一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因及其應(yīng)用，利用正向引物Pl:5’ATGGATTTAGGGGTTCACT3’；反向引物P2:5’TCAGMTTTGATGTCATCTGCAG3’以竹節(jié)參cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因，其序列為SEQIDN0.1所示。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到竹節(jié)參中，可提高竹節(jié)參中總皂苷的含量，為竹節(jié)參三萜皂苷生物合成的進(jìn)一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及竹節(jié)參中S烯環(huán)氧酶（Squalene epoxidase) 基因的克隆和應(yīng)用，

【背景技術(shù)】
[0002] 竹節(jié)參（Panax japonicus C. A. Mey)屬于五加科人參屬（Panax L.)植物是傳統(tǒng)的 名貴中藥材之一，具有較高的藥用價(jià)值，如增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞以及保 護(hù)心肌等作用，其主要有效成分為皂苷類(lèi)化合物，其中以齊墩果烷型五環(huán)三萜類(lèi)皂苷為主， 同時(shí)含有少量達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類(lèi)皂苷。
[0003] 竹節(jié)參是中國(guó)藥典收載品種，具有廣闊的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，目前中國(guó) 竹節(jié)參的野生資源近于瀕危，人工栽培藥材生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，造成目前市場(chǎng)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。通 過(guò)研究竹節(jié)參中活性成分三萜皂苷生物合成的途徑及其調(diào)控的分子機(jī)制，找出其中的關(guān)鍵 酶，實(shí)現(xiàn)其基因的定位、克隆及高效表達(dá)，在分子水平上對(duì)三萜皂苷生物合成進(jìn)行人工調(diào) 控，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)三萜皂苷類(lèi)化合物的規(guī)模生產(chǎn)，以提供醫(yī)藥市場(chǎng)的需求。
[0004] S烯環(huán)氧酶（Squalene epoxidase，SQE)基因在三廠類(lèi)阜苷的生物合成途徑中起 著重要的作用。SQE通過(guò)在C-C之間插入1個(gè)氧原子催化角鯊烯生成中間體單氧態(tài)角鯊烯， 此中間體在強(qiáng)光和紫外線(xiàn)的作用下可生成2, 3-氧化角鯊烯。而2, 3-氧化角鯊烯是三萜類(lèi) 化合物--植物留醇、達(dá)瑪烯二醇、環(huán)阿喬醇的前體，其合成直接關(guān)系竹節(jié)參中三萜類(lèi)皂苷 的含量，目前，SQE被公認(rèn)為是三萜類(lèi)化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。
[0005] 本研究首次利用第二代Solexa HiSeq2000進(jìn)行竹節(jié)參全株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及De novo拼接。分析找到竹節(jié)參中編碼鯊烯環(huán)氧酶的候選基因并進(jìn)行體外克隆表達(dá)，驗(yàn)證其功 能，為竹節(jié)參三萜皂苷化合物的生物合成提供理論基礎(chǔ)。
[0006] 在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)報(bào)道過(guò)本專(zhuān)利申請(qǐng)中所提及的竹節(jié)參鯊烯 環(huán)氧酶基因及其氨基酸序列，此基因編碼的酶在竹節(jié)參中三萜皂苷化合物的生物合成的過(guò) 程中有重要的作用，本研究認(rèn)為體外克隆該基因是利用基因工程方法和技術(shù)來(lái)調(diào)控竹節(jié)參 中三萜皂苷化合物生物合成的關(guān)鍵點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。該基因是人參屬植物活性成分三萜皂苷合成的關(guān)鍵基因，進(jìn)而為人參屬植物中 三萜皂苷含量的提高提供技術(shù)手段。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因編碼的蛋白質(zhì)， 其序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 本發(fā)明的最后一個(gè)目在于提供一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因在提高竹節(jié) 參中總皂苷含量的應(yīng)用，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到竹節(jié)參中，可提高竹節(jié)參 中總皂苷的含量。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0011] 一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因（以下稱(chēng)為PJSQE基因），其制備方法如下：
[0012] 利用正向引物 Pl: 5' ATGGATTTAGGGGTTCACT3' ；反向引物 P2:5' TCAGAATTTGATGT CATCTGCAG3'以竹節(jié)參cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C 變性4〇8,541：退火11^11，721：延伸9〇8,40個(gè)循環(huán)后，721：延伸1〇1^11。
[0013] 最終獲得了 PJSQE基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO. 2 所示。
[0014] 一種竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因或竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶在提高竹節(jié)參總皂苷 含量中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程如下：
