本發(fā)明涉及一種金花茶無菌外植體的獲得方法。

背景技術(shù)：

金花茶(Camellia nitidissima)屬山茶科山茶屬的植物，為常綠灌木或小喬木，為世界珍稀觀賞植物。山茶科植物的花色豐富，有紅、白、復(fù)色等，但過去一直缺少黃花顏色。最早記載的黃色花山茶是1916年P(guān)itard根據(jù)特產(chǎn)于越南北部的標(biāo)本命名為Thea flava Pitard(黃花茶)，1933年首次在廣西防城采到金花茶標(biāo)本，1948年戚經(jīng)文先生發(fā)表定名為Camellia nitid issima Chi，以后較長時期內(nèi)未引起廣泛的重視。直到1965年分類學(xué)家胡先骕以南寧藥物研究所的標(biāo)本發(fā)表了金花茶(命名為Theopsis chrysantha Hu)后才逐漸受到重視。金花茶的發(fā)現(xiàn)引起了國內(nèi)外植物學(xué)界和園藝學(xué)界的關(guān)注，尤其引起國際山茶學(xué)會的高度重視。1981年被列入國家一級保護植物，被譽為“植物界大熊貓”、“茶族皇后”。

金花茶具有較高的觀賞價值、營養(yǎng)價值和藥用價值，其葉、花可入藥；此外，金花茶含有特殊的色澤遺傳基因，具有重要的科研價值。近年來，金花茶逐漸受到市場的關(guān)注，尤其是其自身具備的藥用價值使其在市場的開發(fā)利用逐漸活躍起來，前景十分廣闊。但因金花茶苗木資源緊缺，極大影響了開發(fā)應(yīng)用。

金花茶自然分布狹窄，資源稀缺，同時種子結(jié)實率低，自繁能力差，生長速度慢。為加強金花茶的種質(zhì)資源保存加快種苗繁育，通過人工繁育及栽培，可大力發(fā)展金花茶種植業(yè)，充分發(fā)揮金花茶種質(zhì)資源的應(yīng)有價值。金花茶的人工繁育以枝條扦插為主，枝條需求大且成活率低，繁殖速度很慢，遠遠滿足不了市場的需要。而組培快繁是有效獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗的途徑之一，也是種植資源保存的重要手段。當(dāng)前有關(guān)金花茶的組培快繁研究很多，其外植體以莖尖、莖段、葉片為主，這對于珍貴的金花茶資源來說，在一定程度上對母株有所損害，違背了種質(zhì)資源保存的初衷。以種子為外植體，常規(guī)的方法是：將種子進行消毒滅菌后接種于不同的萌發(fā)培養(yǎng)基中，這種方法獲得的外植體時間較長，成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種萌發(fā)時間短、萌發(fā)率高、成本低、獲得外植體時間短的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種金花茶無菌外植體的獲得方法，包含如下步驟：

步驟一、河沙的高溫滅菌，取河沙在壓力為0.05～0.2Mpa、溫度為90～140℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻；

步驟二、蒸餾水的高溫滅菌，取蒸餾水在壓力為0.05～0.2Mpa、溫度為90～140℃℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻；

步驟三、種子的消毒滅菌，選取飽滿的種子，先用中性洗滌劑浸泡20～30min后，在流水下沖洗40～60min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％酒精浸泡種子40～60s，無菌水沖洗2～5次；再用0.1％升汞浸泡16～20min，同時輕輕震蕩種子，使升汞與種子充分接觸，最后用無菌水沖洗2～5次；

步驟四、無菌播種，將經(jīng)過消毒滅菌的金花茶種子裝入盛有無菌水的組培瓶中浸泡18～36h，使其充分吸脹，然后在超凈工作臺上，取出金花茶種子的胚乳，將胚乳播入滅菌后的沙子中，向沙子中倒入無菌水使沙子濕潤，確保沙子將胚乳完全埋入；

