一種金柑三倍體的育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金柑三倍體的育種方法，包括以下步驟：四倍體誘變、誘變種子的催芽培育、染色體倍性檢查、四倍體植株的培育、四倍體果實(shí)采收和取種、四倍體種胚分離培養(yǎng)、種胚染色體檢測和三倍體苗的培育。本方法避開有性雜交過程，排除珠心胚的干擾，直接從多胚性四倍體種子中分離培養(yǎng)出三倍體，具有操作簡單、育種年限短的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】_種金柑三倍體的育種方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于果樹遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說是涉及一種金柑三倍體的育種方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金柑為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurant1ideae)金柑屬(FortunellaSwingle)植物，金柑屬共有6個(gè)種和I個(gè)變種。金柑為栽培種類的統(tǒng)稱，一年可多次開花結(jié)果，果實(shí)色艷形美，營養(yǎng)豐富，有吉祥喜慶之寓意，是鮮食、加工和觀賞的多用型果樹。金柑屬所有種均原產(chǎn)我國，然而目前栽培的金柑品種較少，鮮食類型只有金彈一種。陽朔金柑是目前栽培面積較大，經(jīng)濟(jì)效益較好的鮮食代表品種。
[0003]多倍體育種是果樹育種的重要方法，多倍體果樹具有植株生長旺盛、果大、無籽或少籽，產(chǎn)量高、同化物質(zhì)含量高、適應(yīng)性強(qiáng)和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前較有應(yīng)用價(jià)值的多倍體是四倍體和三倍體，特別是三倍體果樹，大多數(shù)高度不育，果實(shí)無核或少核，對(duì)提高果實(shí)可食率和加工品質(zhì)具有重要的作用。
[0004]金柑的鮮食栽培品種均為多胚性，多胚性是有效獲得雜種和三倍體品種的最大障礙，因此，傳統(tǒng)的通過四倍體和二倍體雜交獲得三倍體的途徑在多胚性的金柑類品種中因珠心胚的干擾和種胚敗育等因素的影響而難以實(shí)現(xiàn)。
[0005]本發(fā)明是利用多胚性品種先進(jìn)行四倍體誘導(dǎo)，在四倍體種子中進(jìn)行種胚分離培養(yǎng)，從而獲得三倍體的方法。該方法較傳統(tǒng)的胚乳培養(yǎng)、四倍體與二倍體有性雜交等方法簡便易行，獲得三倍體比例較高，避開了有性雜交、珠心胚干擾和種胚敗育等障礙，可有效獲得三倍體，縮短三倍體育種年限。該方法適用于多胚性金柑等柑橘類果樹三倍體的獲得。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中獲得三倍體的途徑，通常是采用四倍體和二倍體的有性雜交和胚乳培育等，其中，對(duì)于多胚性的果樹由于珠心胚的干擾，難于獲得三倍體，而胚乳培育獲得三倍體的途徑由于技術(shù)要求比較高、再生植株生長不良等因素，目前還沒有成功獲得三倍體栽培品種的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種金柑三倍體的育種方法。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0008]一種金柑三倍體的育種方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0009](I)四倍體誘導(dǎo):選擇金柑成熟果實(shí)的飽滿種子，去除外種皮，浸泡4_6h后將內(nèi)種皮剝除，使種胚分離，然后將其置于0.1-0.2%濃度的秋水仙素溶液中浸泡24-48h ；
[0010](2)誘變種子的催芽培育:取出浸泡的種子，清洗后先在光照培養(yǎng)箱中催芽發(fā)根，保濕，待發(fā)根后，剪取l-2cm根尖置于卡諾氏固定液固定液(95%乙醇:冰醋酸=3:1)中固定，依次編號(hào)，用做染色體倍性檢測；
[0011](3)染色體倍性檢查；
[0012](4)四倍體植株的培育:將步驟(3)中檢查結(jié)果為四倍體的種胚編號(hào)選出，繼續(xù)在沙盆中培養(yǎng)，待幼苗長出真葉，移栽到營養(yǎng)杯中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)至第一次梢成熟后進(jìn)行移栽;
[0013](5)四倍體果實(shí)采收和取種:對(duì)移栽后的四倍體植株按照金柑類果樹的常規(guī)田間管理技術(shù)管理2-3年，待果實(shí)成熟即可采收，取種；
[0014](6)四倍體種胚分咼培養(yǎng)；
[0015](7)種胚染色體檢測:待種胚生根，進(jìn)行染色體倍性檢查，檢查方法同步驟(3);
[0016](8)三倍體苗的培育:將步驟(7)中檢查為三倍體的種胚進(jìn)行培育，培育的方法同步驟⑷。
[0017]作為優(yōu)選，步驟(2)中卡諾氏固定液為按體積比95%乙醇:冰醋酸=3:1配制而成。
