地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌制劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌復(fù)合益生菌制劑的制備及其制備方法，屬于飼料微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述益生菌劑以豆粕、麩皮、玉米粉為基質(zhì)，利用地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵而成。本發(fā)明的制備方法生產(chǎn)成本低，可以提高經(jīng)濟(jì)效益并且操作簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)；采用混菌固態(tài)發(fā)酵，利用菌株間的互利共棲協(xié)同作用，能提高產(chǎn)率和菌體濃度所得發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)較高，有利于豆粕和玉米粉中的蛋白質(zhì)被分解成小肽和游離氨基酸，利于腸胃的消化吸收。本發(fā)明產(chǎn)品在飼料中添加使用時(shí)，此類(lèi)產(chǎn)品用于奶牛飼喂時(shí)能有效提高飼料的利用效率13-25%。
【專利說(shuō)明】地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌制劑及制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于飼料微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)，以益生菌地衣芽抱桿菌 BL-09 (Bacillus licheniformis BL-09)、枯草芽抱桿菌 HM-66 (Bacillussubtilis HM-66)和干釀乳桿菌 HM-09 (Lactobacillus casei HM-09)為菌種的固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，此技術(shù)可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物微生態(tài)等方面。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，益生菌制品多采用益生菌直接與液態(tài)牛乳和豆乳發(fā)酵，得到功能性的酸牛奶或者酸豆奶，其余則采用液態(tài)發(fā)酵，直接收集益生菌菌體，制作成益生菌粉劑、片劑或者膠囊。采用液態(tài)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，對(duì)環(huán)境污染較大，后處理比較困難，機(jī)器設(shè)備操作繁瑣。因此本申請(qǐng)采用地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09混合固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉，采用固態(tài)發(fā)酵，其生產(chǎn)成本低，投資的資金較少，在下游處理方便，污染小，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易操作。采用地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌HM-09進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，可生改善動(dòng)物飼料的適口性。其蛋白質(zhì)被分解成小肽和游離氨基酸，有利于動(dòng)物腸胃消化吸收。[0003]中國(guó)發(fā)明專利200810175856.7公開(kāi)了一株具有益生功效的干酪乳桿菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)的高密度發(fā)酵技術(shù)，包括增殖培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制，和該菌株的高活力凍干菌粉的制備技術(shù)。通過(guò)本發(fā)明可以得到1011CFU/ML以上活菌數(shù)的干酪乳桿菌的凍干菌粉，能夠直接應(yīng)用于該菌株益生菌發(fā)酵劑和益生菌制劑的制備和應(yīng)用。
[0004]名稱為一種干酪乳桿菌及其在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?00710118485.4，該發(fā)明公開(kāi)了一種干酪乳桿菌及其在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用。所述干酪乳桿菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)是從酸馬奶中分離得到的耐酸和耐膽汁酸的益生菌；該菌菌株已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào):CGMCC N0.1697。本發(fā)明的干酪乳桿菌(LACTOBACILLUS CASEI ZHANG)能實(shí)現(xiàn)在固態(tài)發(fā)酵方面的應(yīng)用，特別是作為發(fā)酵劑在乳制品、健康食品、微生物飼料以及動(dòng)物保健制品中的應(yīng)用；本發(fā)明的干酪乳桿菌菌體存活率提高的方法，是一種優(yōu)化固態(tài)培養(yǎng)基的方法，能得到較高的菌體密度和菌體存活率；本發(fā)明的干酪乳桿菌固態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)是液體MRS發(fā)酵活菌數(shù)的二十倍以上。
[0005]名稱為用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌的發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?1310321977.9，該發(fā)明公開(kāi)用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66、干酪乳桿菌F-08、植物乳桿菌HM-20和動(dòng)物雙歧桿菌V9均為益生菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCCN0.6733、CGMCCN0.6735、CGMCCN0.6744 和 CGMCCN0.5470，枯草芽孢桿菌 HM-66、干酪乳桿菌F-08和植物乳桿菌HM-20的保藏日期為2012年10月29日，動(dòng)物雙歧桿菌V9的保藏日期為2011年11月18日。本發(fā)明還公開(kāi)了其應(yīng)用方法。
