專利名稱：生產(chǎn)木糖醇或d－木酮糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有產(chǎn)生木糖醇或D-木酮糖的能力的新的微生物，和通過利用具有產(chǎn)生木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的方法。D-木酮糖可用作生產(chǎn)木糖醇的材料，木糖醇可用作食品工業(yè)等領(lǐng)域的甜味劑。
預(yù)期對作為天然存在的糖醇的木糖醇的需求在將來會(huì)增加。木糖醇是有前途的低能量的甜味劑，因?yàn)樗哂械偷臒崃坎⑶绎@示具有與蔗糖相當(dāng)?shù)奶鸲取Ａ硗?，由于其具有抗踽齒特性，將它用作為防踽齒的甜味劑。此外，由于木糖醇不提高血液葡萄糖水平，可將它用作為糖尿病治療中的流體治療方法(fluidtherapy)。為了這些原因，預(yù)期對木糖醇的需求在將來將會(huì)提高。
目前木糖醇的工業(yè)化生產(chǎn)主要依賴于D-木糖的氫化，如在美國專利4,008,825中公開的。通過植物材料如樹，稻草，玉米棒子，燕麥和其它富含木糖的材料的水解可以獲得用作為原料的D-木糖。
然而，通過植物材料水解生產(chǎn)的D-木糖具有缺點(diǎn)相當(dāng)昂貴，并具有高生產(chǎn)成本。例如，植物材料的水解處理的低產(chǎn)量引起所產(chǎn)生的D-木糖的低純度。因此必需通過在水解之后進(jìn)行離子交換處理除去用于水解的酸和染料。進(jìn)一步將獲得的D-木糖結(jié)晶以去除其它半纖維素的多糖。為了獲得適用于食用的D-木糖，需要進(jìn)一步的純化。這樣的離子交換處理和結(jié)晶處理導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加。
因此，已經(jīng)研制了可用于生產(chǎn)木糖醇的幾種方法，該方法利用了易于獲得的原料并且產(chǎn)生的廢料很少。例如已經(jīng)研制了利用其它戊糖醇作為起始物質(zhì)生產(chǎn)木糖醇的方法。這樣的易于獲得的戊糖醇之一是D-阿拉伯糖醇，并且通過利用酵母可以生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇(加拿大微生物學(xué)雜志，31，1985，457-471；微生物遺傳雜志，139，1993，1047-54)。如通過利用D-阿拉伯糖醇作為粗原料生產(chǎn)木糖醇的方法，可以提到的有在應(yīng)用微生物學(xué)，18，1969，1031-1035中報(bào)道的方法，該方法包括通過利用漢遜氏德巴利氏酵母ATCC20121發(fā)酵從葡萄糖生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇，然后利用弱氧化醋桿菌將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)變?yōu)镈-木酮糖，和通過季也蒙氏假絲酵母大豆變種的作用將D-木酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎谴肌?br> BP403392和EP421682公開了通過利用對滲透壓有抗性的酵母進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)D-阿拉伯醇，然后利用屬于醋桿菌屬，葡糖桿菌屬或克雷伯氏菌的細(xì)菌將D-阿拉伯醇轉(zhuǎn)變?yōu)镈-木酮糖，通過葡萄糖(木糖)異構(gòu)酶的作用從D-木酮糖形成木糖和D-木酮糖的混合物，通過氫化作用將獲得的木糖和D-木酮糖的混合物轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎谴肌Ｉa(chǎn)木糖醇的方法也公開了，包括初步濃縮木糖和D-木酮糖混合物中的木糖并且通過氫化將木糖轉(zhuǎn)變?yōu)槟咎谴肌?br> 但是，上面介紹的生產(chǎn)木糖醇的方法利用了通過發(fā)酵生產(chǎn)的D-阿拉伯醇作為起始物質(zhì)，并且通過多個(gè)步驟將它轉(zhuǎn)變。因此，與基于提取的方法相比經(jīng)濟(jì)實(shí)用考慮該過程是復(fù)雜的，不能令人滿意的過程。
因此，需要一種能夠通過從葡萄糖起始發(fā)酵的單個(gè)步驟生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的微生物，如用于其它糖和糖醇中生產(chǎn)。但是，至今還沒有具有生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的能力的細(xì)菌的報(bào)道。
