借助游離小孢子培養(yǎng)和ems誘變創(chuàng)制大白菜突變體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中與 EMS誘變相結(jié)合創(chuàng)制大白菜突變體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大白菜屬于十字花科蕓薹屬A基因組植物，是我國(guó)種植面積最大的蔬菜作物。大 白菜的基因組序列已經(jīng)于2011年釋放，其分子生物學(xué)研宄進(jìn)入了功能基因組階段，大白菜 突變體是其功能基因組學(xué)研宄的重要材料。
[0003] 人工誘變可以產(chǎn)生豐富的突變體材料。人工誘變的方法有很多種，包括物理（如 輻射）誘變，化學(xué)誘變（如EMS誘變），T-DNA插入誘變和AC/DS轉(zhuǎn)座誘變等。其中，EMS是 化學(xué)誘變中應(yīng)用最廣泛的誘變劑。與其他誘變劑相比，EMS誘變產(chǎn)生的點(diǎn)突變頻率高，且多 為顯性突變，染色體畸變相對(duì)較少。
[0004] 傳統(tǒng)的誘變方法是利用誘變技術(shù)處理植株的種子，并在田間對(duì)誘變植株進(jìn)行鑒 定和選擇。種子是最早也是最常用來(lái)作為EMS誘變處理的材料，但通常EMS誘變種子效率 很低。游離小孢子培養(yǎng)可以為離體誘變提供新的途徑，其在創(chuàng)制突變體方面具有明顯的優(yōu) 勢(shì)，可以快速獲得目標(biāo)性狀、縮短創(chuàng)制純合突變體的時(shí)間、提高誘變效率。本發(fā)明將游離小 孢子培養(yǎng)和EMS誘變相結(jié)合，旨在快速創(chuàng)制純合的大白菜突變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是創(chuàng)建一種快速創(chuàng)制大白菜突變體的新方法，將游離小孢子培養(yǎng)技 術(shù)和EMS誘變相結(jié)合，旨在快速獲得純合的大白菜突變體，提高構(gòu)建突變體庫(kù)的效率。
[0006] 本發(fā)明提供的借助游離小孢子培養(yǎng)和EMS誘變創(chuàng)制大白菜突變體的方法，主要步 驟包括：
[0007] (1)所用的誘變材料為雙單倍體純系（DH系），在開(kāi)花期選取小孢子發(fā)育期為單核 晚期至二核早期的未開(kāi)放花蕾，即長(zhǎng)度為2-4mm，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)；
[0008] (2)在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，采用不同濃度0· 04%、0· 08%、0· 12% [v/v]EMS溶液對(duì) 小孢子進(jìn)行誘變處理，處理時(shí)間均為l〇min，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)獲得小孢子再生植株（Mtl);
[0009] (3)將Mtl代再生植株移栽到溫室，利用流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行倍性鑒定，篩選出雙單 倍體植株；
[0010] (4)在獲得的雙單倍體植株中，通過(guò)對(duì)葉色、葉形、花瓣顏色、花瓣形態(tài)、雄蕊育性 和株型等植物學(xué)性狀鑒定，篩選出M tl變異植株；
[0011] (5)將所有的Mtl代雙單倍體植株自交，獲得M #種子；
[0012] (6)播種M1種子，進(jìn)一步鑒定突變性狀，篩選穩(wěn)定遺傳的突變體材料；
[0013] (7)經(jīng)試驗(yàn)篩選，創(chuàng)制大白菜突變體的適宜EMS溶液濃度為0· 08% ;
[0014] 上述步驟（2)的具體內(nèi)容：將長(zhǎng)度為2-4mm的未開(kāi)放花蕾在超凈工作臺(tái)上經(jīng)濃度 為75%乙醇溶液表面消毒30s后，用濃度為0. 1 %氯化汞溶液消毒8min，再用無(wú)菌水沖洗3 次，每次5min。
[0015] 消毒后的花蕾放入滅過(guò)菌的小燒杯內(nèi)，加入蔗糖濃度為130g · Γ1，PH值為5. 8的 Β5培養(yǎng)基，用無(wú)菌研棒碾壓花蕾，使小孢子游離出來(lái)，用40 μπι孔徑的尼龍網(wǎng)過(guò)濾含小孢 子的懸浮液，收集濾液于IOmL離心管中，1000 rpm離心3min，棄上清液，沉淀加 IOmL Β5培 養(yǎng)基，搖勻，1000 rpm離心3min，棄上清液，所得沉淀物即為純凈小孢子。此時(shí)，分別加入濃 度為 〇(對(duì)照），0.04 %，0.08 %，0· 12% (v/v)的 EMS 溶液，搖勻，處理 IOmin 后，1000 rpm 離心3min，棄上清液，將誘變處理后的小孢子用NLN培養(yǎng)基稀釋，稀釋密度至1~2X IO5 個(gè)，以每皿5mL小孢子懸浮液分裝入直徑60_的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿添加100 μ L高 溫滅菌后的0. 