8 (3.5μηι，2.1 X 150mm，Waters)的色譜柱。具體操作步驟如下：經(jīng)上述處理的iTRAQ標(biāo)記好的 混合樣品凍干后用buffer A(20mmol/L ammonium formate，pH 9.5)重新溶解，在高效液相 色譜系統(tǒng)進(jìn)行反相色譜分離；以buffer A和buffer B(80%ACN/20%20mM NH4FA)為洗脫液 在200yL/min流速下梯度洗脫（10%至45%buffer B，30min)(Yang et al.，2011)，每隔 lmin收集一個(gè)洗脫組分，將所收到48個(gè)組分根據(jù)其在214nm下的吸收值合并為12份(Wang et al.，2011)。合并的樣品經(jīng)凍干后重新溶解在20yL buffer C(2%ACN/0.5%NH4FA)中， 最后上機(jī)進(jìn)行nanoLC-MS/MS質(zhì)譜分析。
[0058] 2 · 6 · 3nanoLC-MS/MS 分析
[0059] nanoLC-MS/MS質(zhì)譜分析采用了電場軌道阱回旋共振組合質(zhì)譜儀LTQ-〇rbitrap Velos(Thermo-Fisher Scientif ic，San Jose，CA)，該質(zhì)譜配備了一個(gè)"corconnex"納米離 子源質(zhì)譜儀(CorSolutions LLC，Ithaca，NY)，含有一個(gè)PepMap C18反相納米柱(3μηι，75μηι X 15cm，Dionex)連接到一個(gè)10μΜ分析物發(fā)射器(NewObjective，Woburn，MA)。該軌道講中接 口與多維液相層析系統(tǒng)UltiMate 3000MDLC(Dionex，Sunnyvale，CA)串聯(lián)。每個(gè)混合組分(5 yL)注入到PepMap C18捕獲柱中以20yL/min的流速進(jìn)行加載，然后利用一個(gè)梯度以300nL/ min的流速從5至38%ACN的0.1 %FA在PepMap C18反相納米柱分離120min，接著進(jìn)行5min坡 道95%ACN-0 · 1 %FA和5min保持在95%ACN-0 · 1 %FA。用2%ACN-0 · 1 %FA將柱子重新平衡 20min后再進(jìn)行下一次運(yùn)行。LTQ Orbitrap Velos在正離子模式下將電噴霧電壓設(shè)定在1.5 千伏，并在275°C的源溫度下進(jìn)行洗脫肽段的檢測。該儀器利用Ultramark 1621的FT質(zhì)量分 析器外部校準(zhǔn)。采用聚硅氧烷離子信號(hào)在M/Z 445.120025的背景作為校準(zhǔn)物進(jìn)行內(nèi)部校 準(zhǔn)。該儀器是在數(shù)據(jù)依賴采集(DDA)模式下進(jìn)行操作。在所有的實(shí)驗(yàn)中，全MS掃描以獲得M/Z 400-1，400的質(zhì)量范圍，Orbitrap質(zhì)量分析器的檢測分辨率設(shè)置為30，000。通過高能碰撞解 離(HCD)產(chǎn)生的片段離子光譜在Orbitrap質(zhì)量分析器設(shè)置的分辨率為7,500,質(zhì)量檢測范圍 為M/Z 100-2000。在每個(gè)DDA分析周期中，在接下來每個(gè)掃描過程中，10個(gè)最激烈的多電荷 離子高于5000閾值被選擇為在45%碰撞能量歸一化的碎片。動(dòng)態(tài)排除參數(shù)設(shè)定在重復(fù)數(shù)為 1且持續(xù)重復(fù)20s，排除列表的大小為500，30s持續(xù)時(shí)間排除與±10ppm的排斥大眾的寬度。 活化時(shí)間為〇. lms的HCD分析。使用Xcalibur 2.1軟件(Thermo-Fisher Scientific)分析獲 取所有的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
[0060] 2.6.4質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析
[0061 ]利用Proteome Discoverer 1 · 2(PD 1 · 2，Thermo)軟件將Orbitrap Velos米集的 原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為MGF文件。隨后米用Mascot Daemon(version 2.3，Matrix Science， Boston，MA)數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定和iTRAQ定量分析基于II5(Foc TR4)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 搜索，其中115蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫由16，446序列條目和7，300，852個(gè)氨基酸殘基組成(Fusarium Comparative Sequencing Project,Broad Institute of MIT and Harvard,http:// www.broadinstitute .org/) Jascot默認(rèn)的搜索設(shè)置如下：一個(gè)錯(cuò)失裂解位點(diǎn)的胰蛋白酶 允許與半胱氨酸固定的MMTS修飾，固定的4-plex iTRAQ修飾位于賴氨酸(Lys)和N-末端脫 酰胺化和可變修飾的甲硫氨酸氧化，天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gin)殘基脫酰胺化，和4-plex iTRAQ的酪氨酸(Tyr)。肽段和碎片離子的質(zhì)量分別為公差值為20ppm和0.1 Da。為了評(píng) 估錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDA)以衡量鑒定確定性的范圍，在每個(gè)重復(fù)設(shè)置中采用Elias和Gygi的目 標(biāo)-誘t耳策略(Elias et al.，2007)。具體而言，一個(gè)自動(dòng)的誘t耳數(shù)據(jù)庫搜索是通過Mascot 的選擇復(fù)選框中的一個(gè)誘餌隨機(jī)序列的數(shù)據(jù)庫生成和測試的原始光譜以及真正的數(shù)據(jù)庫 中進(jìn)行。為了減少錯(cuò)誤肽段識(shí)別的概率，只有當(dāng)肽段意義分值U 20)，且通過Mascot概率分 析(《^￥.111&1：1^18(^611〇6.(3〇111/116]^/8(3〇1'；[1^_116]^.111：1]止#?13]\0在大于99%的置信區(qū)間內(nèi)才 認(rèn)為被鑒定到。它要求在Mascot分析過程中每一個(gè)可靠的鑒定的蛋白質(zhì)至少有兩個(gè)獨(dú)特的 肽段數(shù)。同一家族內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)組成了Mascot里的蛋白家族。此外，考慮到蛋白的定量， 一個(gè)蛋白至少要產(chǎn)生兩個(gè)完整的iTRAQ報(bào)告離子系列。