另一方面，利用基因操作技術(shù)已經(jīng)對發(fā)酵木糖醇的細(xì)菌的繁育進(jìn)行了嘗試。國際公開WO 94/10325公開了通過利用將來源于屬于克雷伯氏菌屬的細(xì)菌的阿拉伯糖醇脫氫酶的基因和來源于屬于畢赤屬的細(xì)菌的木糖醇脫氫酶基因?qū)氲桨l(fā)酵阿拉伯糖醇的微生物(屬于假絲酵母屬，球擬酵母屬，或?qū)儆诮雍咸墙湍笇俚慕湍?獲得的重組微生物發(fā)酵從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇的方法。但是已經(jīng)有人報(bào)道了利用上面提到的重組微生物從400克/升葡萄糖生產(chǎn)15克/升的木糖醇，但是它沒有達(dá)到實(shí)際上有用的積累水平。此外將來源于不同種的基因?qū)氲缴厦嫣岬降闹亟M微生物，因此對其安全性的信息不是充分的。
根據(jù)上面提到的現(xiàn)有技術(shù)的狀態(tài)完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的之一是通過利用具有通過發(fā)酵從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物提供生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的方法。
為了達(dá)到上面提到的目的，本發(fā)明的發(fā)明人尋找了具有通過發(fā)酵從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物。對于通過發(fā)酵微生物(如酵母)直接生產(chǎn)糖醇，除了上面提到的阿拉伯糖醇發(fā)酵，也已經(jīng)報(bào)道了通過利用產(chǎn)酸接合糖酵母生產(chǎn)甘油(Arch.Biochem.，7，257-271(1945))，通過利用屬于Trychosporonoides屬的酵母生產(chǎn)赤蘚醇(Trychosporonoides sp.，生物技術(shù)通信，15，240-246(1964))等等。所有這些具有生產(chǎn)糖醇的能力的酵母顯示嗜高滲性(osmophilicity)，即在高滲透性壓力的培養(yǎng)基中良好生長。因此，盡管在嗜高滲性酵母中沒有發(fā)現(xiàn)具有生產(chǎn)木糖醇能力的微生物，本發(fā)明的發(fā)明人仍考慮在嗜高滲性微生物中應(yīng)該存在具有生產(chǎn)木糖醇能力的新的微生物，并且廣泛篩選了高滲性微生物。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在嗜高滲性微生物中具有從葡萄糖產(chǎn)生木糖醇和D-木酮糖的能力的微生物，并且這些微生物與已知的醋酸細(xì)菌類似(日本專利申請10-193472)。
基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)一步在醋酸細(xì)菌和類似的細(xì)菌中尋找具有生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖能力的微生物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了屬于葡糖桿菌，醋桿菌或弗拉特氏菌的并且具有從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖能力的微生物。由此完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明提供了生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于葡糖桿菌，醋桿菌或弗拉特氏菌屬并且具有從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖能力的微生物，并且從培養(yǎng)基收集木糖醇或D-木酮糖。
根據(jù)本發(fā)明在上面提到的生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的優(yōu)選的實(shí)施方案中，屬于葡糖桿菌的微生物選自于蠟狀葡糖桿菌或氧化葡糖桿菌，屬于醋桿菌屬的微生物選自于醋化醋桿菌、液化醋桿菌或巴氏醋桿菌，屬于弗拉特氏菌屬的微生物是金黃弗拉特氏菌。
根據(jù)本發(fā)明，可以有效地從便宜的粗原料例如葡萄糖有效地生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖。
