專利名稱：前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物資源和基因工程領(lǐng)域，具體涉及前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生環(huán)噻唑霉素類似物及其方法和用途。
背景技術(shù)：
抗生素(antibiotics)是由微生物(包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬)或者高等動(dòng)植物在生活過程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或者其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。20世紀(jì)40年代，青霉素應(yīng)用于臨床標(biāo)志著抗生素的誕生。自 1擬8年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗生素——青霉素以來，科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近萬種抗生素，它們中的絕大多數(shù)都是毒性太大，不適合作為治療人類和牲畜傳染病的藥品，不過臨床應(yīng)用的抗生素已有達(dá)近百種之多，有些能夠抑制微生物的生長，有些能夠抑制寄生蟲的繁殖，有些能夠用來除草，有些能夠用來治療心血管疾病，還有些能夠抑制人體免疫反應(yīng)，用作人體器官移植手術(shù)中，所以，正是由于抗生素的存在，使得人類能夠戰(zhàn)勝了一次次的感染性疾病，保持健康。20世紀(jì)60年代末，伴隨著抗生素和疫苗在全球范圍內(nèi)的快速普及與發(fā)展，感染性疾病逐漸被人類控制住，到1988年時(shí)，感染性疾病甚至被控制在美國死亡率最高的10大疾病之外。然而，也從那時(shí)起，隨著抗生素的濫用，抗生素耐藥問題逐漸呈現(xiàn)在人類面前，但是當(dāng)時(shí)這些問題被未被人類所重視，這直接導(dǎo)致感染性疾病卷土從來，成為死亡率第三高的疾病，更令人恐怖的是濫用和錯(cuò)用抗生素導(dǎo)致的抗生素耐藥性催生了 “超級細(xì)菌”，即所有已經(jīng)的抗生素都對其無效。目前，抗生素耐藥性已經(jīng)成為了“全球威脅”，這也更加促進(jìn)了人類對新型抗生素的研究與發(fā)展，尤其是抗高耐藥性致病菌的抗生素新藥的研究承擔(dān)著拯救人類的責(zé)任。在眾多新型抗生素之中，硫肽類抗生素憑借著十分獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征已經(jīng)極富潛力的應(yīng)用價(jià)值，受到了包括各國科學(xué)家在內(nèi)的全世界人民的廣泛關(guān)注。硫肽類抗生素是一類源于微生物，富含硫元素、結(jié)構(gòu)被高度修飾的重要天然產(chǎn)物， 到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)80余種。盡管它們存在著整體上的結(jié)構(gòu)差異，但是它們共同具有典型的結(jié)構(gòu)特征(1)硫肽類抗生素都富含經(jīng)高度修飾且含有硫的環(huán)形(macrocyclic)多肽；(2)在空間結(jié)構(gòu)的中心位置上是一個(gè)被三位或者四位噻唑環(huán)取代的含氮雜環(huán)(如吡啶 pyridine和脫水哌啶dehydrapiperidine) ； (3)在這個(gè)中心雜環(huán)的周圍分布著眾多個(gè)被修飾過的異分子環(huán)狀氨基酸殘基(heterocyclic residues)，其中包括噻唑(thiazoles)， 噁唑(oxazoles)，和脫氫氨基酸(dehydroamino acids) [Chem Rev (2005) 105，685-714]。 除了這些諸多的結(jié)構(gòu)共性之外，大多數(shù)硫肽類抗生素在生物活性方面也有著共同的特點(diǎn) (1)硫肽類抗生素在醫(yī)藥與農(nóng)業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，硫鏈絲菌素(thiostr印ton)能夠抑制核糖體合成蛋白[J Mol Biol (1998) 276，391-404]，還能誘導(dǎo)TipA蛋白的大量合成[J Bacteriol (1989) 171，1459-1466] ； (2)環(huán)噻唑霉素(cyclothiazomycin)則是一種具有潛在應(yīng)用前景的腎素抑制劑(renin inhibitor)，與此同時(shí)對水稻胡麻等農(nóng)作物致病真菌也有抑制殺菌的作用[J Antibiot (1991) 44, 582-8 ；Bioorg Med Chem(2006) 14,8259-70] ； (3)在已經(jīng)的硫肽類抗生素中有相當(dāng)多的抗生素對各種高耐藥性致病菌 tt ^ W Φ M # ffl， 1MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,)， PRSP(penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae)禾口VRE(vancomycin-resistant enterococci) [Chem Rev (2005) 105,685-714 ；Chem Biol (2009) 16，141-147]。這特點(diǎn)極大地激發(fā)了各國科學(xué)家對硫肽類抗生素的研究熱情，使得科學(xué)家對能研制出抗高耐藥性致病菌株的新藥充滿信心。