專利名稱：一個簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Blumeria graminis DC f. sp. tritici)引起的小麥白粉病是中國和世界上許多國家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴重的病害之一。從一葉期到衰老，植株都能被白粉菌侵染。早期的侵染可使分蘗減少，上部葉片和穗部晚期的侵染能嚴重減少籽粒產(chǎn)(20 % -33 % )。白粉病雖然能用殺菌劑防治，但必然增加人力、物力投入，而且還會引起環(huán)境污染等生態(tài)問題，因此培育和推廣抗病品種已被公認為是防治小麥白粉病最為經(jīng)濟、安全和有 效的途徑，而抗病遺傳背景和抗病機理的研究則是制定抗病育種策略的重要依據(jù)。明確其抗病機制，克隆抗病相關(guān)基因，對于防治小麥病害、開展抗病育種改良具有重要理論指導意義。小麥抗病分子機制是目前小麥白粉病研究的熱點課題。白粉病病原菌與寄主小麥之間的互作關(guān)系十分復雜。分析病原菌-寄主互作過程中的基因表達情況，有助于發(fā)掘抗病基因和發(fā)現(xiàn)抗病通路，并進一步闡明抗病的分子機制。通過構(gòu)建受白粉病菌誘導表達的cDNA文庫、SSH文庫，利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)等，篩選出了可能與白粉病抗性相關(guān)的基因或蛋白，包括各種病程相關(guān)蛋白、絲氨酸-蘇氨酸激酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等，也發(fā)現(xiàn)了水楊酸途徑、雙氧水途徑等信號通路與白粉病抗性關(guān)。二倍體簇毛麥是高抗白粉病的小麥遠緣物種，其抗病基因Pm21位于6V上，本實驗室前期研究表明Hv-CMPG與簇毛麥的白粉病相關(guān)，該基因是一個E3連接酶，參與泛素化過程降解結(jié)合目標底物蛋白。研究像Hv-CMPG這類E3連接酶的底物結(jié)合蛋白及信號傳導途徑是近年來的研究熱點。研究利用酵母雙雜交技術(shù)，將Hv-CMPG作為誘餌，利用聚乙二醇-醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，篩選受白粉菌誘導的簇毛麥酵母雙雜交cDNA文庫，得到Hv-CMPG的一個互作基因HV-FP3，該基因是一個金屬轉(zhuǎn)運蛋白，在簇毛麥葉片中受白粉菌誘導上調(diào)表達；利用基因槍技術(shù)將其轉(zhuǎn)化感白粉病小麥品種揚麥158中，以期提高白粉病抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3。本發(fā)明的另一目的是提供該基因的表達載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3,來自二倍體簇毛麥(Haynaldia villosa, VV,2n=14),可以和白粉病抗性相關(guān)基因Hv-CMPG互作，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。該受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)HV-FP3，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
含有所述的金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因Hv-FP3的表達載體。所述的含有金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因Hv-FP3的表達載體優(yōu)選以PBI220為出發(fā)載體，將所述的HvFP3基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。所述的金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因Hv-FP3在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。所述的含金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因Hv-FP3的表達載體在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次從簇毛麥中克隆得到了一個和白粉病抗性相關(guān)基因Hv-CMPG互作的金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3及其所編碼的蛋白質(zhì)HV-FP3，為簇毛麥中首次報道。將其插入表達載體pBI220，得到的該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小 麥品種對白粉病的抗性。HV-FP3用于基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，能夠提高小麥的白粉病抗性。


圖1利用酵母雙雜交克隆Hv-CMPG的互作基因Hv_FP3，上行為SD_LT培養(yǎng)基，下行為 SD-HLT 培養(yǎng)基；從左至右分別為 pGADT7+pGBKT7、pGBKT7 :CMPG+pGADT7、pGADT7 FP3+pGBKT7、pGBKT7 CMPG+pGADT7 :FP3。圖2Hv-FP3在二倍體簇毛麥白粉菌誘導后的葉片中的實時熒光定量RT-PCR分析X軸0h、45min、lh、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h分別表示簇毛麥葉片受白粉菌誘導的不同時間段^軸Hv-FP3基因在不同樣品中受白粉菌誘導前后的表達倍數(shù)。圖3HV-FP3轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建圖譜圖4HV-FP3基因轉(zhuǎn)化揚麥158的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子鑒定結(jié)果泳道I為Marker，泳道2為水空白對照，泳道3為未轉(zhuǎn)化揚麥158對照，泳道9為包含目的基因的質(zhì)粒，泳道4-8依次為陽性轉(zhuǎn)化植株Tq-10-2、Tq-17-3、Tq-27-3、Tq-32-1、T0_39_3 ο圖5HV-FP3基因轉(zhuǎn)化揚麥158的Ttl代陽性植株Q-RT-PCR分析結(jié)果X 軸Υ158, T0-l-4, Τ0-10-2, Τ0-17-3, Τ0-27-3, T0-32-l, T0-39-3 為陽性轉(zhuǎn)化植株，T0-l-4為陰性轉(zhuǎn)化植株，揚麥158為轉(zhuǎn)基因受體小麥；￥軸Hv-FP3基因在轉(zhuǎn)基因植株中相對于揚麥158的表達倍數(shù)。
