一個小GTP結(jié)合蛋白基因TaRab18及其表達載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個小GTP結(jié)合蛋白基因化Rabl8及其表達載 體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥（Triti州maestivumL.)條誘病是由小麥條誘菌（Pucciniastriiformis f.sp.tritici)引起的一種危害嚴重的小麥病害，在世界上60多個國家和地區(qū)普遍發(fā)生。 小麥條誘病主要在小麥葉片上發(fā)生，在葉銷和莖上W及穗部芒上和穎殼也可發(fā)生。小麥條 誘病具有爆發(fā)性強、流行頻率高、傳播速度快、預(yù)防難度大、發(fā)生范圍廣、危害嚴重等特點。 在一般流行年份，小麥條誘病可使小麥減產(chǎn)20% -30%，而大流行年份，其產(chǎn)量損失達到 50% -60%，甚至絕收。我國不僅是世界上最大的小麥條誘病流行區(qū)，也是一個相對獨立的 流行區(qū)系，并且有自己獨特的優(yōu)勢小種。1950、1964、1990、2002、2003和2009年小麥條誘病 在我國大范圍流行，而在大多數(shù)年份局部發(fā)病成災(zāi)。在過去10年，平均每年約有400萬公 頃小麥種植地區(qū)受到小麥條誘病的影響。
[0003] 多年來選育和推廣小麥抗病品種一直是植病學(xué)家和育種工作者致力解決和防治 小麥條誘病的主要手段，雖然頗見成效，但由于小麥條誘菌具有高度的遺傳變異性，加上小 種?；钥共∑贩N的單一化大面積種植，必然導(dǎo)致新的優(yōu)勢小種在條誘菌種群中產(chǎn)生和發(fā) 展，最終導(dǎo)致原有品種抗性的喪失。品種抗誘性的屢屢"喪失"，是引起條誘病多次大流行的 主要原因，品種抗誘性喪失問題已成為小麥生產(chǎn)上一個世界性難題。因此，加強小麥條誘病 抗病新基因的挖掘利用W及抗病遺傳基礎(chǔ)的理論研究，選育抗條誘病品種，從而有效防治 小麥條誘病大面積流行刻不容緩。
[0004] 小麥品種92R137,含有抗條誘病基因化26,自1994年進入國內(nèi)育種利用W來， 化26在四川、云南、陜西等條誘病常發(fā)區(qū)進行了多年種植，對條誘病表現(xiàn)出了穩(wěn)定的高度抗 性，尤其是對小麥條誘菌優(yōu)勢小種條中29、30、32表現(xiàn)高抗-免疫。因此，開展條誘病互作 機理研究及重要抗條誘病相關(guān)基因的克隆，對于條誘病抗病育種具有重要意義。本發(fā)明利 用小麥基因忍片技術(shù)從轉(zhuǎn)錄組水平上了解小麥與條誘菌互作的基因表達特征，從中篩選了 一個在92R137中上調(diào)表達10倍W上的基因化Rabl8,將該基因轉(zhuǎn)入感條誘病小麥品種揚 麥158中使基因超量表達，可顯著提高小麥的條誘病抗性。本發(fā)明提供的化R油18基因超 量表達載體為開展抗條誘病小麥基因工程育種提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種小GTP結(jié)合蛋白基因 化R油18的表達載體和應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0007] 小GTP結(jié)合蛋白基因TaR油18來自普通小麥燈riticumasetivumL. )92R137,其 核巧酸序列為SEQIDNO. 1。
[0008] 該小GTP結(jié)合蛋白基因的蛋白質(zhì)為化Rabl8,其氨基酸序列為SEQIDNO. 2。
[0009] 含小GTP結(jié)合蛋白基因化R油18的重組表達載體。
[0010] 所述的重組表達載體優(yōu)選W地1220為出發(fā)載體，將化R油18基因插入地1220的 BamHl和化nl酶切位點間所得。
[0011] 所述的含小GTP結(jié)合蛋白基因化Rabl8的表達載體在構(gòu)建抗條誘病小麥品種中的 應(yīng)用。
[0012] 有益效果