[0015] 將竹節(jié)參竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶蛋白質(zhì)（SEQ ID NO. 2所示）對(duì)應(yīng)的PJSQE基因（優(yōu) 選S EQ ID NO. 1所示的核苷酸序列）通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入竹節(jié)參，可獲得高總 皂苷含量的的轉(zhuǎn)基因植株。
[0016] 本發(fā)明的所要保護(hù)的內(nèi)容還包括：
[0017] 編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸的核苷酸序列；優(yōu)選SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列。
[0018] 含有本發(fā)明的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因全序列或其ORF序列的重組載體， 如原核類(lèi)載體，真核類(lèi)表達(dá)載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括但不限于一些 常用的植物表達(dá)載體，例如ΦΒΙ121，pCAMBIA1301。
[0019] 含有本發(fā)明的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因全序列或其ORF序列的宿主細(xì)胞， 如含有上述的重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。包括但不限于煙草細(xì)胞大腸 桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、竹節(jié)參細(xì)胞或竹節(jié)參發(fā)根細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因的應(yīng)用，包括用所述的重組載體，如植 物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；或者用所述含有該基因的農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞共培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn) 基因的植物發(fā)根系；或者用所述的發(fā)根細(xì)胞再生植株；或者用所述的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶 (PJSQE)基因全序列或其ORF序列的轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因生物體。包括但不限于煙草、酵母、擬 南芥、竹節(jié)參發(fā)根。
[0021] 本發(fā)明中宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿 菌；常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
[0022] 利用本發(fā)明的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與竹 節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0024] 本發(fā)明所提供的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基因是首次從竹節(jié)參植物中克隆制 備所得，利用本發(fā)明的技術(shù)可以對(duì)竹節(jié)參等含有同類(lèi)化合物的藥用植物進(jìn)行基因工程改 造，通過(guò)轉(zhuǎn)基因來(lái)提高植物體內(nèi)的三萜皂苷化合物的含量。竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（PJSQE)基 因可參與竹節(jié)參三萜皂苷化合物的生物合成，因此本專(zhuān)利為竹節(jié)參三萜皂苷生物合成的進(jìn) 一步研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
[0025] 本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了總皂苷含量增加的高產(chǎn)株，為皂苷的的工業(yè)化生產(chǎn) 提供了技術(shù)支撐。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為竹節(jié)參總RNA電泳圖。
[0027] 圖2為PJSQE功能域預(yù)測(cè)分析。
[0028] 圖3為PJSQE系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0029] 圖4為表達(dá)載體pYEUra3_PJSQE構(gòu)建示意圖。
[0030] 圖5為酶促反應(yīng)產(chǎn)物薄層色譜分析示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明所述方案如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑如未特別說(shuō)明， 均購(gòu)自生化商店。
[0032] 實(shí)施例1 :
[0033] 竹節(jié)參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析
[0034] 1、樣品采集
[0035] 竹節(jié)參植株來(lái)源于湖北恩施Panax japonicus C. A. Mey,分別取根莖、葉、花，果實(shí) 置液氮中速凍后，在_80°C冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0036] 2、竹節(jié)參總RNA的分離和檢測(cè)
[0037] 對(duì)_80°C保存的各類(lèi)樣本于液氮中充分研磨，然后采用優(yōu)化的Trizol法對(duì)樣本進(jìn) 行總RNA的提取，全過(guò)程保證在低溫條件下進(jìn)行，加入一定濃度的PVP溶液（聚乙烯吡咯烷 酮），并適當(dāng)加大β -巰基乙醇的濃度，離心去除PVP和β -巰基乙醇后，采用高濃度NaAc 溶液析出RNA，DNase去除殘留DNA完成RNA的純化。用1. 0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整 性（圖1)，用Nanodrop2000核酸定量?jī)x測(cè)定A260、A280比值和濃度，RNA樣本置于-80°C 冰箱備用。