[0062] 2.6.5蛋白質(zhì)的功能分析
[0063] 為了充分挖掘定量蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)信息，本實(shí)施例使用多種方法對(duì) Foe TR4早期發(fā)育的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和功能分類。針對(duì)所有鑒定的蛋白，采用Blast2go (Bio informatics Department，CIPF，Valencia，Spain)進(jìn)行 GO (Gene Ontho logy)功能注釋 (Conesa et al.，2008;G6tz.et al.，2008)，并對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO富集分析。C0G(Cluster of Orthologous Groups of proteins，蛋白相鄰類的聚簇)是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類 的數(shù)據(jù)庫。構(gòu)成每個(gè)C0G的蛋白都被假定為來自于同一個(gè)祖先蛋白，并且是orthologs或者 是paralogsArthologs是指來自于不同物種的由垂直家系(物種形成)進(jìn)化而來的蛋白，并 且特異地保留與原始蛋白相同的功能。Paralogs是那些在一定物種中的來源于基因復(fù)制的 蛋白，可能會(huì)進(jìn)化出新的與原來有關(guān)的功能。而K0G(eukaryotic orthologous groups，真 核生物直系同源族)是直系同源族特異識(shí)別真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)序列的分析數(shù)據(jù)庫。將鑒定 到的蛋白質(zhì)和K0G數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測這些蛋白質(zhì)可能的功能并對(duì)其做功能分類統(tǒng)計(jì)(Li et al·，2003)〇
[0064] 2.7Foc TR4早期發(fā)育相關(guān)蛋白的檢測
[0065] 提取四個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的Foe TR4孢子/菌絲中總蛋白（圖1和圖2)，通過定量蛋白質(zhì) 組學(xué)分析Foe TR4早期發(fā)育過程中3h，7h和llh相對(duì)于對(duì)照(Oh)的蛋白質(zhì)變化規(guī)律。任何給 定蛋白在3h，7h和llh相對(duì)于對(duì)照(Oh)的相對(duì)濃度變化可以通過iTRAQ的4-plex報(bào)告離子比 率來獲得。通過兩次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)鑒定和定量蛋白質(zhì)，共鑒定3659個(gè)蛋白，其中有 2966(81%)個(gè)蛋白在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中都被檢測到。兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中總共鑒定到有定量值的 蛋白3035個(gè)，其中在兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)都被檢測到有2431(80%)個(gè)。如圖3所示，結(jié)合兩次生物 學(xué)重復(fù)和定義差異蛋白的最大閾值2.0,共有260、260和201個(gè)差異蛋白分別在3、7和11小時(shí) 上調(diào)表達(dá)，同時(shí)也有265、480和429個(gè)差異蛋白下調(diào)表達(dá)。
[0066] 2.8Foc TR4孢子早期發(fā)育差異蛋白的鑒定與功能分析
[0067]為了獲得盡可能多的功能注釋信息，利用G0和K0G對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所有差異表達(dá) 蛋白進(jìn)行功能分類。針對(duì)鑒定的差異表達(dá)蛋白，采用生物信息學(xué)工具Blast2g〇進(jìn)行G0功能 注釋，并對(duì)差異表達(dá)蛋白在G0分類的3個(gè)主要類群生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組分進(jìn)行G0 功能富集分析。本實(shí)施例中蛋白質(zhì)的功能注釋基于GO的第三水平，并覆蓋20個(gè)功能類別。GO 術(shù)語分?jǐn)?shù)計(jì)算在每個(gè)節(jié)點(diǎn)根據(jù)公式
其中seq是注釋到不同序列的數(shù)目，而 dist為G0術(shù)語到子G0間的距離。上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)蛋白的G0預(yù)測結(jié)果見圖4。研究發(fā)現(xiàn)大 部分上調(diào)圖4A或下調(diào)圖4B的差異表達(dá)蛋白屬于細(xì)胞代謝過程（cellular metabolic pro cess)、氧化還原過程（oxidation-reduction process)、初級(jí)代謝過程（primary metabolic process)、小分子代謝過程中（small molecule metabolic process)、生物合 成過程（biosynthetic process)、大分子的代謝過程（macromolecule metabolic process)、氮化合物代謝過程(nitrogen compound metabolic process)等。
[0068] 基于K0G差異表達(dá)蛋白的功能分類發(fā)現(xiàn):共有747 (74%)個(gè)差異表達(dá)蛋白屬于K0G 的不同功能類別，還有262(26%)個(gè)差異表達(dá)蛋白不在K0G功能類別中（Tatusov et al.， 2003;Tatusov et al.，2001)。差異表達(dá)蛋白的K0G功能分類總結(jié)見圖5,幾乎包含所有的功 能類別和重要的生物過程(Leng et al.，2008)。這表明Foe TR4早期發(fā)育蛋白質(zhì)組變化的 復(fù)雜性（圖5)106的分析確定了Foe TR4孢子早期發(fā)育相關(guān)的差異表達(dá)蛋白大部分 (