[0013] 本發(fā)明從小麥中克隆得到了一個小GTP結(jié)合蛋白基因化Rabl8及其所編碼的蛋白 質(zhì)化Rabl8,該基因在含有抗條誘病小麥92R137中受條誘菌誘導(dǎo)表達，而在感病小麥揚麥 158中不受條誘菌誘導(dǎo)表達。將化Rabl8插入超表達載體地1220,并導(dǎo)入感病小麥品種揚 麥158中，可W提高揚麥158對條誘病的抗性。化R油18用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感 條誘病小麥品種中，能夠提高小麥的條誘病抗性。
【附圖說明】
[0014] 圖1、化.1763. 2. S1的RACE及基因組擴增結(jié)果
[001引A :5'和3' RACE擴增結(jié)果；B:基因全長引物擴增結(jié)果。
[0016] 圖2、化R油18及植物中Rabl8/RABC1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析
[0017]下劃線標出的是化R油18幾個保守亞結(jié)構(gòu)域，G1，G3, G4和G5,為GTP/GDP結(jié)合域。
[0018] 圖3、利用Q-PCR分析化R油18在抗條誘病92R137和感條誘病揚麥158中的表達
[0019] 橫坐標表示條誘菌誘導(dǎo)0、6、12、24、48、72小時的小麥葉片樣品。
[0020] 圖4、化R油18超量表達載體的構(gòu)建
[0021]A:植物表達載體地1220 ;B:重組超表達載體地1220:化R油18
[0022] 圖5、PBI220:化R油18部分轉(zhuǎn)基因植株TO代PCR分子鑒定 陽02引 3-14 :轉(zhuǎn)基因植株（4, 7,9,10,13為陽性植株，其余為陰性植株），1 :水對照，2 :質(zhì) 粒對照，3 :揚麥158對照，M:DL2000DNA標準分子量
[0024] 圖6、化R油18轉(zhuǎn)化揚麥158的Ti代陽性植株的條誘病抗性鑒定 陽02引1 :抗病對照92R137, 2 :感病對照揚麥158, 3-6 :抗性株系
【具體實施方式】 陽0%] 實施例1受條誘菌誘導(dǎo)表達的具GTP/GDP結(jié)合作用的基因化R油18的克隆
[0027] 為了克隆化26抗病途徑中的抗病相關(guān)基因，采用基因忍片雜交法篩選抗條誘 病小麥92R137與感條誘病小麥揚麥158中的差異表達基因。從中多次篩選獲得一上 調(diào)表達10倍的EST探針化.1763. 2.Sl_at。W此探針序列為基礎(chǔ)，通過RACE得到了預(yù) 期長度的擴增產(chǎn)物（圖1A)，拼接后序列長度為1015bp。根據(jù)拼接序列設(shè)計全長引物 P1(CCAGCCATGGACTCTTCTTC，沈QIDNO. 3)，P2 (AGCTGAAAGCTGCCAAGGTA,SEQIDNO. 4)。W 抗病小麥92R137cDNA為模板，通過RT-PCR得到預(yù)期長度82化p的擴增產(chǎn)物（圖IB)，并將 其回收、克隆、測序，擴增產(chǎn)物與拼接序列一致。經(jīng)0RFfinder分析，cDNA序列編碼區(qū)88~ 748-bp，長660-bp，序列如SEQIDNO. 1所示。編碼217個氨基酸，氨基酸序列如SEQID NO. 2 所不。經(jīng)SMART軟件化ttp://sma;rt.embl-heide化erg.de/)分析，hRablS編碼蛋 白序具有4個（GTP/GDP結(jié)合所需的結(jié)合域（即Gl，憐酸結(jié)合回環(huán)GDSGVG：G3,協(xié)調(diào)GTP的 丫和P磯酸基序DTAGQ;G4,強化鳥囑嶺結(jié)合基序GNKVD;G5,幫助鳥囑嶺結(jié)合和解離基序 ECSAR)、2個分子開關(guān)（SwitchI/G2;SwitchII)和1個C端膜定位信號-異戊締基化基 序（往）（圖2)，其中結(jié)構(gòu)域（im)為植物特有。該蛋白序列與短柄草、玉米和擬南芥中的 ^8(：1/1?油18〇0臟序列一致性達89%、86%和85%，因此將該基因命名為1'曰1?油18。
[0028] 實施例2化R油18基因受條誘菌誘導(dǎo)的表達特征分析
[0029] 為了研究化Rabl8在抗感條誘病材料中的表達模式，利用抗病材料92R137和 感病材料揚麥158經(jīng)條誘菌誘導(dǎo)0、6、12、