下文中，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)的解釋。
用于本發(fā)明的微生物是屬于葡糖桿菌、醋桿菌或弗拉特氏菌屬并且具有從葡萄糖產(chǎn)生木糖醇或D-木酮糖的能力的微生物。
對于上面提到的微生物，特別值得提到的有蠟狀葡糖桿菌、氧化葡糖桿菌、醋化醋桿菌、液化醋桿菌、巴氏醋桿菌、金黃弗拉特氏菌等等。
對于用于本發(fā)明的特異性微生物菌株，可以列出下面的菌株蠟狀葡糖桿菌IFO3262氧化葡糖桿菌ATCC8147氧化葡糖桿菌IFO3293氧化葡糖桿菌LAM1839
氧化葡糖桿菌IFO3250氧化葡糖桿菌IFO3292氧化葡糖桿菌IFO3294氧化葡糖桿菌氧化亞種IFO3189氧化葡糖桿菌亞氧化亞種IFO3172氧化葡糖桿菌亞氧化亞種IFO3130木醋桿菌ATCC14851液化醋桿菌TACC14835巴氏醋桿菌IFO3222巴氏醋桿菌IFO3223金黃弗拉特氏菌IFO3245氧化葡糖桿菌ATCC8147，木醋桿菌ATCC 14851和液化醋桿菌ATCC14835可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(12301Parklawn Drive，Rockville，馬里蘭20852，美國)獲得。
蠟狀葡糖桿菌IFO3262，氧化葡糖桿菌IFO3293，氧化葡糖桿菌IFO3250，氧化葡糖桿菌IFO3292，氧化葡糖桿菌IFO3294，氧化葡糖桿菌氧化亞種IFO3189，氧化葡糖桿菌亞氧化亞種IFO3172，氧化葡糖桿菌亞氧化亞種IFO3130，巴氏醋桿菌IFO3222，巴氏醋桿菌IFO3223和金黃弗拉特氏菌IFO3245可以從大阪發(fā)酵研究所(日本，大阪532，Yodogawa-ku，17-85，Juso-honmachi 2-chome)獲得。
氧化葡糖桿菌IAM1839可以從東京大學(xué)分子和細(xì)胞生物學(xué)研究院(前身為應(yīng)用微生物學(xué)研究院)(日本，東京，Bumkyo-ku，Yayoi 1-chome)獲得。
通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有從培養(yǎng)液產(chǎn)生木糖醇或D-木酮糖能力的微生物(如上文提到的那些)以在培養(yǎng)基中積累木糖醇或D-木酮糖，或者兩者，從培養(yǎng)基中收集木糖醇和/或D-木酮糖而生產(chǎn)木糖醇和/或D-木酮糖。
由本發(fā)明方法產(chǎn)生的目的產(chǎn)物可以是木糖醇或D-木酮糖，或者是兩者。
可以適當(dāng)?shù)販y試上面提到的任何微生物的生產(chǎn)D-木酮糖的能力。對于木糖醇的生產(chǎn)，雖然可以適當(dāng)?shù)厥褂蒙厦嫣岬降娜魏挝⑸铮瑢儆谄咸菞U菌或醋桿菌屬的微生物是優(yōu)選的。特別地，對于生產(chǎn)木糖醇而言，蠟狀葡糖桿菌、氧化葡糖桿菌、醋化醋桿菌、液化醋桿菌和巴氏醋桿菌是優(yōu)選的。至于特定的菌株，下面的菌株對于生產(chǎn)木糖醇是優(yōu)選的。
蠟狀葡糖桿菌IFO3262氧化葡糖桿菌ATCC8147氧化葡糖桿菌IFO3292氧化葡糖桿菌亞氧化亞種IFO3130木醋桿菌ATCC14851液化醋桿菌ATCC14835巴氏醋桿菌IFO3222巴氏醋桿菌IFO3223對于本發(fā)明，可以使用具有從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的能力的屬于葡糖桿菌、醋桿菌或弗拉特氏菌的微生物菌株獲得的變異體或突變體。這樣的突變體菌株包括通過UV照射，N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理，乙基甲烷硫酸鹽(EMS)處理，硝酸處理，吖啶處理等而獲得的那些，以及通過遺傳工程技術(shù)例如細(xì)胞融合和遺傳重組等等獲得的遺傳重組菌株。
用于培養(yǎng)上面提到的微生物的培養(yǎng)基可以是含有常規(guī)的碳源，氮源，無機(jī)離子，以及(如果需要的話)有機(jī)營養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基。
碳源可以使用碳水化合物(例如葡萄糖)，醇(例如甘油)，有機(jī)酸等等?？紤]在已知的用于生產(chǎn)木糖醇的方法(例如用于從戊糖醇例如D-木糖和D-阿拉伯糖醇生產(chǎn)木糖醇的方法)中觀察到的特性，主要的碳源優(yōu)選地選自于己糖例如葡萄糖和果糖，二糖例如蔗糖和乳糖，或多糖例如淀粉。這些主要的碳源物質(zhì)可以10-60％的量，優(yōu)選的20-50％的量用于培養(yǎng)基?？蓪⑦@些碳源一次或分批加入到培養(yǎng)基中。
