專利名稱：一種克隆植物減數(shù)分裂基因的方法和一種植物減數(shù)分裂基因的cDNA序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明提供了利用簡并性引物通過嵌合式PCR克隆植物減數(shù)分裂基因的方法，提供了水稻減數(shù)分裂基因OsDMC1的cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。
植物的生活史由有性世代和無性世代交替完成，減數(shù)分裂是完成這種交替的關(guān)鍵事件。減數(shù)分裂的重要特征是核DNA經(jīng)過一次復(fù)制并伴隨兩次連續(xù)的細(xì)胞分裂，使最終形成的生殖細(xì)胞的染色體數(shù)減半。因此，雌雄性細(xì)胞受精形成的合子的染色體數(shù)能恢復(fù)到正常數(shù)量。在減數(shù)分裂過程中，染色體的正常分離依賴于合線期同源染色體精確配對形成二價(jià)體，而同源重組和聯(lián)會復(fù)合體是影響同源染色體配對的主要因素(Kleckner N.，Proc Natl Acad Sci.USA，1996，938167-8174；Zikler D.和Kleckner N.，Annu Rev Genet，1998，32619-697)。
酵母減數(shù)分裂基因DMC1已被克隆(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456)。DMC1是酵母減數(shù)分裂特異的基因，僅在減數(shù)分裂前期I表達(dá)，是減數(shù)分裂DNA重組和聯(lián)會復(fù)合體形成所必需的(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456；Bishop DK.，Cell，1994，791081-1092)。DMC1蛋白(Dmc1)是大腸桿菌(E.coli)RecA蛋白(recA)的同源蛋白，RecA蛋白能在DNA上聚合形成螺旋狀的DNA-蛋白質(zhì)纖維，是一種DNA重組和修復(fù)蛋白(Story RM.等，Nature，1992，355318-324；Nature，1992，355374-376)。酵母dmc1突變體喪失DNA重組功能，不能形成聯(lián)會復(fù)合體，其減數(shù)分裂被阻斷在前期I(Bishop DK.等，Cell，1992，69439-456)。已從人(Habu T.等，Nucleic Acid Res，1996，24470-477)、鼠(Habu T.等，Nucleic Acid Res，1996，24470-477；Pittman DL.等，Mol Cell，1998，1697-705；Yoshida K.等，Mol Cell，1998，1707-718)等動物體內(nèi)克隆到DMC1同源基因。人HsDmc1有與酵母Dmc1相似的功能(Li I.等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9411221-11226)，鼠MmDmc1是減數(shù)分裂同源染色體聯(lián)會必需的(Yoshida K.等，Mol Cell，1998，1707-718)。
在植物中，已克隆了雙子葉植物擬南芥的DMC1同源基因AtDMC1(KlimyukVI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4；Doutriaux MP.等，Mol Gen Genet，1998，257283-291)，報(bào)道了AtDMC1的DNA序列(登記號U43652)。T-DNA插入AtDMC1基因內(nèi)，缺失AtDMC1的功能，完全破壞了減數(shù)分裂同源染色體配對能力，而對植株的營養(yǎng)生長無明顯影響，突變體的同源染色體不能配對形成二價(jià)體，減數(shù)分裂期的花粉母細(xì)胞和大胞子母細(xì)胞僅包含10個單價(jià)體，但該突變體能產(chǎn)生約1.5％的正常后代。本發(fā)明人認(rèn)為，這是由于擬南芥染色體數(shù)少(5對)，染色體隨機(jī)分離組合形成了少數(shù)可育的雌雄配子。確切原因尚待研究(Couteau F.等，Plant Cell，1999，791081-1092)。該結(jié)果暗示，減數(shù)分裂基因DMC1的功能在植物中是保守的。
除AtDMC1外，在GenBank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道了單子葉植物大麥DMC1同源基因的DNA序列(登記號AF234170)和雙子葉植物大豆DMC1同源基因的cDNA序列(登記號U66836)。但這僅僅是兩個基因序列報(bào)告，沒有分析基因的表達(dá)特性，不知它們是否是在生殖器官特異性表達(dá)以及基因結(jié)構(gòu)特性，因此它們的可用性尚不確定。
