專利名稱：液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程與技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種靈芝多糖和靈芝酸的生產(chǎn)工藝，尤其涉及一種發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝。
靈芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.)為擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬真菌。自古以來，在東亞地區(qū)人們就將其作為藥物或補(bǔ)品食用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)靈芝中所含有效成分主要有多糖類(即靈芝多糖)、三萜類(主要為靈芝酸類)、甾醇類、生物堿類、呋喃類衍生物、蛋白質(zhì)、多肽和有機(jī)鍺核苷等。在靈芝藥用價(jià)值被廣泛揭示的同時(shí)，靈芝的產(chǎn)量成為抑制靈芝應(yīng)用的瓶頸，因?yàn)樵谧匀唤缰幸吧撵`芝十分稀少，且其中靈芝酸含量為1毫克/100毫克干重，遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。同靈芝人工栽培相比，發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝有效成份由于生產(chǎn)周期短、勞動(dòng)力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是一種更有效的方法。
有關(guān)靈芝深層發(fā)酵研究開始于七十年代，當(dāng)時(shí)的研究側(cè)重于如何確保靈芝菌絲體成功發(fā)酵以及如何獲得較多的生物量。八十年代以來，人們開始注意如何獲得其生物活性物質(zhì)，其中主要集中在靈芝多糖(特別是胞外多糖)的發(fā)酵生產(chǎn)研究方面，如文獻(xiàn)李平作，徐柔，章克昌，靈芝胞外多糖深層發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化；無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)1998，17(4)26-30報(bào)道了一種方法，但該方法只能生產(chǎn)靈芝多糖；文獻(xiàn)羅立新，姚汝華，周少奇，靈芝深層培養(yǎng)工藝的研究；華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)1997，25(5)67-70報(bào)道了一種方法，但該方法靈芝多糖產(chǎn)量?jī)H為1.0-2.1克/升左右；日本專利公開特許公報(bào)特開平4-304890，5pp公開了另一種主要生理活性物質(zhì)—靈芝酸的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，但其未提及靈芝多糖生產(chǎn)，且所得的產(chǎn)物中靈芝酸的含量?jī)H為0.46-1.0毫克/100毫克干重；還有不少的專利和文獻(xiàn)也公開和報(bào)道了各種方法，但是，其主要生理活性物質(zhì)均較低，同時(shí)也只報(bào)道了靈芝多糖的生產(chǎn)。
同時(shí)值得注意的是，由于靈芝多糖和靈芝酸分別為初級(jí)代謝產(chǎn)物和二次代謝產(chǎn)物，兩者的發(fā)酵生產(chǎn)條件不一，需要加以綜合考察來同時(shí)優(yōu)化靈芝多糖(包括胞外和胞內(nèi)多糖)及靈芝酸的生產(chǎn)過程。因此有關(guān)用液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的研究至今未見報(bào)道。
綜上所述，至今尚無(wú)成熟的液體發(fā)酵法生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝，因此，盡快開發(fā)研究一種通過液體發(fā)酵法能夠同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的技術(shù)，是人們所十分期望的。
本發(fā)明的目的在于公開一種液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝，以滿足人們的需要。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的發(fā)明人認(rèn)為，只要采用合適的菌種，在同一發(fā)酵過程中采用適當(dāng)培養(yǎng)條件，便可從靈芝發(fā)酵液中分離獲得高產(chǎn)率的靈芝胞外多糖，從靈芝菌絲體中抽提獲得高產(chǎn)率的靈芝胞內(nèi)多糖和高產(chǎn)率的靈芝酸，從而為工業(yè)化經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸奠定基礎(chǔ)。
根據(jù)上述構(gòu)思，發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)，提出了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的如下所述的技術(shù)方案使用的微生物用于生產(chǎn)所述的靈芝多糖和靈芝酸的微生物為靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌種，具體的菌株如下67軍軍直衛(wèi)生所發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.5.75的菌株；上海吳淞中學(xué)發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.5.110的菌株；日本京大發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.5.533的菌株；中國(guó)貴州發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.5.616的菌株；中科院微生物研究所發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.5.644的菌株；
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No.5.653的菌株。
