專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其在仿刺參育苗過程中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌的分離及其在仿刺參育苗中的使用方法，該菌株能 有效抑制水產(chǎn)生物養(yǎng)殖過程海水中，弧菌等致病菌繁殖并能促進(jìn)仿刺參苗的生長。
背景技術(shù)：
目前，隨著高密度海水養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展和環(huán)境污染的加劇，養(yǎng)殖動物的病害已成 為我國乃至全世界海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問題。公認(rèn)的養(yǎng)殖動物的病害防治由藥物來控 制，由于抗生素的使用，養(yǎng)殖動物的生態(tài)環(huán)境受到破壞，養(yǎng)殖動物的生長受到抑制，食品安 全無法保障，因此抗生素的使用受到嚴(yán)格限制?；【鳛橹匾牟≡?，可引起多種海水養(yǎng) 殖品種的病害爆發(fā)。使用微生物制劑可以提高養(yǎng)殖動物的免疫力，抑制病原微生物，從而減 少疾病的發(fā)生，同時(shí)具有無殘毒、無抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所涉及枯草芽孢桿菌(編號Sn，保藏單位中國微生物菌種管理委員會普 通微生物中心；保藏日期2009年12月03日；保藏編號3498)，系2008年4月從大連海域 捕獲魚類腮部分離獲得。分離方法為取大連黑石礁海域捕獲的黑鮚(許氏平魷)活體， 剪取腮部勻漿，將勻漿置于80°C恒溫水浴中20分鐘后均勻涂布于LB培養(yǎng)基上，待長出 菌落后，在LB培養(yǎng)基上對菌落進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。純化后的菌落進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增測 序，經(jīng)過序列比對和生理生化鑒定，得到純化一株細(xì)菌，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。實(shí)驗(yàn)室對其檢測結(jié)果如下(1)形態(tài)特征菌體呈桿狀，革蘭氏陽性，可運(yùn)動，周生鞭毛。芽孢中生，橢圓形，孢子 囊不膨大，無伴孢晶體。在LB平板上，菌落淡乳白色，圓形，邊緣整齊，表面濕潤，菌落粘稠。 液體靜止培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生菌膜和菌環(huán)。(2)生理生化特征過氧化氫酶和接觸酶陽性，明膠液化，水解淀粉，能在3-7% NaCl及45°C下生長，可利用檸檬酸鹽、葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露醇，不能利用半乳糖、 鼠李糖、甲酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》等有關(guān)資料的描述，確定Sn菌 株屬于枯草芽孢桿菌。(3) 16SrDNA序列比對運(yùn)用通用引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到該菌的16SrDNA序列，將所得 結(jié)果在Genbank中進(jìn)行同源比對，結(jié)果Sn菌株與Bacillus subtilis d的16SrDNA序列的 同源性達(dá)到100%，說明Sn菌株屬于枯草芽孢桿菌。(4)Sn菌株的抑菌特征用牛津杯法檢測Sn菌株對刺參的主要病原菌哈氏弧菌 (Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(V. alginolyticus)和燦爛弧菌(V. splendidus)的抑菌性，結(jié) 果顯示，Sn菌株對上述3種弧菌均產(chǎn)生抑菌圈，即Sn菌株對這些病原有抑制作用。在海參育苗中，通過大量實(shí)踐和科學(xué)化研究觀察，Sn能抑制有害微生物的增殖，特 別是抑制海洋弧菌等致病菌的繁殖，由此達(dá)到防治疾病和提高海參苗免疫力的目的。通過 這種芽孢桿菌的使用，不但避免了病原菌耐藥性的產(chǎn)生和藥物的殘留，而且菌體本身就是海參苗的餌料，具有促進(jìn)海參苗的生長及提高海參苗產(chǎn)品質(zhì)量的效果，更科學(xué)，更環(huán)保。同 時(shí)本發(fā)明可以廣泛運(yùn)用于漁業(yè)的養(yǎng)殖和生產(chǎn)的其他環(huán)節(jié)，可以降解，轉(zhuǎn)化，代謝養(yǎng)殖和生產(chǎn) 過程中的代謝產(chǎn)物，營造良好的生態(tài)環(huán)境，改良、保全、修復(fù)水資源的生態(tài)環(huán)境，達(dá)到消減自 身污染，減少藥物損害，降低成本，減輕養(yǎng)殖業(yè)對整體生態(tài)環(huán)境的污染，提高養(yǎng)殖產(chǎn)品品質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在育苗過程中根據(jù)仿刺參不同 發(fā)育階段的生活特點(diǎn)，采取不同的方式使用該菌。在仿刺參浮游幼體階段使用該菌時(shí)，向仿 刺參幼體培育池中均勻潑灑該菌菌液，菌液使用量為20ml/m3，以達(dá)到抑制致病菌并促進(jìn)仿 刺參幼體生長發(fā)育的目的。在參苗附著變態(tài)后，以膨潤土為載體，將菌液與膨潤土充分混合 后，將混合物投入?yún)⒚缗嘤貎?nèi)，菌液使用量為20ml/m3，菌液與膨潤土的比例為3 1。