具體實施例方式實施例1利用酵母雙雜交克隆金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HvFP3二倍體簇毛麥(參考文獻齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源一基因Pm21，作物學報，1995，21 (3) :257-262)是高抗白粉病的材料。Hv-CMPG是南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所克隆的一個位于二倍體簇毛麥6V上的白粉病抗性相關(guān)基因(劉圓.簇毛麥Hv-CMPG基因克隆及其功能初步分析[D].南京.南京農(nóng)業(yè)大學，2007)，以Hv-CMPG為誘餌，用聚乙二醇-醋酸鋰轉(zhuǎn)化法篩選酵母雙雜交cDNA文庫，得到一個Hv-CMPG的互作基因(附圖1)。對該互作基因測序，獲得了大小為702bp的序列，序列如SEQ ID NO.1所示。通過NCBI網(wǎng)站中的ORFfinder搜索該獲得序列的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)其包含一個全長ORF的基因，其中5’-UTR (非翻譯區(qū))72bp、3’-UTR174bp、0RF (開放閱讀框)456bp，編碼151個氨基酸，序列如SEQ IDNO. 2所示，將該基因命名為Hv-FP3。實施例2HV-FP3基因受白粉菌誘導的表達特征把抗白粉病的簇毛麥種子(參考文獻齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源-基因卩11121，物學報，1995，21 (3) :257-262)播于培養(yǎng)皿中發(fā)芽，露白后移栽到盆缽(周圍用圓柱狀透明塑料片隔離，頂端用濾紙封閉，形成無白粉菌的環(huán)境)。待三葉期，把在感病品種蘇麥三號上培養(yǎng)的南京本地混合白粉菌新鮮孢子輕輕抖落在簇毛麥的幼苗上。接種白粉菌后的簇毛麥葉片保存在161。接種后011、451^11、111、211、411、611、1211、2411、4811、7211取樣，置于一70°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｓ肨RIZOL (InvitiOgen)提取受白粉菌誘導的簇毛麥葉片的RNAjlJ用AMV酶(Takara)合成反轉(zhuǎn)錄第一鏈,得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。應(yīng)用能特異擴增Hv-FP3 的特異引物 P1(TGGATCACCTCTCTGATTTGTG(SEQ IDNO. 3))和P2(TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQ IDNO. 4))，對該基因在受白粉菌誘導樣品中進行實時熒 光定量PCR (Q-RT-PCR)分析。PCR反應(yīng)在實時熒光定量PCR儀(MylQ，Bio-Rad, USA)上擴增并檢測熒光。20 μ I PCR 反應(yīng)體系中含 2 X SYBR Green PCR Master MixlO μ 1,0. 4nmol/μ I引物Pl和P2，上述獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ I。擴增參數(shù)為95°C lOmin，然后95°C 15s、56°C 30s，72°C lmin，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進行溶解曲線的測定。檢測基因表達水平定量用MyiQ系統(tǒng)軟件進行分析。結(jié)果表明，在簇毛麥葉片中HV-FP3受白粉菌誘導上調(diào)表達，2h后表達水平達到峰值，之后開始下調(diào)。Q-RT-PCR的結(jié)果表明，Hv-FP3可能與白粉病抗性相關(guān)(附圖2)。實施例3HV-FP3正義表達載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化普通小麥揚麥158利用上述經(jīng)白粉菌誘導后的簇毛麥cDNA為模板，以可擴增HV-FP3基因蛋白編碼區(qū)的引物對 P3 (CGGGATCCATGGGCGCCTTGGATCACCT (SEQ ID NO. 5))和 P4(GGGGTACCTCACATGACGGTGCAGGCGTC SEQ ID NO. 6))進行 PCR 擴增，回收擴增片段。用 BamHI和KpnI雙酶切將擴增目標片斷插入到載體pBI220 (Jefferson RA, Kavanagh TA, BevanMW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusionmarker inhigherplants. EMBO J. 1987, 6:3901-3907.)的 35s 啟動子后面的多克隆位點BamHI和KpnI之間。由此將目標基因Hv_FP3克隆到強啟動子35s的下游，獲得表達載體pBI220:FP3 (附圖 3)。將構(gòu)建好的過量表達載體通過基因槍法轉(zhuǎn)化揚麥158，挑選2800個幼胚愈傷進行基因槍轟擊，轟擊前在高滲培養(yǎng)基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2, 4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，pH5. 8)上預處理4小時，轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)16小時。之后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復培養(yǎng)基(1/2MS (只有大量元素減半的MS) +水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培養(yǎng)2周，再將其轉(zhuǎn)移至含有除草劑的篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+2，4-Dlmg/L+ 蔗糖 30g/L+4mg/L Bialaphos, pH5. 8)，篩選培養(yǎng)2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 I mmol/L+水解酪蛋白 200mg/L+KTlmg/L+IAA0. 5mg/L+鹿糖 30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)進行分化，待分化芽長至2-4cm時將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(l/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)中。至再生苗長約8cm、根系較健壯時，即可開管煉苗1_2天，最后洗去根系攜帶的培養(yǎng)基殘渣便可移栽入盆缽，獲得再生植株共190株。