上述菌種的有關(guān)性質(zhì)可以參閱中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)菌種目錄，本發(fā)明不再贅述。
培養(yǎng)方法用上述菌屬的菌種采用液體好氧發(fā)酵法、液體好氧發(fā)酵-液體靜置培養(yǎng)法或液體靜置培養(yǎng)法，以蔗糖或葡萄糖為碳源、蛋白胨和酵母膏為氮源作為種子培養(yǎng)基，并加入適量的無(wú)機(jī)鹽和維生素，將菌種接種到液體培養(yǎng)基，通過液體發(fā)酵而獲得含有靈芝胞外多糖的發(fā)酵液以及含有靈芝胞內(nèi)多糖和靈芝酸的靈芝菌絲體，上述培養(yǎng)方法對(duì)溫度并無(wú)嚴(yán)格要求，一般在室溫進(jìn)行?，F(xiàn)分別敘述如下；①液體好氧發(fā)酵法接種10-1000毫克干重/升種子于有培養(yǎng)基的搖瓶中，20-35℃，80-180轉(zhuǎn)/分鐘回旋培養(yǎng)，發(fā)酵4-12天；②液體好氧發(fā)酵-液體靜置培養(yǎng)法將上述發(fā)酵產(chǎn)物靜置培養(yǎng)，靜置6-20天，結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液。在靜置培養(yǎng)階段細(xì)胞量也有增加，同時(shí)也有利于靈芝酸合成；③靜置培養(yǎng)法接種10-1000毫克干重/升種子于有培養(yǎng)基的搖瓶中，20-35℃，靜置培養(yǎng)10～20天；培養(yǎng)基可以采用常規(guī)的含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和維生素等成分的培養(yǎng)基。其中碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、糖蜜或土豆汁等；氮源有酵母膏、蛋白胨、酪蛋白或黃豆餅粉等；無(wú)機(jī)鹽包括KH2PO4和MgSO4。其中當(dāng)碳源中加入土豆汁時(shí)將更有利于細(xì)胞快速生長(zhǎng)，葡萄糖、蔗糖有利于胞外多糖合成，麥芽糖有利于獲得高的細(xì)胞量，乳糖有利于胞內(nèi)多糖合成。有機(jī)氮源有利于細(xì)胞吸收利用。
胞外多糖通過乙醇沉淀法獲得。胞內(nèi)多糖通過堿溶解菌絲體后，乙醇沉淀法獲得。靈芝酸通過乙醇水溶液提取后經(jīng)過初步純化獲得。以上所說的方法均為現(xiàn)有技術(shù)，在許多文獻(xiàn)中已有闡述，本發(fā)明不再贅述。
采用常規(guī)的分析方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析測(cè)試，結(jié)果表明，所述的方法可以同時(shí)獲得靈芝胞外多糖、胞內(nèi)多糖和靈芝酸，靈芝酸含量可達(dá)2.8毫克/100毫克，胞內(nèi)和胞外多糖總量高達(dá)2.34克/升，明顯高于以往報(bào)道和市售靈芝。
綜上所述，本發(fā)明獲得的靈芝酸含量明顯高于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)水平，胞內(nèi)多糖含量略高于文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)水平而胞外多糖含量同文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)水平接近。通過本方法可以在靈芝發(fā)酵過程中以較高產(chǎn)率同時(shí)獲得靈芝酸和靈芝多糖這兩種靈芝主要藥理成分。相對(duì)于現(xiàn)有采用類似液體發(fā)酵手段僅生產(chǎn)一種靈芝多糖而言，本方法由于不會(huì)增加復(fù)雜附加設(shè)備且培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便，如在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)靈芝酸和靈芝多糖這二種高值有效成分的同時(shí)生產(chǎn)，必將大幅度提高生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)效益，也會(huì)帶來可觀的社會(huì)效益。這些產(chǎn)品都具有較高的藥用價(jià)值，可廣泛用于醫(yī)藥和食品保健等行業(yè)。由此可見，本發(fā)明所述的方法確為一種具有工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。
以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的有關(guān)細(xì)節(jié)作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1采用的菌種CGMCC No.5.616；發(fā)酵液體培養(yǎng)基中含有葡萄糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母膏5克/升，KH2PO41克/升，MgSO40.5克/升，VB10.05克/升。發(fā)酵溫度為30℃，接種15毫克菌絲體于50毫升培養(yǎng)基/250毫升搖瓶中培養(yǎng)8天。結(jié)束發(fā)酵，收獲菌絲體和發(fā)酵液，并進(jìn)行以下分析測(cè)定在15000rpm下離心分離獲得菌絲體15.4克/升以及發(fā)酵液；發(fā)酵液中加入4倍體積的95％的乙醇，混合過夜，在10000rpm下離心沉淀得胞外靈芝多糖。經(jīng)1摩爾/升NaOH溶解，采用濃硫酸-苯酚法測(cè)定多糖含量為0.8克/升；菌絲體在45℃干燥，取100毫克，加入3毫升50％乙醇提取靈芝酸兩次，在4000rpm下離心，上清液50℃干燥，用2毫升水溶解，并用2毫升氯仿萃取，取氯仿相，再用5％小蘇打2毫升萃取，取水相，加入2摩爾/升鹽酸至pH＝3，加入氯仿，取氯仿相，揮干后用乙醇溶解后紫外比色法測(cè)定靈芝酸，計(jì)算得含量為1.43毫克/100毫克干重，產(chǎn)量為214毫克/升；菌絲體100毫克，加入1摩爾/升NaOH溶解，濃硫酸-苯酚法測(cè)定胞內(nèi)多糖為8毫克/100毫克干重，產(chǎn)量為1.1克/升。