近些年來，全球的科學(xué)家一直在關(guān)于硫肽類抗生素的一系列有趣的問題，包括普通的氨基酸殘基是通過哪些酶的哪種生化反應(yīng)形成如此復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)的，又是如何呈現(xiàn)出如此不同的生物活性的。有機(jī)化學(xué)家立志于通過有機(jī)人工合成的方法在體外合成之中高修飾的多肽[Angew Chem Int Ed Engl Q007) 46，7930-7卯4]，而生物學(xué)家對于硫肽類抗生素的研究也在09年開始有重大突破性進(jìn)展。國內(nèi)外幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)釣取了硫肽類抗生素生物合成基因簇，實(shí)現(xiàn)了零的突破。此類抗生素的生物合成機(jī)制正在被一步步地揭開。 隨著基因組測序技術(shù)的不斷發(fā)展，我們相信硫肽類抗生素的研究將不斷地深入，揭開困擾著科學(xué)家的諸多問題的謎底，從而為人類研制出新型的抗高耐藥性致病菌株的新藥奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。環(huán)噻唑霉素(Cyclothiazomycin，CLT)于1991 年由日本科學(xué)家從 Sti^ptomyces sp.NR0516分離得到[J Antibiot (1991) 44，582-8]，在硫肽類抗生素之中算是發(fā)現(xiàn)時(shí)間較晚的抗生素。它是一種成橋狀的多環(huán)硫肽類抗生素，體外毒理實(shí)驗(yàn)顯示其具有抑制人類細(xì)胞高血壓蛋白酶原(human plasma renin)活性，IC50 = 1. 7mM。從分子結(jié)構(gòu)上相比較與其他硫肽類抗生素，它具有眾多結(jié)構(gòu)上的獨(dú)特性(1)唯一擁有三環(huán)結(jié)構(gòu)的硫肽類抗生素； (2)擁有非2，3-位噻唑取代的中心吡啶環(huán)；(3)游離的羧基端因?yàn)榱蛎焰I的存在而呈現(xiàn)出半游離狀態(tài)，分子內(nèi)并非都是硫肽中普遍存在的噻唑環(huán)，而是包含了 3個(gè)噻唑環(huán)和3個(gè)噻唑啉；(4)擁有叔碳位上的一個(gè)硫醚鍵。正是由于環(huán)噻唑霉素?fù)碛腥h(huán)結(jié)構(gòu)以及含有多個(gè)噻唑環(huán)或者噻唑啉，使得其溶解性較低，給科學(xué)家解析其空間結(jié)構(gòu)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。2006 年，日本科學(xué)家通過NMR的方法成功地描述出環(huán)噻唑霉素的立體結(jié)構(gòu)，并且發(fā)酵產(chǎn)物中分離出了兩種不同構(gòu)象的環(huán)噻唑霉素的衍生異構(gòu)物Bl和B2，他們發(fā)現(xiàn)這兩種衍生異構(gòu)物在固體狀態(tài)下非常的穩(wěn)定，但是在溶液中能夠相互轉(zhuǎn)化，只是轉(zhuǎn)化速度非常的緩慢[Bioorg Med Chem (2006) 14，8259-70]。并且，他們還發(fā)現(xiàn)，環(huán)噻唑霉素是一種RNA聚合酶的抑制劑 [Bioorg Med Chem(2006) 14,8259-70] 0此外，由于環(huán)噻唑霉素的結(jié)構(gòu)特殊性，結(jié)構(gòu)化學(xué)家對于體外合成類似的分子也產(chǎn)生了濃厚的興趣[Org Lett 0004)6 :3401-4]。2009年，上海交通大學(xué)王絳博士從吸水鏈霉菌應(yīng)城變種10-22基因組文庫中成功地釣到陽性的柯絲質(zhì)粒(cosmid)，其中包含著一小段DNA序列編碼60aa的一個(gè)多肽， 其中C端的ISaa的序列與環(huán)噻唑霉素的結(jié)構(gòu)氨基酸序列完全一致，并且通過后續(xù)的生物活性測試以及LC-EI-Q-TOF分子量檢測分析和MS/MS碎片分析都能證明5102-11抗生素就是環(huán)噻唑霉素。此外，通過構(gòu)建多個(gè)異源表達(dá)載體，首次在鏈霉菌模式菌株變鉛青鏈霉菌(Sti^ptomyces lividans) 13 中成功實(shí)現(xiàn)硫肽類抗生素的異源表達(dá)，并且通過不同的 ORF組合定位了一個(gè)完整的環(huán)噻唑霉素生物合成基因簇，包含了 15個(gè)ORFs、長度為22. 7kb 的DNA序列，通過生物信息學(xué)分析表明其中唯一的結(jié)構(gòu)基因cltA編碼產(chǎn)生環(huán)噻唑霉素的前體，這個(gè)前體多肽通過基因簇中所表達(dá)的其他蛋白進(jìn)行翻譯后修飾，最后成熟后被釋放到細(xì)胞外部[AEM (2010) p. 2335-2344]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種前體基團(tuán)突變產(chǎn)生環(huán)噻唑霉素類似物及其方法和用途。