[0038] 3、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq)
[0039] 用 oligo (dT)的磁珠從總 RNA 中富集 mRNA，接加入 fragmentation buffer 將 mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers)合成第一條cD NA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，在經(jīng) 過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并被EB緩沖液洗脫之后進(jìn)行末端修復(fù)、加poly (A)并連接測(cè) 序接頭，瓊脂糖凝膠電泳分離并選擇片段大小，PCR擴(kuò)增構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用第二代Solexa HiSeq2000進(jìn)行RNA測(cè)序，及De novo拼接。
[0040] 4、候選基因初步篩選
[0041] 通過(guò)GO注釋?zhuān)珺last比對(duì)分析以及MEGA5. 0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3)等軟件分析 初步篩選到竹節(jié)參中編碼鯊烯環(huán)氧酶的候選基因。
[0042] 實(shí)施例2 :
[0043] 竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆
[0044] 利用正向引物 Pl: 5' ATGGATTTAGGGGTTCACT3' ；反向引物 P2:5' TCAGAATTTGAT GTCATCTGCAG3'以竹節(jié)參根莖cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 °C預(yù)變性 5min，94°C變性40s，54°C退火lmin，72°C延伸90s，40個(gè)循環(huán)后，72°C延伸IOmin將擴(kuò)增好 的基因鏈接到克隆載體PMD18-T上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a中，步驟如 下：
[0045] a)從_80°C超低溫冰箱中取100 μ L感受態(tài)細(xì)胞懸液，解凍后置于冰上；
[0046] b)加入5 μ L連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min ;
[0047] c) 42°C熱激90s，迅速置冰上5min ;
[0048] d)向EP管中加入ImL LB液體培養(yǎng)基（不含抗生素），37°C 200rpm45min ;
[0049] e)搖菌后取100 μ L菌液涂布于含抗生素的平板上，37°C培養(yǎng)箱過(guò)夜；
[0050] f)挑取單菌落于4mL含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜選 取陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。
[0051] 至此獲得了竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0052] 實(shí)施例3 :
[0053] PJSQE基因的生物信息學(xué)分析
[0054] 本發(fā)明涉及的竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶（SQE)基因全長(zhǎng)為1923bp，其序列為SEQ ID NO. 1所示，其中開(kāi)放讀碼框位于1?1923bp，編碼的蛋白質(zhì)序列為SEQ ID NO. 2所示。將 拼接分析好的鯊烯環(huán)氧酶全長(zhǎng)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast。該基因在具有典型的SE superfa mily結(jié)構(gòu)域，如圖2。
[0055] 實(shí)施例4 :
[0056] PJSQE基因功能的研究
[0057] 1、表達(dá)載體的構(gòu)建
[0058] 依據(jù)竹節(jié)參SQE基因全長(zhǎng)序列（SEQ ID NO. 1)的0RF，設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整開(kāi)放閱 讀框的引物，分別在正、反向引物上分別引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I和Xho I，利用 正向引物 Pl :5' GGATCCATGGATTTAGGGGTTCACTCACA3' ;反向引物 P2 :5, CTCGAGTCAGAAT TTGATGTCATCTGCAG3'進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，30min后照相，觀察膠圖，擴(kuò)增片 段為1935bp，TA克隆，提取質(zhì)粒。以BamH I和Xho I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物2h，利用回收試劑盒 (Takara公司，中國(guó)）純化酶切產(chǎn)物。同時(shí)利用BamH I和Xho I酶在37°C下酶切p YEUra3 載體2h，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用試劑盒回收大小約6170bp的片段。
[0059] 二者經(jīng)連接酶在16°C連接過(guò)夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉 素的LB平板上篩選重組子。PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌斑，提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切 電泳鑒定，保存且有正確目標(biāo)的重組質(zhì)粒pYEUra3-PJSQE用于表達(dá)轉(zhuǎn)化。該表達(dá)載體命名 為 pYEUra3-PJSQE (圖 4)。
