一種抗氟磺胺草醚相關(guān)蛋白hb1及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗氟磺胺草醚相關(guān)蛋白HB1及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，我國(guó)玉米種植面積不斷增加，現(xiàn)今玉米已經(jīng)成為我國(guó)種植面積最大的谷 類作物。隨著玉米種植面積的增加，除草劑也已成為玉米田雜草防除中不可缺少的部分，但 由于我國(guó)農(nóng)民施藥技術(shù)水平低，噴灑器械落后等原因，已造成除草劑應(yīng)用劑量過(guò)大，土壤積 累量增高，嚴(yán)重影響到后茬作物的輪作，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，并嚴(yán)重影響了我國(guó)農(nóng)業(yè) 種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整。目前，隨著氟磺胺草醚施用面積的擴(kuò)大，氟磺胺草醚殘留對(duì)后茬玉米造 成藥害日趨嚴(yán)重，解決氟磺胺草醚殘留藥害，并已成為一個(gè)亟待解決的生產(chǎn)問(wèn)題和環(huán)保問(wèn) 題。
[0003] 現(xiàn)今，生物技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)引起了農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的重大變革，利用外源基因?qū)胫参?體中并進(jìn)行表達(dá)，給作物育種帶來(lái)了革命性的變化。因此，利用生物工程技術(shù)擺脫傳統(tǒng)雜交 育種的物種局限培育對(duì)氟磺胺草醚具有抗性的作物新品種，既可以充分利用基因資源、自 由構(gòu)建遺傳性狀，也可以減少氟磺胺草醚對(duì)后茬玉米的藥害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種抗氟磺胺草醚相關(guān)蛋白HB1及其編碼基因與應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明提供了一種蛋白，獲自玉米，命名為HB1蛋白，是如下(a)或(b):
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007] (b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與氟磺胺草醚抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0009] 表1標(biāo)簽的序列 「00101 LUU11J 上還（b)中的蛍日質(zhì)~人丄甘成，也
~無(wú)甘成共綱媽.兇，冉進(jìn)仃生物表達(dá)得到。 上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端 連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0012]編碼所述HB1蛋白的基因（HB1基因）也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]所述基因可為如下（1)或(2)或(3)的DNA分子：
[0014] (1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；
[0015] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼氟磺胺草醚抗性相關(guān)蛋白的 DNA分子；
[0016] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%同源性且編碼與氟磺胺草醚抗性相關(guān)的蛋白的DNA分子。
[0017] 所述嚴(yán)格條件可為如下:在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC，0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0 · 1 % SDS各洗膜一次。
[0018] 含有所述HB1基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0019] 所述重組載體具體可為將所述HB1基因插入PACYC184載體得到的重組質(zhì)粒。所述 重組載體具體可為將所述HB1基因插入pACYC184載體的BamM酶切位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
[0020] 所述重組菌可為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌得到的重組菌。所述宿主菌可為大腸 桿菌，具體可為大腸桿菌JM109。
[0021] 本發(fā)明還保護(hù)一種培育重組微生物的方法，包括如下步驟:將所述HB1基因?qū)氤?發(fā)微生物，得到對(duì)氟磺胺草醚抗性高于所述出發(fā)微生物的重組微生物。所述HB1基因具體可 通過(guò)以上任一所述重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)微生物。所述出發(fā)微生物可為細(xì)菌，具體可為大 腸桿菌，更具體可為大腸桿菌JM109。
[0022]本發(fā)明還保護(hù)一種培育重組微生物的方法，包括如下步驟:將所述HB1基因?qū)氤?發(fā)微生物，得到對(duì)氟磺胺草醚的降解能力高于所述出發(fā)微生物的重組微生物。所述HB1基因 具體可通過(guò)以上任一所述重組載體導(dǎo)入所述出發(fā)微生物。所述出發(fā)微生物可為細(xì)菌，具體 可為大腸桿菌，更具體可為大腸桿菌JM109。
[0023] 本發(fā)明還保護(hù)所述HB1蛋白或所述HB1基因的應(yīng)用，為如下（cl)、（c2)、（C3)、（C4)、 (c5)和(c6)中的至少一種：
[0024] (cl)調(diào)控植物或微生物對(duì)氟磺胺草醚的抗性；
[0025] (c2)增加植物或微生物對(duì)氟磺胺草醚的抗性；
[0026] (c3)培育對(duì)氟磺胺草醚抗性增高的植物或微生物；
[0027] (c4)調(diào)控植物或微生物對(duì)氟磺胺草醚的降解能力；
[0028] (c5)增加植物或微生物對(duì)氟磺胺草醚的降解能力；
[0029] (c6)培育對(duì)氟磺胺草醚降解能力增高的植物或微生物。
[0030]所述微生物可為大腸桿菌，具體可為大腸桿菌JM109。
[0031]目前，玉米種植面積增加，氟磺胺草醚殘留藥害問(wèn)題對(duì)玉米種植產(chǎn)業(yè)的影響越來(lái) 越大。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建基因組文庫(kù)，從玉米中發(fā)現(xiàn)了抗氟磺胺草醚相關(guān)蛋白及其 編碼基因，為轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因微生物的研究提供重要的基因資源，可用于培育抗氟磺 胺草醚的轉(zhuǎn)基因作物品種或轉(zhuǎn)基因微生物，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為實(shí)施例3的結(jié)果。
[0033]圖2為實(shí)施例4的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。PACYC184質(zhì)粒:Fermentas公司。大腸桿菌JM109:天根生化科技有限公司。氟磺胺草 醚:江蘇常青農(nóng)藥有限公司。
[0035]氟磺胺草醚的結(jié)構(gòu)式如下：
[0036]
[0037] 采用高效液相色譜檢測(cè)氟磺胺草醚濃度。以氟磺胺草醚濃度為x(mg/L)，以峰面積 為y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。氟磺胺草醚濃度在〇 . 〇l-5mg/L范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 22085x+ 1276.9。氟磺胺草醚濃度在7.5-40mg/L范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y = 20620x+l 1511。
[0038] 實(shí)施例1、抗氟磺胺草醚蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)
[0039] 1、基因組DNA的提取
[0040] 取玉米自交系Lx347的種子，先用60°C溫水浸泡30min，再用0.6%多菌靈溶液浸泡 30min，用蒸餾水沖洗干凈后用安全劑NA(將商品藥NA稀釋200倍后使用)浸種12h，用蒸餾水 清洗干凈后置于溫度26.5 °C、濕度75 %的培養(yǎng)箱內(nèi)，催芽24h。
[0041] 取過(guò)20目篩的黑土，加入氟磺胺草醚并使其濃度為0.4mg/L，得到毒土。將lkg毒土 平均裝入3個(gè)盆中，每個(gè)盆播種7粒種子(臍部朝下），置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)（溫度27°C、濕 度75%、光照8小時(shí)/黑暗16小時(shí))培養(yǎng)。
[0042] 播種7天后，米用Fermentas公司GenomicDNA puritication kit提取基因組DNA。
[0043] 2、用限制性內(nèi)切酶BamM酶切pACYC184質(zhì)粒，回收約4.2kb的片段并進(jìn)行去磷酸 化。
[0044] 3、用限制性內(nèi)切酶Sau3AI酶切步驟1得到的基因組DNA，回收l(shuí)-6kb的片段。
[0045] 4、將步驟3回收的各個(gè)片段分別與步驟2的產(chǎn)物連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌JM109,得到各個(gè)重組菌。
[0046] 5、將步驟4得到的各個(gè)重組菌分別劃線于含5000mg/L、8000mg/L、10000mg/L、 15000mg/L或20000mg