提取所有再生植株基因組DNA，對轉(zhuǎn)化植株利用載體上啟動子引物P5(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC (SEQ ID NO. 7))和基因內(nèi)部引物 P6 (AGTCCATCTTCACCTTGATGTTC(SEQ ID NO. 8))進行PCR擴增，以鑒定陽性植株。PCR程序10_50ng/μ I基因組DNA模板，ΙΟμΜ 的 5’引物和 3’引物各 O. 5μ I ；2. 5μ IlOXbuffer ；2. 5μ 12. 5mM 的 dNTP ；1. 5μ 125mM^Mg2+ ；0. 25μ I (5U/ μ l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25 μ I。PCR 反應(yīng)條件為94°C預變性 3min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng) 8% 的聚丙烯凝膠電泳檢測。其中5株可以擴增約510bp的目的條帶，初步鑒定為陽性植株，株系編號依次為1^-10-2,1^-17-3,1^-27-3,1^-32-1,1^-39-3 (附圖 4)。選取成株期的陽性轉(zhuǎn)基因植株，利 用隨機挑選的陰性轉(zhuǎn)基因植株Tfl-4以及轉(zhuǎn)基因受體揚麥158作為陰性對照植株，提取葉片總RNA，利用Hv-FP3基因的特異引物Pl和P2，進行Q-RT-PCR分析。結(jié)果表明與對照揚麥158相比，T0-1-4植株中的Hv_FP3基因的表達量沒有顯著變化；Tq-10-2、Tq-32-1植株中的Hv-FP3基因的表達量上調(diào)了約2. 3-2. 9倍；T0-39-3植株中的Hv-FP3基因的表達量上調(diào)約5. 8倍；TQ-17-3植株中的Hv_FP3基因的表達量上調(diào)約8. 7倍，植株1-27-3中Hv-FP3基因的表達量上調(diào)了約14倍。(附圖5)。實施例4轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定用江蘇南京地區(qū)田間采集的白粉病菌混合菌種同時接種Ttl代轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)基因受體品種揚麥158，進行苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定。抗性鑒定標準采用“0-9級”白粉病抗性反應(yīng)型的分級標準，0-2級為高抗、3-4級為中抗、5級以上為感病。苗期離體抗性鑒定的兩次重復結(jié)果表明揚麥158和陰性轉(zhuǎn)基因植株Tc1-H表現(xiàn)為中感或高感；陽性轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為高抗。苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定結(jié)果基本一致(表I)。表I轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定
權(quán)利要求
1.一個簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3，其特征在于其CDNA序列如SEQ ID NO.1所/Jn ο
2.權(quán)利要求1所述金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其氨基酸序列如 SEQID NO. 2 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3的表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因HV-FP3的表達載體是以PBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的Hv-FP3基因插入pBI220的BamHI 和KpnI酶切位點間所得。
5.權(quán)利要求1所述的金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因Hv-FP3在培育抗白粉病和/或抗赤霉病小麥品種中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3或4所述的含金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因Hv-FP3的表達載體在培育抗白粉病和 /或抗赤霉病小麥品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。Hv-FP3的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。該基因來自二倍體簇毛麥(Haynaldia villosa，VV，2n=14)，在抗白粉病二倍體簇毛麥中受白粉菌誘導表達增強。將Hv-FP3基因轉(zhuǎn)化感白粉病小麥品種揚麥158，對轉(zhuǎn)基因T0代植株進行白粉病抗性鑒定，結(jié)果表明Hv-FP3基因的過量表達可以提高揚麥158對白粉病的抗性。Hv-FP3可望用于基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，有望提高小麥的白粉病抗性。
文檔編號A01H5/00GK103014023SQ201210574738
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者李穎波, 王秀娥, 曹愛忠, 王海燕, 邢莉萍, 肖進, 費菲, 祝燕飛 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學