[0018]其中，步驟(3)所述染色體倍性檢測包括以下步驟:
[0019]①預(yù)處理:將培養(yǎng)好的根尖剪下l_2cm，用0.002mol/L 8-羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理2小時(shí)，用0.075mol/L KCL溶液進(jìn)行前低滲20min，用lmol/L的鹽酸在60°C水浴鍋中解離7min，再轉(zhuǎn)入0.075mol/L KCL中后低滲15min，在蒸餾水中浸泡1min ；
[0020]②改良卡寶品紅液的配制:取原液C 10-20mL，加45 %乙酸溶液80_90mL、山梨醇1.8g，即配成10-20%改良卡寶品紅液；
[0021]③染色體制片:將解離好的根尖用蒸餾水沖洗后放到載玻片上，切取約2mm的根尖分生組織，加I滴改良卡寶品紅液染色6-10min，然后在顯微鏡下觀察；
[0022]④染色體數(shù)目的確定:選擇20-40個(gè)完整、染色體分散好和清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，確定染色體數(shù)目。
[0023]其中，步驟②中所述原液C是取原液B 45mL，加冰乙酸和福爾馬林各6mL所得；所述原液B是取原液A 1mL,加入90mL的5 %石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g堿性品紅溶于10mL的70%乙醇中所得。
[0024]其中，步驟(6)所述四倍體種胚分離培養(yǎng)包括以下步驟:
[0025]①將四倍體金柑種子洗凈，放入燒杯中，加入適量的清水浸種l_2h ；
[0026]②取出種子，用鑷子輕輕從種子的合點(diǎn)開始除去內(nèi)外種皮，放入燒杯內(nèi)，加入600倍的紅汞溶液15-20min進(jìn)行消毒；
[0027]③將已消毒的種子取出，浸入無菌水中30min后，種子的胚將自然松開；
[0028]④用鑷子將未分離的種胚分開，置于培養(yǎng)皿中于28°C光溫室中催芽，保濕。
[0029]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
[0030]本發(fā)明的方法避開有性雜交過程，排除珠心胚的干擾，直接從多胚性四倍體種子中分離培養(yǎng)出三倍體，本方法操作簡單，育種年限短。

【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0032]實(shí)施例:
[0033]本發(fā)明以金柑鮮食栽培品種“陽朔金柑”做誘變材料。具體步驟如下:
[0034](I)四倍體誘導(dǎo):選擇陽朔金柑成熟果實(shí)的飽滿種子，去除外種皮，浸泡5h后將內(nèi)種皮剝除，使種胚分離，然后將其置于0.2%濃度的秋水仙素溶液浸泡36h ；
[0035](2)誘變種子的催芽培育:取出浸泡的種子，清洗后先在光照培養(yǎng)箱中催芽發(fā)根，保濕，定期觀察萌芽情況。待發(fā)根后，剪取Icm的根尖置于卡諾氏固定液(95%乙醇:冰醋酸=3:1)中固定，依次編號(hào)，用做染色體倍性檢測；
[0036](3)染色體倍性檢查；
[0037](4)四倍體植株的培育:將步驟(3)中檢查結(jié)果為四倍體的種胚編號(hào)選出，繼續(xù)在沙盆中培養(yǎng)，待幼苗長出真葉，移栽到營養(yǎng)杯中，于溫網(wǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至第一次梢成熟后移栽至高25cm、盆口直徑40cm花盆中栽培；
[0038](5)四倍體陽朔金柑果實(shí)采收和取種:對(duì)移栽后的四倍體植株按照金柑類果樹的常規(guī)田間管理技術(shù)管理，移栽后第二年開花結(jié)果，待果實(shí)成熟后采收果實(shí)，取種；
[0039](6)四倍體陽朔金柑種胚分離培養(yǎng)；
[0040](7)種胚染色體檢測:待種胚生根，進(jìn)行染色體倍性檢查，檢查方法同步驟(3);
[0041](8)三倍體陽朔金柑苗的培育:將步驟(7)中檢查為三倍體的種胚進(jìn)行培育，培育的方法同步驟⑷。
[0042]其中，步驟(3)所述染色體倍性檢測包括以下步驟:
[0043]①預(yù)處理:將培養(yǎng)好的根尖剪下1cm，用0.002mol/L 8_羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理2小時(shí)，用0.075mol/L KCL溶液進(jìn)行前低滲20min，用lmol/L的鹽酸在60°C水浴鍋中解離7min，再轉(zhuǎn)入0.075mol/L KCL中后低滲15min，在蒸餾水中浸泡1min ；
[0044]②改良卡寶品紅液的配制:取原液C 10mL，加45%乙酸溶液90mL、山梨醇1.8g，即配成10%改良卡寶品紅液；
[0045]③染色體制片:將解離好的根尖用蒸餾水沖洗后放到載玻片上，切取約2mm的根尖分生組織，加I滴改良卡寶品紅液染色6min，用Leica DM-4000熒光顯微鏡觀察、拍照；
[0046]④染色體數(shù)目的確定:選擇20個(gè)完整、染色體分散好和清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，確定染色體數(shù)目。