[0006]用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的動(dòng)物雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌的中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01310321979.8，發(fā)明涉及一種可生產(chǎn)出具有特殊酸香味的發(fā)酵型豆柏、且含高活菌數(shù)以及高蛋白質(zhì)降解率的可用于食品和飼料添加劑領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵。用于固體發(fā)酵的枯草芽孢桿菌HM-66和動(dòng)物雙歧桿菌V9均為益生菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)分別為CGMCCN0.6733和CGMCCN0.5470。
[0007]用于飼料添加劑領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌審中的中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01310322177.9，公開(kāi)了一種污染小、易操作、有利于腸胃消化吸收的用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66和植物乳桿菌HM-20均為益生菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCCN0.6733和CGMCCN0.6744。
[0008]用于飼料添加劑領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌審中的中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01310322953.5。公開(kāi)了一種污染小、易操作、有利于腸胃消化吸收的用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的枯草芽孢桿菌和干酪乳桿菌，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌HM-66)和干酪乳桿菌F-08均為益生菌，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)分別為CGMCCN0.6733和CGMCCN0.6735。
[0009]名稱為一種有效預(yù)防及改善牛乳房炎的復(fù)合乳酸菌微生態(tài)制劑中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)枮?01310094615.0,該專利公開(kāi)一種預(yù)防及改善牛乳房炎的復(fù)合微生態(tài)制劑，復(fù)合微生態(tài)制劑中干酪乳桿菌HM_09(L.casei HM-09)質(zhì)量份數(shù)為10%，植物乳桿菌HM-10(L.Plantarum HM-10)質(zhì)量份數(shù)為10%，其余80%為沸石粉，同時(shí)復(fù)合微生態(tài)制劑中L.caseiHM-09 活菌數(shù)量≥ 2.5X108cfu/g, L.plantarum HM-10 活菌數(shù)量≥ 2.5X 108cfu/g ;所述干酪乳桿菌和植物乳桿菌已于2012年10月29日在地址為北京市大屯路，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，干酪乳桿菌HM_09(L.casei HM-09)保藏號(hào):CGMCCN0.6736 ;植物乳桿菌 HM-10 (L.plantarum HM-10)保藏號(hào):CGMCC N0.6741。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的在于采用地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌HM-09進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉，提供一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)，此方法發(fā)酵產(chǎn)品的活菌數(shù)高，豆柏蛋白質(zhì)的降解率高。此制備方法生產(chǎn)成本低，可以提高經(jīng)濟(jì)效益并且操作簡(jiǎn)單。
[0011]本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0012]一種以豆柏、麩皮和玉米粉為基質(zhì)可廣泛應(yīng)用于微生態(tài)領(lǐng)域的益生菌固體發(fā)酵技術(shù)，包括地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09的培養(yǎng)及其固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，得到益生菌的固態(tài)發(fā)酵豆柏、麩皮和玉米粉產(chǎn)品。
[0013]所述地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09種子培養(yǎng)基為:蛋白胨1_2%，葡萄糖2-4%，加水至100%, ρΗ7.0-7.2。
[0014]所述的地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66種子培養(yǎng)條件，放置于搖床上，轉(zhuǎn)速為150-180r/min，溫度為30-37°C，培養(yǎng)20_24h ;干酪乳桿菌HM-09種子培養(yǎng)條件，30-37 °C 靜置培養(yǎng) 20-24h。[0015]所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌腿-66種子液，接種量各為2-8%(v/w)，控制發(fā)酵溫度30_38°C，濕度40_65%，混菌培養(yǎng)12-18h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為l_8%(v/w)，其他條件不變，再發(fā)酵12-36h。發(fā)酵結(jié)束后干燥獲得。
[0016]固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。水份含量控制在40-75%。
[0017]地衣芽孢桿菌BL-09、枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌腿_09混菌發(fā)酵，在發(fā)酵結(jié)束后，游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到1109.lumol/g，較發(fā)酵前提高約11倍，地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66芽孢率較單獨(dú)發(fā)酵分別提高2.1倍和1.5倍。
[0018]枯草芽孢桿菌HM-66和干酪乳桿菌HM-09于2012年10月29日保藏，保藏號(hào)分別為CGMCC N0.6733和CGMCC N0.6736。菌保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101，保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0019]地衣芽抱桿菌BL-09分類(lèi)名稱分別為(Bacillus licheniformis)BL-09、地衣芽孢桿菌BL-09于2011年12月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編100101 ;保藏號(hào)為CGMCCN0.5686。