氮源可以使用氨氣，氨水，銨鹽等等。對于無機(jī)離子，如果需要可以加入鎂離子，磷酸離子，鉀離子，鐵離子，錳離子等等。對于有機(jī)營養(yǎng)，可以適當(dāng)?shù)厥褂镁S生素，氨基酸和含有它們的物質(zhì)例如肝臟提取物，酵母提取物，麥芽提取物，胨，肉提取物，玉米提取液，酪蛋白分解產(chǎn)物等等。
對培養(yǎng)條件也沒有特別的限定。但是通?？梢詫⑽⑸镌趐H 5-8和25-40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。通過攪拌或振蕩使培養(yǎng)在有氧條件下完成。對于培養(yǎng)時(shí)間，將微生物適當(dāng)?shù)嘏囵B(yǎng)直到消耗掉主要的碳源，即通常3-8天。
以常規(guī)方法將如上所述的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的木糖醇和/或D-木酮糖分離并且從培養(yǎng)物中收集。特別地，在通過離心、過濾等從培養(yǎng)物去除固體物質(zhì)之后，將殘留的溶液通過使用活性炭、離子交換樹脂等脫色并脫鹽，并且從該溶液中將木糖醇和/或D-木酮糖結(jié)晶。從培養(yǎng)物中分離和收集木糖醇和/或木酮糖的方法比從植物材料水解物中分離和收集的方法更容易，因?yàn)殡s質(zhì)含量較低。
可用已知的方法通過氫化將產(chǎn)生的D-木酮糖轉(zhuǎn)化為木糖醇。
參照下面的實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。在實(shí)施例中，在下面的條件下利用高效液相層析(HPLC)分析所產(chǎn)生木糖醇和D-木酮糖。
層析柱Shodex SC1011(Showa Denko的產(chǎn)品)流動(dòng)相20％乙腈/80％鈣-EDTA的50ppm水溶液流速1.0毫升/分鐘溫度75℃檢測RI檢測器將含有0.2％硫酸銨，0.1％的磷酸二氫鉀，0.3％的磷酸氫二鉀，0.5％硫酸鎂和0.5％的酵母提取物(pH6.0)的培養(yǎng)基以每個(gè)管4毫升的量加入到測試管，并且加熱到120℃，加熱20分鐘滅菌。將單獨(dú)滅菌的D-葡萄糖以5％的濃度加入到該培養(yǎng)基。上面所述的濃度(％)以w/v％表示。
將表1提到的各個(gè)菌株接種到上面所述的培養(yǎng)基，并且在30℃振蕩培養(yǎng)1天。獲得的培養(yǎng)基用作為種子培養(yǎng)基。以每個(gè)培養(yǎng)瓶50毫升的量將具有相同于上面提到的組成的培養(yǎng)基(不同的是D-葡萄糖)加入到500毫升的Sakaquchi培養(yǎng)瓶，并且通過加熱到120℃，加熱20分鐘滅菌。分別以濃度為5％和4％將單獨(dú)滅菌的葡萄糖和碳酸鈣加入到培養(yǎng)基。以2％的濃度將該種子培養(yǎng)基接種到該培養(yǎng)基，并且在30℃振蕩培養(yǎng)4天。然后，在通過離心去除細(xì)菌細(xì)胞之后，通過HPLC定量分析培養(yǎng)基產(chǎn)生的木酮糖和D-木糖醇。結(jié)果顯示于表1。
表1
*ND是指“沒有測定”。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖的方法，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于葡糖桿菌、醋桿菌或弗拉特氏菌屬的并且具有從葡萄糖生產(chǎn)木糖醇或D-木酮糖能力的微生物以在培養(yǎng)基中積累木糖醇或D-木酮糖，并且從培養(yǎng)基中收集木糖醇或D-木酮糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中屬于葡糖桿菌屬的微生物選自蠟狀葡糖桿菌或氧化葡糖桿菌，屬于醋桿菌屬的微生物選自醋化醋桿菌、液化醋桿菌或巴氏醋桿菌，屬于弗拉特氏菌屬的微生物是金黃弗拉特氏菌。
全文摘要
通過在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于葡糖桿菌,醋桿菌或弗拉特氏菌屬的并且具有生產(chǎn)木糖醇或D－木酮糖能力的微生物,在培養(yǎng)基中積累木酮糖或D－木糖醇,并且從培養(yǎng)基中收集木酮糖或D－木糖醇的直接發(fā)酵方法,從葡萄糖生產(chǎn)木酮糖或D－木糖醇。
文檔編號C12P19/02GK1269421SQ0010418
公開日2000年10月11日 申請日期2000年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月20日
發(fā)明者竹內(nèi)園子, 外內(nèi)尚人, 橫關(guān)健三 申請人:味之素株式會(huì)社