上述枯草芽孢桿菌Sn采用液體發(fā)酵技術(shù)制成菌液，其活菌含量大于IO9CfuAil。上 述載體為粒徑小于200目的鈣基膨潤土，市場有售。本發(fā)明的有益效果是枯草芽孢桿菌Sn能抑制海洋弧菌等致病菌的生長，同時(shí)該 菌也為參苗提供營養(yǎng)，對促進(jìn)海參苗生長發(fā)育效果顯著。仿刺參幼體浮游階段，個(gè)體浮游于 培育水體中，直接潑灑菌液能使菌體均勻分布于水體中，直接抑制水體中的致病菌并能被 仿刺參幼體攝食；而仿刺參幼體附著后，主要棲息于附著基上。膨潤土對細(xì)菌有吸附作用， 以膨潤土為載體，可以使菌體快速沉降到附著基上，在抑制附著基上致病菌繁殖的同時(shí)容 易被仿刺參攝食。本發(fā)明具有實(shí)際操作性強(qiáng)，工藝簡便，將漁業(yè)養(yǎng)殖中的代謝產(chǎn)物和有害物質(zhì)快速 代謝，同時(shí)提供養(yǎng)殖過程中所需的營養(yǎng)成分，起到環(huán)保和節(jié)約的雙層效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1在海參育苗的浮游幼體階段，能有效抑制弧菌等致病菌及促進(jìn)海參苗生長的枯草 芽孢桿菌(Sn)單獨(dú)使用方法是將上述枯草芽孢桿菌Sn制成活菌含量大于109CfU/ml的 菌液，均勻潑灑到海參浮游幼體培育池中，測量海參浮游幼體的生長情況并用TCBS培養(yǎng)基 檢測弧菌數(shù)量。試驗(yàn)設(shè)計(jì)、管理、測定與結(jié)果選用剛孵化出的海參浮游幼體，隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行樣。分別為 空白組、Sn益生菌組。養(yǎng)殖池為0. 4m3/個(gè)的水槽，海參浮游幼體餌料按海洋酵母2_;3ml/m3 投喂，各試驗(yàn)組投喂量及其它試驗(yàn)條件相同，每日投喂1次。水溫20-22°C，鹽度31-32%0， ρΗ7· 9-8. 15溶解氧5. 4-7. lmg/L，氨氮20_60mg/m3。每天換水1/3量。試驗(yàn)日期為6天，測 定其起始、終止每池海參浮游幼體體長及水中弧菌量。A枯草芽孢桿菌Sn組海洋酵母2-;3ml/m3投喂，Sn益生菌每天按20ml/m3投喂。B空白組海洋酵母2_;3ml/m3投喂。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示A組海參浮游幼體平均體長增長率顯著高與B組(P < 0.01)，體 長增長率比對照組高13. 4個(gè)百分點(diǎn)，并提前2天進(jìn)入變態(tài)期。A組弧菌量顯著低與B組(P < 0. 01)，僅為B組弧菌量的1/200。說明枯草芽孢桿菌Sn及其這種使用方法，能有效抑制 弧菌等致病菌的繁殖并可促進(jìn)海參浮游幼體的生長。實(shí)施例1數(shù)據(jù)
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌，能有效抑制弧菌等致病菌并促進(jìn)仿刺參苗的生長發(fā)育。其特征 是在仿刺參浮游幼體階段(小耳幼體初期到大耳幼體后期)和附著后階段均可使用該菌， 有效抑制水產(chǎn)生物養(yǎng)殖過程海水中，弧菌等致病菌繁殖并能促進(jìn)仿刺參苗的生長。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽桿菌，菌株來至大連海域捕獲魚類腮部提取純化獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌可應(yīng)用于仿刺參育苗過程中，其特征是在仿 刺參浮游幼體階段使用該菌時(shí)，向仿刺參幼體培育池中均勻潑灑該菌菌液，菌液濃度大于 IX IO9CfuAil，菌液使用量為20ml/m3，以達(dá)到抑制致病菌并促進(jìn)仿刺參幼體生長發(fā)育的目 的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌可應(yīng)用于仿刺參育苗過程中，其特征是在仿 刺參附著后階段，以膨潤土為載體，將菌液與膨潤土充分混合后，將混合物投入?yún)⒚缗嘤?內(nèi)，菌液濃度大于lX109cfu/ml，菌液使用量為20ml/m3，菌液與膨潤土的比例為3 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌的分離及其在仿刺參育苗中的應(yīng)用方法，能有效抑制弧菌等致病菌繁殖并促進(jìn)海參苗的生長。該菌株從大連海域捕獲魚類腮部分離獲得，經(jīng)中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號3498。本發(fā)明可以廣泛運(yùn)用于漁業(yè)的養(yǎng)殖和生產(chǎn)環(huán)節(jié)，可以降解，轉(zhuǎn)化，代謝養(yǎng)殖和生產(chǎn)過程中的代謝產(chǎn)物，營造良好的生態(tài)環(huán)境，改良、保全、修復(fù)水資源的生態(tài)環(huán)境，達(dá)到消減自身污染，減少藥物損害，降低成本，減輕養(yǎng)殖業(yè)對整體生態(tài)環(huán)境的污染，提高養(yǎng)殖產(chǎn)品品質(zhì)。
文檔編號A01N63/02GK102134558SQ20101010030
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者劉衛(wèi)東, 周遵春, 王軍, 王志松, 蘇浩, 鮑相勃 申請人:遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院