實(shí)施例2好氧發(fā)酵條件同實(shí)例1，發(fā)酵4天后，停止搖瓶振蕩，轉(zhuǎn)為靜置培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)8天后，結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液，進(jìn)行有效成份分析。測(cè)定方法同實(shí)例1，結(jié)果，細(xì)胞干重、胞外多糖、胞內(nèi)多糖和靈芝酸產(chǎn)量分別為20.9克/升，0.47克/升，1.4克/升(胞內(nèi)含量6.6毫克/100毫克干重)，581毫克/升(胞內(nèi)含量2.8毫克/100毫克干重)。
實(shí)施例3液體發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為乳糖，發(fā)酵條件同實(shí)例1，培養(yǎng)10天后，結(jié)束發(fā)酵并收獲菌體和發(fā)酵液。分析結(jié)果，細(xì)胞干重、胞外多糖、胞內(nèi)多糖和靈芝酸產(chǎn)量分別為16.81克/升，0.35克/升，1.99克/升(胞內(nèi)含量11.83毫克/100毫克)，207毫克/升(胞內(nèi)含量1.40毫克/100毫克干重)。
實(shí)施例4采用的菌種CGMCC No.5.75；每升發(fā)酵液培養(yǎng)基中含200克馬鈴薯提取液0.6升，蔗糖30克/升，蛋白胨2克/升，KH2PO41.5克/升，MgSO40.75克/升，VB10.001克/升。發(fā)酵溫度為30℃，接種1毫克菌絲體于50毫升培養(yǎng)基/250毫升搖瓶，培養(yǎng)12天。結(jié)束發(fā)酵，收獲菌絲體和發(fā)酵液，分析測(cè)試方法同實(shí)施例1，分析結(jié)果表明，細(xì)胞干重、胞內(nèi)多糖和靈芝酸產(chǎn)量分別為8克/升，0.36克/升(胞內(nèi)含量4.5毫克/100毫克)，112毫克/升(胞內(nèi)含量1.40毫克/100毫克干重)。
實(shí)施例5～10采用菌種分別為CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCCCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一種；培養(yǎng)方法與實(shí)施例4相同，分析測(cè)試結(jié)果細(xì)胞干重和胞內(nèi)多糖含量分別為9克/升和3.5毫克/100毫克干重、5.5克/升和4.4毫克/100毫克干重、2.8克/升和4.7毫克/100毫克干重、8.5克/升和4.8毫克/100毫克干重、2.8克/升和5.0毫克/100毫克干重以及2.7克/升和4.2毫克/100毫克干重。
權(quán)利要求
1.一種液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝，其特征在于，以靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌種為微生物，采用如下步驟進(jìn)行的接種10-1000mg干重/L種子于有培養(yǎng)基的搖瓶中，回旋培養(yǎng)，發(fā)酵4～12天，然后采用常規(guī)的方法從發(fā)酵產(chǎn)物中收集靈芝多糖和靈芝酸；所說的菌種為CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一種，培養(yǎng)基為常規(guī)的含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和維生素成分的培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，發(fā)酵后再靜置培養(yǎng)6-20天，結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液。
3.一種液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝，其特征在于，以靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌種為微生物，采用如下步驟進(jìn)行的接種10-1000mg干重/L種子于有培養(yǎng)基的搖瓶中，靜置培養(yǎng)10～20天，然后采用常規(guī)的方法從發(fā)酵產(chǎn)物中收集靈芝多糖和靈芝酸；所說的菌種為CGMCC No.5.75、CGMCC No.5.110、CGMCC No.5.533、CGMCC No.5.616、CGMCC No.5.644或CGMCC No.5.653中的一種，培養(yǎng)基為常規(guī)的含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和維生素成分的培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，培養(yǎng)溫度為20～35℃。
5.如權(quán)利要求2所述的工藝，其特征在于，培養(yǎng)溫度為20～35℃。
6.如權(quán)利要求3所述的工藝，其特征在于，培養(yǎng)溫度為20～35℃。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的工藝，其特征在于，所說的培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖或乳糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn)靈芝多糖和靈芝酸的工藝。本發(fā)明采用的微生物為靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌種,采用液體好氧發(fā)酵法、液體好氧發(fā)酵－液體靜置培養(yǎng)法或液體靜置培養(yǎng)法進(jìn)行生產(chǎn),可以同時(shí)獲得靈芝胞外多糖、胞內(nèi)多糖和靈芝酸,靈芝酸含量可達(dá)2.8毫克/100毫克,胞內(nèi)和胞外多糖總量高達(dá)2.34克/升,培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便,本發(fā)明所述的方法為一種具有工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1264743SQ0011195
公開日2000年8月30日 申請(qǐng)日期2000年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月10日
發(fā)明者鐘建江, 方慶華 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)