步驟五、外植體的獲得，將步驟四播種后的胚乳在溫度為21～25℃、沙子濕潤的條件下培養(yǎng)，出芽的小苗直接轉(zhuǎn)入金花茶的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選實施方式，本發(fā)明實施例提供的金花茶無菌外植體的獲得方法進一步包括下列技術(shù)特征的部分或全部：

作為上述技術(shù)方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟一中，將河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后在壓力為0.05～0.2Mpa、溫度為90～140℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻。

作為上述技術(shù)方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟一中，在組培瓶中裝入蒸餾水，蒸餾水體積為組培瓶容積的1/2，在壓力為0.05～0.2Mpa、溫度為90～140℃℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻。

作為上述技術(shù)方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述一種金花茶無菌外植體的獲得方法，其特征在于,包含如下步驟：

步驟一、河沙的高溫滅菌，取河沙在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻；

步驟二、蒸餾水的高溫滅菌，取蒸餾水在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻；

步驟三、種子的消毒滅菌，選取飽滿的種子，先用中性洗滌劑浸泡20～30min后，在流水下沖洗40～60min，然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％酒精浸泡種子40～60s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞浸泡16～20min，同時輕輕震蕩種子，使升汞與種子充分接觸，最后用無菌水沖洗3次；

步驟四、無菌播種，將經(jīng)過消毒滅菌的金花茶種子裝入盛有無菌水的組培瓶中浸泡24h，使其充分吸脹，然后在超凈工作臺上，取出金花茶種子的胚乳，將胚乳播入滅菌后的沙子中，向沙子中倒入無菌水使沙子濕潤，確保沙子將胚乳完全埋入；

步驟五、外植體的獲得，將步驟四播種后的胚乳在溫度為21～25℃、沙子濕潤的條件下培養(yǎng)，出芽的小苗直接轉(zhuǎn)入金花茶的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

作為上述技術(shù)方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟一中，將河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻。

作為上述技術(shù)方案的改進，在本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟一中，在組培瓶中裝入蒸餾水，蒸餾水體積為組培瓶容積的1/2，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌30～40min，自然冷卻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：操作簡單，設(shè)計合理，該金花茶無菌外植體的獲得方法萌發(fā)時間短、萌發(fā)率高、成本低、獲得外植體時間短、在金花茶種子萌發(fā)階段以沙子替代培養(yǎng)基來進行種子的萌發(fā)，具有成本低，萌發(fā)時間短的優(yōu)點。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，以下結(jié)合優(yōu)選實施例，詳細(xì)說明如下。

具體實施方式

下面詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施方式，其作為本說明書的一部分，通過實施例來說明本發(fā)明的原理，本發(fā)明的其他方面、特征及其優(yōu)點通過該詳細(xì)說明將會變得一目了然。

萌發(fā)率(％)＝種子萌發(fā)數(shù)/播種數(shù)×100％。

實施例1

2015年1月15日，選擇成熟、飽滿、規(guī)格一致的種子作為實驗材料。將河沙裝入組培瓶中(體積為組培瓶容積的1/2)，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌30min。自然條件下冷卻。在組培瓶中裝入蒸餾水(體積為組培瓶容積的1/2)。在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌30min。自然條件下冷卻。將50粒種子先用中性洗滌劑浸泡20min后，在流水下沖洗40min。然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％酒精浸泡種子40s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞浸泡16min，此操作過程中輕輕震蕩種子，使升汞很好地接觸種子，最后用無菌水沖洗3次。將經(jīng)過消毒滅菌的金花茶種子裝入盛有無菌水的組培瓶中浸泡24h，使其充分吸脹。然后在超凈工作臺上，用解剖刀切開果實，取出種子，剝?nèi)シN皮，取出胚乳，將胚乳播入沙子中，并倒入少量無菌水使沙子濕潤，確保沙子將胚乳完全埋入。播種完畢，即可將培養(yǎng)材料移入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為21～25℃。培養(yǎng)期間應(yīng)不定期檢查沙子的濕潤程度，若過于干燥，應(yīng)及時向組培瓶中添加無菌水至沙子濕潤為止。第25d檢查種子萌發(fā)，其中有45粒種子發(fā)芽，萌發(fā)率為90.00％。出芽后的小苗可直接轉(zhuǎn)入金花茶的繼代培養(yǎng)基中。

