一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法，通過性狀差異極端的親本進行雜交，在其F4～F5自交后代中持續(xù)選擇差異顯著的個體，分別將其與非柱頭外露的常規(guī)品種雜交，再回交，每代選擇非輪回親本的柱頭外露性狀，連續(xù)回交6～7代后，即成為遺傳背景一致，但在柱頭外露性狀上極端差異的近等基因系；通過選取近等基因系適當時期的柱頭為材料，進行全基因組表達芯片雜交，檢測其時空表達模式，確選差異表達基因，進而克隆其上游的特異性啟動子。本發(fā)明方法可靠，技術(shù)路線可行，是發(fā)掘水稻柱頭這類特殊器官特異表達啟動子的有效技術(shù)方法。
【專利說明】一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻柱頭外露是指開花時柱頭伸到張開的穎殼之外，開花結(jié)束后穎殼閉合，但柱頭仍留在穎殼外的特性。在影響雜交水稻不育系異交性能和結(jié)實率的雌性花器性狀中，柱頭外露率是最重要的因素。柱頭外露可以在一定程度上克服穎殼對外源花粉的供粉障礙，并延長柱頭授粉時間，降低父母本花時差異對異交結(jié)實率的影響，從而提高異交結(jié)實率，增加雜交稻的繁殖制種產(chǎn)量。因此，研究水稻柱頭外露特性是水稻育種家們的重要目標之一，對水稻柱頭外露性狀的遺傳研究意義重大。
[0003]植物基因的表達調(diào)控已成為分子生物學研究熱點，啟動子是基因表達調(diào)控的重要順式元件，啟動子的克隆對于研究基因表達調(diào)控、構(gòu)建基因工程載體、表達目的蛋白有著重要的意義。發(fā)掘新的誘導(dǎo)型啟動子，無論對于基因表達調(diào)控機理的研究，還是在轉(zhuǎn)基因研究加以利用都具有十分重要的科學意義。新的特異性啟動子的克隆、順式作用元件具體序列的確定、各元件之間的相互作用，以及與這些元件互作的轉(zhuǎn)錄因子的研究仍然是今后啟動子研究的重點。
[0004]柱頭外露是水稻雜交育種非常重要的農(nóng)藝性狀，該性狀存在著明顯的基因型差異，屬質(zhì)量性狀，不同性狀的品種具有較大的表型差異。
[0005]目前，植物組織特異性啟動子的發(fā)掘一般通過啟動子捕獲技術(shù)來獲得，但該技術(shù)隨機性大、假陽性高，需要利用基因槍等復(fù)雜設(shè)備，在發(fā)掘水稻柱頭這類特殊器官的特異性表達的啟動子時,往往力不從心。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法，旨在解決水稻柱頭外露性狀基因啟動子發(fā)掘的問題。
[0007]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法，包括以下步驟:
[0008]通過性狀差異極端的親本進行雜交，在其F4?F5自交后代中持續(xù)選擇差異顯著的個體，分別將其與非柱頭外露的常規(guī)品種雜交，再回交，每代選擇非輪回親本的柱頭外露性狀，連續(xù)回交6?7代后，即成為遺傳背景一致，但在柱頭外露性狀上極端差異的近等基因系；
[0009]通過選取近等基因系適當時期的柱頭為材料，進行全基因組表達芯片雜交，檢測其時空表達模式，確選差異表達基因，進而克隆其上游的特異性啟動子。
[0010]相比于現(xiàn)有技術(shù)的缺點和不足，本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明從材料構(gòu)建上入手，通過應(yīng)用表達譜基因芯片技術(shù)，檢測差異表達基因，進而克隆其上游啟動子，雖該技術(shù)在材料準備上具有一定的要求，選育周期較長，但都是常規(guī)的雜交選育，因此該方法可靠，技術(shù)路線可行，是發(fā)掘水稻柱頭這類特殊器官特異表達啟動子的有效技術(shù)方法。

【具體實施方式】
[0011]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0012]實施例1水稻柱頭外露近等基因系的構(gòu)建
[0013](I)通過性狀差異極端的親本進行雜交，選育中間材料，再與非外露的親本材料連續(xù)回交，在其后代中持續(xù)選擇差異顯著的個體；