[0060] 2、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0061] 以pYEUra3-PJSQE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化部分酶解酵母宿主菌AB1380,培養(yǎng)5d后篩選陽(yáng)性酵 母于2ml含2%葡萄糖的USM培養(yǎng)基上，4-5d后挑取單克隆2ml USM液體培養(yǎng)基中，30°C劇 烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。5000rpm離心培養(yǎng)5min，棄上清，以含2%葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基稀釋 20倍，30°C劇烈震蕩培養(yǎng)24h。提取培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白。選取高表達(dá)轉(zhuǎn)化子以50ml含2%葡 萄糖的USM液體培養(yǎng)基30°C劇烈震蕩培養(yǎng)20h后，接種到IL不含葡萄糖的USM液體培養(yǎng)基 30°C劇烈震蕩培養(yǎng)40h，回收菌體，分離微粒體，純化蛋白。
[0062] 3、酶促反應(yīng)鑒定
[0063] 體外酶促反應(yīng)體系總體積為300ul，其中含有67mM Tris-HCL(pH7. 5)，ImM EDTA， ImM NADPH，0. ImM FAD，0. 1% Triton Χ-100,0· 075% Tween80 和[3H]鯊烯（20000dpm)加入 純化的表達(dá)蛋白，然后置于75°C孵育60min,添加0. 3mll0%的甲醇?xì)溲趸浗K止反應(yīng),用 2ml的環(huán)己烷萃取2次后在氮?dú)饬飨率狗磻?yīng)物濃縮。用硅膠薄層色譜法進(jìn)行分析（Art558. Merck, Darmstadt, Germany)，然后在苯：乙酸乙酯99. 5:0. 5中展開(kāi)。用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì) 量放射性活度（TRI-CARB2500RT，Packard Instrument Co, Downers Grove，IL)。如圖 5， 第一條泳道為空白組，第二條沒(méi)有添加鯊烯環(huán)氧酶抑制劑AM01618,第三條添加了 30mM的 鯊烯環(huán)氧酶抑制劑AM01618,第四條泳道為標(biāo)準(zhǔn)品?？瞻捉M和添加了鯊烯環(huán)氧酶抑制劑的泳 道都沒(méi)有檢測(cè)出2, 3-氧化鯊烯，只有第三天泳道有2, 3-氧化鯊烯，說(shuō)明此基因編碼的蛋白 質(zhì)發(fā)揮了催化作用。
[0064] 實(shí)施例5 :
[0065] PJSQE在竹節(jié)參中進(jìn)行真核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因竹節(jié)參發(fā)根中總皂苷含量的測(cè)定：
[0066] 轉(zhuǎn)基因用的受體材料采自湖北恩施Panax japonicus C. A. Mey。
[0067] 含目的基因（竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因）的表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧 酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列（SEQ ID NO. 1)，在擴(kuò)增編碼區(qū)的正反方向引物上引入限制性?xún)?nèi)切 酶位點(diǎn)（視選用的載體而定），以便構(gòu)建植物表達(dá)載體。
[0068] 具體步驟如下：
[0069] 以實(shí)施例2中獲得的含有PJSQE基因編碼區(qū)的pMD18-T質(zhì)粒為模版，在上述構(gòu)建 的正向引物前引入BamH I酶切位點(diǎn)，在反向引物前引入Sac I酶切位點(diǎn)，正向引物Pl :5'GG ATCCATGGATTTAGGGGTTCACTCACA3' ；反向引物 P2 :5' GAGCTCTCAGAATTT GATGTCATCTGCAG3' 進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，TA克隆，提取質(zhì)粒。以BamH I和Sac I酶切擴(kuò)增產(chǎn)物4h，利用回收試劑盒 (Takara公司，中國(guó)）純化酶切產(chǎn)物。同時(shí)利用BamH I和Sac I酶在37°C下酶切pBI121載 體4h，在16°C下利用T4連接酶連接產(chǎn)物過(guò)夜，在保證閱讀框正確的前提下將竹節(jié)參PJSQE 基因的編碼區(qū)克隆到植物表達(dá)載體PBI121上，獲得表達(dá)載體pBI-PJSQE。將酶切鑒定好的 表達(dá)載體pBI-PJSQE轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，遺傳轉(zhuǎn)化竹節(jié)參。
[0070] 利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的人參的遺傳轉(zhuǎn)化，所需的材料和操作步驟如下：
[0071] 1)發(fā)根農(nóng)桿菌A4,使用前自冰箱中取出，用YEB培養(yǎng)基傳代2次，菌種在使用前接 種于YEB液體培養(yǎng)基中，28 °C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0072] 2)取竹節(jié)參細(xì)嫩葉片，洗凈后置于70%酒精中浸泡lmin，棄酒精，加入2%次氯酸 鈉消毒10min，期間搖動(dòng)數(shù)次，棄去消毒液，用無(wú)菌水漂洗4?5次，置于無(wú)菌濾紙上晾干，用 無(wú)菌刀片將竹節(jié)參葉片切成5mmX 5mm小片，置于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上，在（23±1) °C暗箱 培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)2d。