實施例2

2015年1月19日，選擇成熟、飽滿、規(guī)格一致的種子作為實驗材料。將河沙裝入組培瓶中(體積為組培瓶容積的1/2)，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌35min。自然條件下冷卻。在組培瓶中裝入蒸餾水(體積為組培瓶容積的1/2)。在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌35min。自然條件下冷卻。將50粒種子先用中性洗滌劑浸泡25min后，在流水下沖洗50min。然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％酒精浸泡種子50s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞浸泡18min，此操作過程中輕輕震蕩種子，使升汞很好地接觸種子，最后用無菌水沖洗3次。將經(jīng)過消毒滅菌的金花茶種子裝入盛有無菌水的組培瓶中浸泡24h，使其充分吸脹。然后在超凈工作臺上，用解剖刀切開果實，取出種子，剝?nèi)シN皮，取出胚乳，將胚乳播入沙子中，并倒入少量無菌水使沙子濕潤，確保沙子將胚乳完全埋入。播種完畢，即可將培養(yǎng)材料移入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為21～25℃。培養(yǎng)期間應(yīng)不定期檢查沙子的濕潤程度，若過于干燥，應(yīng)及時向組培瓶中添加無菌水至沙子濕潤為止。第22d檢查種子萌發(fā)，其中有42粒種子發(fā)芽，萌發(fā)率為84.00％。出芽后的小苗可直接轉(zhuǎn)入金花茶的繼代培養(yǎng)基中。

實施例3

2015年1月22日，選擇成熟、飽滿、規(guī)格一致的種子作為實驗材料。將河沙裝入組培瓶中(體積為組培瓶容積的1/2)，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌40min。自然條件下冷卻。在組培瓶中裝入蒸餾水(體積為組培瓶容積的1/2)。在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下滅菌40min。自然條件下冷卻。將50粒種子先用中性洗滌劑浸泡30min后，在流水下沖洗60min。然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％酒精浸泡種子60s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞浸泡20min，此操作過程中輕輕震蕩種子，使升汞很好地接觸種子，最后用無菌水沖洗3次。將經(jīng)過消毒滅菌的金花茶種子裝入盛有無菌水的組培瓶中浸泡24h，使其充分吸脹。然后在超凈工作臺上，用解剖刀切開果實，取出種子，剝?nèi)シN皮，取出胚乳，將胚乳播入沙子中，并倒入少量無菌水使沙子濕潤，確保沙子將胚乳完全埋入。播種完畢，即可將培養(yǎng)材料移入培養(yǎng)室進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為21～25℃。培養(yǎng)期間應(yīng)不定期檢查沙子的濕潤程度，若過于干燥，應(yīng)及時向組培瓶中添加無菌水至沙子濕潤為止。第19d檢查種子萌發(fā)，其中有40粒種子發(fā)芽，萌發(fā)率為80.00％。出芽后的小苗可直接轉(zhuǎn)入金花茶的繼代培養(yǎng)基中。

結(jié)果：萌發(fā)率可達80.00～90.00％，萌發(fā)時間為19～25d。

本發(fā)明的金花茶無菌外植體的獲得方法操作簡單，設(shè)計合理，該金花茶無菌外植體的獲得方法萌發(fā)時間短、萌發(fā)率高、成本低、獲得外植體時間短、在金花茶種子萌發(fā)階段以沙子替代培養(yǎng)基來進行種子的萌發(fā)，具有成本低，萌發(fā)時間短的優(yōu)點。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式而已，當(dāng)然不能以此來限定本發(fā)明之權(quán)利范圍，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和變動，這些改進和變動也視為本發(fā)明的保護范圍。