[0014]在步驟(I)中，利用柱頭外露率100%的元江野生稻(采自元江)與非柱頭外露的滇謀401 (項目組自育材料)雜交，選柱頭外露率高的后代自交，再用F4自交系與滇謀401回交一次,再經(jīng)過5代自交育成高柱頭外露率的中間品系IL401，然后再用低柱頭外露率的粳稻品種合系42 (云南省農(nóng)科院粳稻課題組選育)作輪回親本與IL401連續(xù)回交，選育高柱頭外露率和柱頭非外露但都與合系42為背景的新品系。此品系即為遺傳背景相似，但柱頭外露性狀極端差異的供試材料。
[0015](2)上述差異顯著個體與非柱頭外露的品種合系42連續(xù)回交，每代選擇非輪回親本的柱頭外露性狀，連續(xù)回交6?7代后，即成為遺傳背景一致，但在柱頭外露性狀上極端差異的近等基因系；
[0016]近等基因系(NILs)的差異為可穩(wěn)定遺傳的質(zhì)量性狀差異，柱頭外露率的廣義遺傳力高達96.86%，在花器官性狀中選擇效率最高，遺傳變異系數(shù)最大，通過雜交選擇方法來實現(xiàn)其性狀改良的潛力較大。
[0017]實施例2特異性啟動子的發(fā)掘
[0018](I)通過選取近等基因系適當時期的柱頭為材料，進行全基因組表達芯片雜交。
[0019]在步驟(I)中，于開花前一天取樣，具體的芯片雜交送上海康成生物公司進行，該公司采用目前國際先進的64K全基因組表達芯片(Agilent公司生產(chǎn))，該公司負責數(shù)據(jù)的采集和比對。選取表達差異10倍以上的候選基因進行后續(xù)分析。
[0020](2)檢測其時空表達模式，確選差異表達基因；
[0021]在步驟(2)中，水稻全基因組表達芯片共包含約5.7萬個基因，每次芯片雜交可獲得大約2.5萬個基因呈陽性，對陽性信號進行均一化處理，然后將HSE芯片信號值與NSE的芯片信號值進行比較。對芯片數(shù)據(jù)進行分析，找到了差異表達基因6152個，其中差異表達上調(diào)10倍以上的157個，根據(jù)分析，上調(diào)表達10倍以上的基因中，有18個為信號傳導(dǎo)相關(guān)，18個為轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，54個為能量物質(zhì)代謝相關(guān)，17個為編碼轉(zhuǎn)運蛋白基因，10個為激素合成代謝相關(guān)，26個與脅迫抵御相關(guān)，及14個未知功能基因，選取11個候選基因克隆，它們的編號為 0sl2922、0s31669、0sAffx5702、0sAffx23995、0s2322、0s51106、0s29841、0s55613、0s51408、0sAffxl4892和0s56298，設(shè)計相應(yīng)引物，用實時熒光定量PCR技術(shù)進一步檢測。結(jié)果表明，篩選的候選基因在柱頭外露的水稻中高表達，在非柱頭外露的水稻及其他組織中表達較低。其中，芯片探針編號Os.51408.1.Sl_at等的表達水平顯著提高，與芯片雜交結(jié)果比較相符。查詢該基因探針在網(wǎng)上(http://plantb1l.genetics.ac.cn/rice-Affy/)公布的水稻各種器官的芯片表達值，表明該基因除在柱頭表達較高外，在大部分的器官的表達水平較低，可以把其視為特異表達的基因。
[0022](3)進而克隆其上游的特異性啟動子。
[0023]在步驟(3)中，Os.51408.1.Sl_at對應(yīng)的水稻基因為0s09g37490，該基因編碼一auxin responsive genes一0sSAUR54,可以被外源激素誘導(dǎo)，再次證實該為柱頭外露特異性表達基因，通過水稻全基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),設(shè)計相應(yīng)引物，反應(yīng)程序和條件同常規(guī)，即克隆該啟動子序列。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)掘水稻柱頭外露特異性啟動子的方法，其特征在于包括以下步驟: 通過性狀差異極端的親本進行雜交，在其F4?F5自交后代中持續(xù)選擇差異顯著的個體，分別將其與非柱頭外露的常規(guī)品種雜交，再回交，每代選擇非輪回親本的柱頭外露性狀，連續(xù)回交6?7代后，即成為遺傳背景一致，但在柱頭外露性狀上極端差異的近等基因系; 通過選取近等基因系適當時期的柱頭為材料，進行全基因組表達芯片雜交，檢測其時空表達模式，確選差異表達基因，進而克隆其上游的特異性啟動子。
【文檔編號】A01H1/02GK104351044SQ201410653386
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】周國華 申請人:宜春學院