[0047]其中，步驟②中所述原液C是取原液B 45mL，加冰乙酸和福爾馬林各6mL所得；所述原液B是取原液A 1mL,加入90mL的5 %石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g堿性品紅溶于10mL的70%乙醇中所得。
[0048]其中，步驟(6)所述四倍體種胚分離培養(yǎng)包括以下步驟:
[0049]①將四倍體陽朔金柑種子洗凈，放入燒杯中，加入適量的清水浸種Ih ；
[0050]②取出種子，用鑷子輕輕從種子的合點(diǎn)開始除去內(nèi)外種皮，放入燒杯內(nèi)，加入600倍的紅汞溶液15min進(jìn)行消毒；
[0051]③將已消毒的種子取出，浸入無菌水中30min后，種子的胚將自然松開；
[0052]④用鑷子將未分離的種胚分開，置于培養(yǎng)皿中于28°C光溫室中催芽，保濕。
[0053]經(jīng)過調(diào)查和統(tǒng)計(jì)，本實(shí)施例中對(duì)“陽朔金柑”四倍體誘變率為12%，三倍體獲得率為9% ο
[0054]前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。
【權(quán)利要求】
1.一種金柑三倍體的育種方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)四倍體誘變:選擇金柑成熟果實(shí)的飽滿種子，去除外種皮，浸泡4-6h后將內(nèi)種皮剝除，使種胚分離，然后將其置于0.1-0.2%濃度的秋水仙素溶液中浸泡24-48h ； (2)誘變種子的催芽培育:取出浸泡的種子，清洗后先在光照培養(yǎng)箱中催芽發(fā)根，保濕，待發(fā)根后，剪取l-2cm根尖置于卡諾氏固定液中固定，依次編號(hào)，用做染色體倍性檢測； (3)染色體倍性檢查； (4)四倍體植株的培育:將步驟(3)中檢查結(jié)果為四倍體的種胚編號(hào)選出，繼續(xù)在沙盆中培養(yǎng)，待幼苗長出真葉，移栽到營養(yǎng)杯中，于溫室內(nèi)培養(yǎng)至第一次梢成熟后進(jìn)行移栽； (5)四倍體果實(shí)采收和取種:對(duì)移栽后的四倍體植株按照金柑類果樹的常規(guī)田間管理技術(shù)管理2-3年，待果實(shí)成熟即可采收，取種； (6)四倍體種胚分尚培養(yǎng)； (7)種胚染色體檢測:待種胚生根，進(jìn)行染色體倍性檢查，檢查方法同步驟(3); (8)三倍體苗的培育:將步驟(7)中檢查為三倍體的種胚進(jìn)行培育，培育的方法同步驟⑷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金柑三倍體的育種方法，其特征在于，步驟(2)中卡諾氏固定液為按體積比95%乙醇:冰醋酸=3:1配制而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金柑三倍體的育種方法，其特征在于，步驟(3)中所述染色體倍性檢測包括以下步驟: ①預(yù)處理:將培養(yǎng)好的根尖剪下l_2cm，用0.002mol/L8-羥基喹啉進(jìn)行預(yù)處理2小時(shí)，用0.075mol/L KCL溶液進(jìn)行前低滲20min，用lmol/L的鹽酸在60°C水浴鍋中解離7min，再轉(zhuǎn)入0.075mol/L KCL中后低滲15min，在蒸餾水中浸泡1min ； ②改良卡寶品紅液的配制:取原液C10-20mL，加45%乙酸溶液80-90mL、山梨醇1.8g，即配成10-20%改良卡寶品紅液； ③染色體制片:將解離好的根尖用蒸餾水沖洗后放到載玻片上，切取約2mm的根尖分生組織，加I滴改良卡寶品紅液染色6-10min，然后在顯微鏡下觀察； ④染色體數(shù)目的確定:選擇20-40個(gè)完整、染色體分散好和清晰的細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，確定染色體數(shù)目。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的金柑三倍體的育種方法，其特征在于，步驟②中所述原液C是取原液B 45mL，加冰乙酸和福爾馬林各6mL所得；所述原液B是取原液A 1mL,加入90mL的5%石炭酸水溶液所得；所述原液A是取3g堿性品紅溶于10mL的70%乙醇中所得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金柑三倍體的育種方法，其特征在于，步驟(6)中所述四倍體種胚分離培養(yǎng)包括以下步驟: ①將四倍體金柑種子洗凈，放入燒杯中，加入適量的清水浸種l_2h; ②取出種子，用鑷子輕輕從種子的合點(diǎn)開始除去內(nèi)外種皮，放入燒杯內(nèi)，加入600倍的紅未溶液15-20min進(jìn)行消毒； ③將已消毒的種子取出，浸入無菌水中30min后，種子的胚將自然松開； ④用鑷子將未分離的種胚分開，置于培養(yǎng)皿中于28°C光溫室中催芽，保濕。
【文檔編號(hào)】A01H1/08GK104488696SQ201410779338
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】黃桂香, 張樹偉 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)