本發(fā)明是一種利用點(diǎn)突變和異源表達(dá)獲得新型環(huán)噻唑霉素類似物的方法及其應(yīng)用；通過選擇點(diǎn)突變了環(huán)噻唑霉素前體肽7個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基，然后通過在鏈霉菌的模式菌株變鉛青鏈霉菌Mi^ptomyces lividans 13 中的異源表達(dá)，獲得了 14個(gè)突變株，產(chǎn)生了 23種新型環(huán)噻唑霉素類似物，其中，有6個(gè)突變株的產(chǎn)物對玉米小斑 (Bipolaris maydis)的生長有抑制作用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，是通過以下方法獲得的通過在環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA內(nèi)插入兩個(gè)BglII和SpeI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；用突變引物與雙酶切產(chǎn)物相連接構(gòu)建來實(shí)現(xiàn)原位點(diǎn)突變環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA ； 然后通過在鏈霉菌的模式中的異源表達(dá)獲得環(huán)噻唑霉素類似物。優(yōu)選的，所述在環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA內(nèi)插入兩個(gè)BglII和SpeI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的方法，具體包括如下步驟(1)選用pMD-18T載體，與PCR擴(kuò)增出來含有環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA的部分環(huán)噻唑霉素基因簇的31Λ片段相連接，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的片段兩端含有限制性內(nèi)切酶SnaBI和 SacI酶切位點(diǎn)，切下再與PJTU4892相連接；(2)通過PCR-Targeting的方法將質(zhì)粒pJTU4892中的aac (3) IV阿泊拉霉素抗性基因替換成neo卡那霉素抗性基因，得到質(zhì)粒PJTU4895 ；(3)用限制性內(nèi)切酶SnaBI和SacI從含有BglII和SpeI識(shí)別位點(diǎn)的重組質(zhì)粒PMD-18T-31A切下31Λ的片段，與用限制性內(nèi)切酶SnaBI和McI酶切處理過的載體 PJTU4895相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，獲得還有限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI識(shí)別位點(diǎn)的質(zhì)粒 PJTU4896 ；(4)用XbaI和EcoRI酶切處理ρJTU4896的片段與用XbaI和EcoRI酶切處理 PSET152的片段連接構(gòu)建得到質(zhì)粒PJTU4897，該質(zhì)粒pJTU4897含有aac (3) IV阿泊拉霉素抗性基因，并且含有限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI識(shí)別位點(diǎn)。優(yōu)選的，所述原位點(diǎn)突變環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA具體為突變了環(huán)噻唑霉素前體肽基因的7個(gè)位點(diǎn)中任一位點(diǎn)或兩位點(diǎn)的氨基酸殘基，所述7個(gè)位點(diǎn)為C3、T4、S5、T6、 G7、T8 禾口 P9 位。優(yōu)選的，所述異源表達(dá)是在鏈霉菌的模式菌株變鉛青鏈霉菌Mi^ptomyces lividans 1326中的異源表達(dá)。優(yōu)選的，所述環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為C3S、T4D、T6D、T6V、T6G、T6S、T6C、 G7A、G7S、T8D、T8S、P9H、P9A 或 T68D。優(yōu)選的，所述環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為T6D，T6S，T6V，T6G，T8S或P9A。優(yōu)選的，所述環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為T6S，T6V，T6G或T8S。優(yōu)選的，所述環(huán)噻唑霉素類似物的結(jié)構(gòu)式為式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式 (V)所示，
權(quán)利要求
1.一種前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，是通過包括以下步驟的方法獲得的在環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA內(nèi)插入兩個(gè)BglII和SpeI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)；用突變引物與雙酶切產(chǎn)物相連接構(gòu)建來實(shí)現(xiàn)原位點(diǎn)突變環(huán)噻唑霉素前體肽基因 cltA;然后通過在鏈霉菌的模式中的異源表達(dá)獲得環(huán)噻唑霉素類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，所述在環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA內(nèi)插入兩個(gè)BglII和SpeI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的方法，具體包括如下步驟(1)選用PMD-18T載體，與PCR擴(kuò)增出來含有環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA的部分環(huán)噻唑霉素基因簇的31Λ片段相連接，PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的片段兩端含有限制性內(nèi)切酶SnaBI和 