5g · Γ1瓊脂糖和IOg · LH活性炭混合液；用石蠟?zāi)し饪冢?3°C恒溫箱中暗培 養(yǎng)24小時(shí)，再轉(zhuǎn)移至25°C培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)10~15天，肉眼可見(jiàn)胚狀體后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到 轉(zhuǎn)數(shù)為40~60轉(zhuǎn)/分鐘搖床上繼續(xù)暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C ;將子葉期胚狀體轉(zhuǎn)接到MS 培養(yǎng)基上，在25°C，16h/8h光周期條件下培養(yǎng)；獲得小孢子再生植株后，再進(jìn)一步將再生植 株接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0016] EMS溶液設(shè)0.04 %，0.08 %，0. 12% (v/v) 3個(gè)濃度梯度，將EMS溶于蔗糖濃度為 130g · Γ1，PH值為5. 8的B5培養(yǎng)基中，抽濾備用，以未處理的小孢子作對(duì)照。
[0017] NLN培養(yǎng)基為含130g · Γ1蔗糖，添加激素0. 05mg · L 芐氨基腺嘌呤）和 0· 05mg · L-1NAA ( α -萘乙酸），PH值為5. 8的NLN培養(yǎng)基。
[0018] 誘導(dǎo)再生植株的MS培養(yǎng)基為含30g · Γ1蔗糖，6. 5~7. 5g ·廠1瓊脂，pH值為 5. 8~6. 0,未添加任何激素的MS培養(yǎng)基；誘導(dǎo)再生植株生根的MS培養(yǎng)基為含30g · Γ1蔗 糖，5. 5g · Γ1瓊脂，0· Img · L -1NAA ( α -萘乙酸），pH值為5. 8~6. 0的MS培養(yǎng)基。
[0019] 上述步驟（3)的具體內(nèi)容：利用流式細(xì)胞儀對(duì)再生植株進(jìn)行倍性鑒定，篩選出雙 單倍體植株。首先，取直徑為1~2cm大小的新鮮嫩葉放入培養(yǎng)皿內(nèi)，加入1. 5~2. OmL Chopping Buffer緩沖液（15mmol · I71三輕甲基氨基甲燒，2mmol ·廠1乙二胺四乙酸二鈉， 0. 5mmol · I71精胺，80mmol ·廠1氯化鉀，20mmol ·廠1氯化鈉，0. 1% [v/v]聚乙二醇辛基苯 基醚和15mmol · Γ1二巰基乙醇，pH 7. 5)，用手術(shù)剪刀將葉片剪碎，然后，吸取上清液，用 300目篩網(wǎng)將樣品過(guò)濾到離心管內(nèi)，1000 rpm離心10min，離心后棄上清，沉淀加 ImL PI (碘 化丙啶）染液，混勻避光染色15min，最后，將樣品用500目篩網(wǎng)過(guò)濾到上樣管中，混勻上機(jī) 檢測(cè)，20s后分析儀自動(dòng)形成代表該樣品倍性的DNA含量峰值圖；以已知二倍體的野生型誘 變材料作為對(duì)照，使對(duì)照的DNA吸收峰處在200道（X軸）位置，每個(gè)待測(cè)植株分別測(cè)定3 次，DNA吸收峰值處在200道的樣本即為二倍體，而峰值處在100和400道的分別為單倍 體和四倍體。
[0020] 上述步驟（7)的具體內(nèi)容：在獲得的穩(wěn)定遺傳的突變體材料中，其中絕大多數(shù)突 變體（83. 33% )均來(lái)自于濃度為0. 08%的EMS溶液處理，由此，經(jīng)本試驗(yàn)篩選，創(chuàng)制大白菜 突變體的適宜EMS溶液濃度為0. 08 %。
[0021 ] 本發(fā)明的積極效果
[0022] (1)所用的誘變?cè)疾牧蠟樾℃咦与p單倍體系（DH系），它是遺傳意義上的純系。 如果獲得突變體，與野生型之間的遺傳背景完全一致，只是在突變位點(diǎn)上存在差異，可以為 克隆突變基因提供了理想的試驗(yàn)材料。
[0023] (2)在小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，對(duì)單倍體小孢子進(jìn)行誘變處理，突變了的小孢子再生成 的雙單倍體，即為純合突變體，突變性狀在當(dāng)代就能表現(xiàn)，可以快速篩選出突變材料。
[0024] (3)以單倍體小孢子為誘變處理材料，便于擴(kuò)大誘變處理的群體規(guī)模。游離小孢子 培養(yǎng)技術(shù)具有快速獲得純合育種材料的優(yōu)點(diǎn)，將其與EMS誘變相結(jié)合，可以極大地提高誘 變效率，加快創(chuàng)制突變體的速度。
[0025] (4)本發(fā)明獲得的大白菜純合突變體，不僅可以為大白菜育種研宄提供新的種質(zhì) 資源，還可為大白菜功能基因組學(xué)研宄提供優(yōu)良的突變材料。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1 :經(jīng)EMS誘變后培養(yǎng)獲得的小孢子胚狀體。
[0027] 圖 1 中：a:0 處理；b:0. 04%處理；c:0. 08%處理；d:0. 12%處理；
[0028] 圖2 :經(jīng)EMS誘變后小孢子胚狀體的成苗情況。
[0029] 圖2中：a:直接成苗；b:愈傷組織；c