[0020]地衣芽孢桿菌BL-09分離自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市地區(qū)健康牛腸道樣品中芽孢桿菌，屬于兼性厭氧的、革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌；菌體呈棒桿狀，偶爾見(jiàn)長(zhǎng)桿狀，芽孢中生，呈橢圓形；最適生長(zhǎng)溫度為37土 1°C，最適生長(zhǎng)pH為7.0-7.4，固態(tài)發(fā)酵烘干產(chǎn)物常溫儲(chǔ)存6個(gè)月，芽孢損失率低于5% ;營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)12h左右，菌落不規(guī)則、邊緣不光滑，菌落中央具有明顯的凸起峰，培養(yǎng)至24-36h，菌落褶皺明顯且褶皺內(nèi)物質(zhì)呈液體狀，接種環(huán)挑取具有拉絲情況，鏡檢芽孢基本脫落，經(jīng)過(guò)伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)(第9版)生理生化試驗(yàn)及細(xì)菌、菌落形態(tài)確定為地衣芽孢桿菌，命名為地衣芽孢桿菌BL-09。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該菌株具有良好的耐高溫、耐酸、耐膽鹽等生化特性地衣芽孢桿菌BL-09還具有高產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等多種酶類(lèi)及氨基酸、維生素、抗菌物質(zhì)等多種生理活性物質(zhì)，發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基粘度很大，拉絲嚴(yán)重，培養(yǎng)器皿底部可見(jiàn)少量液體物質(zhì)，證明其固態(tài)發(fā)酵中的保濕能力相對(duì)較強(qiáng)。
[0021]耐酸試驗(yàn):
[0022]地衣芽孢桿菌BL-09于肉湯種子液中，37 0C，180r/min培養(yǎng)24h，于4°C、4000r/min離心10min收集菌體，用0.85%無(wú)菌生理鹽水漂洗一次后，懸浮于pH分別為2.0、3.0及4.0的緩沖溶液中，37°C培養(yǎng)I~3h，檢測(cè)活菌數(shù)變化，結(jié)果顯示地衣芽孢桿菌BL-09具有良好
的耐酸性。
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)合益生菌制劑，可由下述方法制得:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為2-8%(v/w)，控制發(fā)酵溫度30-38°C，濕度40-65%，混菌培養(yǎng)12-18h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為l_8%(V/w)，其他條件不變，再發(fā)酵12-36h，發(fā)酵結(jié)束干燥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合益生菌制劑:其特征在于，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合益生菌制劑:其特征在于，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.5686。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合益生菌制劑的制備方法，包括如下步驟:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為2_8%，控制發(fā)酵溫度30-38°C，濕度40-65%，混菌培養(yǎng)12_18h ;再添加干酪乳桿菌腿_09種子液，接種量為1_8%，其他條件不變,再發(fā)酵12_36h,發(fā)酵結(jié)束干燥；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為S.柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8-10:0.5-1。地衣芽孢桿菌，保藏號(hào)為CGMCC N0.5686。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合益生菌制劑的制備方法，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為3%，控制發(fā)酵溫度35°C，濕度60%，混菌培養(yǎng)12h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為5%，其他條件不變，再發(fā)酵12h，共計(jì)發(fā)酵總時(shí)間為24h。發(fā)酵結(jié)束經(jīng)流化床干燥方法獲得干燥的培養(yǎng)物；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:10:0.5，水份含量控制在60%;發(fā)酵結(jié)束后，游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到1038.7umol/g。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合益生菌制劑的制備方法，所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)方法為:固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上首先接種地衣芽孢桿菌BL-09和枯草芽孢桿菌HM-66種子液，接種量各為3%，控制發(fā)酵溫度37°C，濕度45%，混菌培養(yǎng)15h ;再添加干酪乳桿菌HM-09種子液，接種量為5%，其他條件不變，再發(fā)酵16h，發(fā)酵結(jié)束經(jīng)流化床干燥方法獲得干燥的培養(yǎng)物； 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為豆柏、麩皮和玉米粉，所述豆柏、麩皮和玉米粉的組成和質(zhì)量比例比例為:豆柏、麩皮、玉米粉=10:8:1，水份含量控制在70%，游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到1019.9umol/g。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的復(fù)合益生菌制劑在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK103952336SQ201410121427
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】高鵬飛, 趙樹(shù)平, 姚國(guó)強(qiáng) 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古和美科盛生物技術(shù)有限公司