SacI酶切位點(diǎn)，切下再與PJTU4892相連接；(2)通過PCR-Targeting的方法將質(zhì)粒pJTU4892中的aac(3) IV阿泊拉霉素抗性基因替換成neo卡那霉素抗性基因，得到質(zhì)粒PJTU4895 ；(3)用限制性內(nèi)切酶SnaBI和McI從含有BglII和SpeI識(shí)別位點(diǎn)的重組質(zhì)粒 pMD-18T-3kb切下31Λ的片段，與用限制性內(nèi)切酶SnaBI和McI酶切處理過的載體 PJTU4895相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，獲得還有限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI識(shí)別位點(diǎn)的質(zhì)粒 PJTU4896 ；(4)用XbaI和EcoRI酶切處理pJTU4896的片段與用XbaI和EcoRI酶切處理pSET152 的片段連接構(gòu)建得到質(zhì)粒PJTU4897，該質(zhì)粒pJTU4897含有aac C3) IV阿泊拉霉素抗性基因， 并且含有限制性內(nèi)切酶BglII和SpeI識(shí)別位點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素抗生素類似物，其特征在于，所述原位點(diǎn)突變環(huán)噻唑霉素前體肽基因cltA具體為突變了環(huán)噻唑霉素前體肽基因的7 個(gè)位點(diǎn)中任一位點(diǎn)或兩位點(diǎn)的氨基酸殘基，所述7個(gè)位點(diǎn)為C3、T4、S5、T6、G7、T8和P9位。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，所述異源表達(dá)是在鏈霉菌的模式菌株變鉛青鏈霉菌Mi^ptomyces lividans 13 中的異源表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，所述環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為C3S、I^D、T6D、T6V、T6G、T6S、T6C、G7A、G7S、T8D、T8S、 P9H、P9A 或 T68D。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，所述環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為T6D，T6S，T6V，T6G，T8S或P9A。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，所述環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為T6S，T6V，T6G或T8S。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物，其特征在于，所述環(huán)噻唑霉素類似物的結(jié)構(gòu)式為式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)所示，
9.權(quán)利要求6所述的環(huán)噻唑霉素類似物在制備抑制玉米小斑生長的抑制劑中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備抑制玉米小斑生長的抑制劑中的用途，其特征在于所述抑制劑采用的環(huán)噻唑霉素類似物對應(yīng)的突變株為T6S，T6V，T6G或T8S。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種前體肽基團(tuán)突變產(chǎn)生的環(huán)噻唑霉素類似物及其用途。本發(fā)明選擇點(diǎn)突變了環(huán)噻唑霉素前體肽7個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基，然后通過在鏈霉菌的模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans 1326中的異源表達(dá)，獲得了14個(gè)突變株，產(chǎn)生了23種新型環(huán)噻唑霉素類似物抗生素，其中，有6個(gè)突變株的產(chǎn)物對玉米小斑(Bipolaris maydis)的生長有抑制作用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅讓構(gòu)建突變株過程變得快速有效，能獲得隨機(jī)突變株，而且通過環(huán)噻唑霉素突變株生成的產(chǎn)物，能進(jìn)行生物合成機(jī)制的研究，給硫肽類抗生素生物合成機(jī)制的研究提供了更加豐富的方法和手段。最重要的是，獲得的眾多新型的硫肽類抗生素，為人工設(shè)計(jì)合成新型硫肽類抗生素開辟了道路。
文檔編號A01P21/00GK102532275SQ20111032465
公開日2012年7月4日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者殷俊, 鄧子新, 鄔益鳴, 黃曦 申請人:上海交通大學(xué)