檢測(cè)的引物。具體來講，所述試劑盒包括以下用于25yL LAMP反應(yīng)體系的試劑:2 X反應(yīng)緩沖液12.5yL，Bst DNA(8000U/ml)聚合酶lyL，去離子水5.5yL，引物加入量為： 5pmol引物F31yL，5pmol引物B31yL，40pmol引物FIP lyL，40pmol 引物BIP lyL。為方便檢 測(cè)，所述試劑盒中還可包括陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽性對(duì)照為煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)株基因組 DNA，所述陰性對(duì)照為不含DNA的LAMP擴(kuò)增體系，如雙蒸水、無菌去離子水。
[0020] 上述LAMP引物或試劑盒在煙曲霉LAMP檢測(cè)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明。使用所述試劑 盒對(duì)煙曲霉的LAMP檢測(cè)可包括以下步驟：
[0021] 1)以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，在上述LAMP引物的引導(dǎo)下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，25yL LAMP反應(yīng)液包括:待測(cè)樣品基因組DNA 2yL，2 X反應(yīng)緩沖液12.5yL，Bst DNA聚合酶(8000U/ ml) lyL，去離子水5.5yL，引物加入量為：5pmo 1引物F3 lyL，5pmo 1引物B3 lyL，40pmo 1引物FIP lyL，40pmol引物BIP lyL; LAMP擴(kuò)增條件為:置60-65°C恒溫60min左右；
[0022] 2)LAMP擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行結(jié)果判定，結(jié)果判定可采用以下三種方法：
[0023] 2.1用濁度儀檢測(cè)LAMP擴(kuò)增前后反應(yīng)液的濁度變化，根據(jù)濁度變化判斷結(jié)果:濁度 上升表示待測(cè)樣品中存在煙曲霉（陽性），濁度無變化表示待測(cè)樣品中不存在煙曲霉（陰 性)；
[0024] 2.2在LA