[0073] 3)經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)的發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌液離心后，菌體沉淀用1/2MS重懸，置于4°C中 2h后取出。將預(yù)培養(yǎng)過(guò)的竹節(jié)參葉片浸泡于1/2MS重懸的菌液中5min，用無(wú)菌濾紙吸去多 余菌液，放入含250-500mg/L卡那霉素的1/2MS固體培養(yǎng)基中，（23±1) °C黑暗條件下培養(yǎng)， 每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中1次，待長(zhǎng)出毛狀根后分離毛狀根，轉(zhuǎn)移至含250-500mg/L卡那 霉素的無(wú)激素1/2MS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2周轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中至無(wú)菌為止，然后再轉(zhuǎn) 移至不含卡那霉素的無(wú)激素1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0074] 4)把在固體培養(yǎng)基上的毛狀根繼代培養(yǎng)物接種于裝有150ml無(wú)激素1/2MS液體 培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，培養(yǎng)溫度、光照、轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件與愈傷組織液體懸浮培養(yǎng)條 件相同，培養(yǎng)25d后，將毛狀根從培養(yǎng)基中取出放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，然后稱(chēng)重，貯 存-80°C中備用。
[0075] 陽(yáng)性株利用常規(guī)real-time PCR進(jìn)行進(jìn)一步的篩選驗(yàn)證，本發(fā)明所用方法具體如 下：
[0076] 提取具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化珠節(jié)參植株的總RNA，利用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒 將RN A反轉(zhuǎn)錄成cDNA，半定量所用引物為珠節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因特異引物（正向引物 5' -GCTCCC TATCCTACTCCC-3' ；反向引物 5' -AATCTAACTCCAGCCCAC-3'），反應(yīng)程序?yàn)?94°C 時(shí)3分鐘，94°C變性30秒，61°C退火30秒，72°C延伸45秒，25個(gè)循環(huán)；循環(huán)完成后72°C延 伸5分鐘。用植物beta-actin基因做為內(nèi)參基因（正向引物5' -GGAAAAGATTTGGCATC-3'， 反向引物5'-6660614八0〇：11^14-3'）。對(duì)竹節(jié)參的野生型和轉(zhuǎn)化系在相同生長(zhǎng)狀態(tài)下進(jìn) 行目的基因表達(dá)水平的分析。最終選擇相對(duì)于野生型植株，基因表達(dá)量的Fold-change值 高于4倍以上（P〈0. 01)的轉(zhuǎn)化植株作為陽(yáng)性株進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0077] 5)含竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根的總皂苷類(lèi)化合物含量測(cè)定
[0078] 根據(jù)2010版《中華人民共和國(guó)藥典》，人參屬植物中的皂苷都為三萜皂苷。
[0079] 竹節(jié)參發(fā)根中總皂苷含量的檢測(cè)可使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明具體采用以下 步驟：
[0080] 參考袁丁等（華西藥學(xué)雜志，2008, 23 (6) :692-694)的總皂苷待測(cè)溶液處理方法 及檢測(cè)方法，采用香草醛-高氯酸比色法，對(duì)表達(dá)竹節(jié)參PJSQE基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根系進(jìn)行竹 節(jié)參總皂苷的含量測(cè)定，以非轉(zhuǎn)基因的竹節(jié)參發(fā)根系為對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品為人參皂苷Re,購(gòu)自中 國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)=110754-200421)。對(duì)照組和轉(zhuǎn)基因組各檢測(cè)20株，測(cè)定結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)竹節(jié)參PJSQE基因的轉(zhuǎn)基因竹節(jié)參發(fā)根中竹節(jié)參總皂苷含量比非轉(zhuǎn)基因 對(duì)照組提高了 1.8倍（P〈0. 05)。由此證明，竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因?qū)Υ龠M(jìn)竹節(jié)參總皂苷含 量的提高有顯著作用，竹節(jié)參鯊烯環(huán)氧酶基因可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高竹節(jié)參總皂苷含 量的研究和產(chǎn)業(yè)化中，具有一定的應(yīng)用前景。
【權(quán)利要求】
1. 一種分離的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的核苷酸序列，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
4. 含有權(quán)利要求2所述核苷酸序列的植物表達(dá)載體。
5. 含有權(quán)利要求4所述植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。
6. 權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在提高植物總皂苷含量中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于：權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所 述的基因在提高竹節(jié)參總皂苷含量中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104212774SQ201410441835
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】張紹鵬, 陳平, 楊濤, 朱聞君, 宋佳, 孫巧, 伍猶, 王如峰, 鄧琛, 陳超, 鄭用璉 申請(qǐng)人:張紹鵬, 陳平, 楊濤, 朱聞君, 宋佳, 孫巧, 伍羽中, 王如峰, 鄧琛, 陳超, 鄭用璉