從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)已知，DMC1及其同源基因的DNA序列都含有內(nèi)含子，例如，酵母DMC1有一個內(nèi)含子，人HsDMC1有12個內(nèi)含子，擬南芥AtDMC1有13個內(nèi)含子。這些內(nèi)含子在基因轉(zhuǎn)錄成成熟的mRNA時(shí)被剪切掉，mRNA僅包含了基因的外顯子序列。擬南芥是目前已知的基因組最小的植物，植株較小，容易用T-DNA誘導(dǎo)，也易于篩選由T-DNA插入的目的基因的突變體，但這種方法不適于其它植物基因功能的分析。除T-DNA外，反義RNA(或稱反義基因)技術(shù)是研究基因功能的另一重要與常用的技術(shù)。反義RNA技術(shù)是利用基因的cDNA序列，將其反向與植物表達(dá)載體上的啟動子連接。該重組載體被轉(zhuǎn)到植物體后產(chǎn)生與植物體內(nèi)該基因正常(正義)mRNA互補(bǔ)的反義RNA，兩者結(jié)合形成二聚體，使正義mRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，基因的功能隨之喪失。因此，用反義RNA技術(shù)比較容易獲得所需要的突變體，也不受植物物種的限制，應(yīng)用廣泛。獲得的基因cDNA序列是進(jìn)行反義RNA構(gòu)建的首要條件。
通過計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)檢索尚沒有發(fā)現(xiàn)可用于研究植物減數(shù)分裂基因功能的cDNA序列和與之相關(guān)的專利。
本發(fā)明的目的是提供一種利用簡并性引物MP1-MP4通過嵌合式PCR克隆植物減數(shù)分裂基因的方法，提供高等植物減數(shù)分裂基因的cDNA序列，以便通過轉(zhuǎn)反義基因技術(shù)調(diào)控植物的有性生殖。本發(fā)明的技術(shù)方案如下1)RNA的分離實(shí)驗(yàn)材料為水稻。從水稻花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的穎花中提取總RNA，隨后用無RNA水解酶的DNA水解酶除去RNA中殘留的DNA，得到無DNA污染的RNA。2)水稻DMC1同源基因cDNA片段的分離根據(jù)在酵母Dmc1和擬南芥AtDmc1中保守的氨基酸序列合成的簡并性引物MP1GGNATHAAYGCNGGNGAYGT；MP2GGNAARGTNGCNTAYATHGA；MP3ACNGCNACRTTRAAYTCYTCNGC和MP4GCRTGNGCNARNTGNCCNCC。以由RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA作模板，通過嵌合式PCR(nested PCR)分離水稻DMC1同源基因的cDNA片段。引物對MP1和MP4用于第一輪PCR，而MP2和MP3用于第一輪PCR產(chǎn)物的再擴(kuò)增。
第一輪PCR產(chǎn)物經(jīng)第二輪再擴(kuò)增后，得到一個cDNA片段。該片段經(jīng)瓊脂糖電泳純化后，克隆到有關(guān)載體上并測序。此cDNA片段有一個連續(xù)的閱讀框(ORF)，編碼109個氨基酸，該氨基酸序列與酵母Dmc1和擬南芥AtDmc1相應(yīng)序列的一致性分別為58％和91％，說明此cDNA片段是水稻DMC1同源基因cDNA序列的一部分。此水稻DMC1同源基因稱為OsDMC1。3)cDNA 3′和5′端的分離根據(jù)用嵌合式PCR分離得到的水稻OsDMC1 320bp的cDNA序列合成引物MP5CCGGCCTGAACGAATTGT、MP6TGGGATGGATGCCAATGC、MP7TCTCTCAGCAATCGGCACAA和MP8AACAGCATTGGCATCCAT。通過cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACEs)(Forhman MA.等，Proc Natl AcadSci USA，1988，858998-9002)分離OsDMC1 cDNA的3′和5′端。用RNA和寡聚-dT銜接頭(oligo-dT adapter)(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物合成第一鏈cDNA，隨后用基因特異的引物MP5、MP6和銜接頭引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增得到OsDMC1 cDNA的3′端，通過瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到有關(guān)載體上并測序。
用基因特異的引物MP7與MP8和GIBCO-BRL 5′RACE試劑盒(GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，按試劑盒的說明書通過PCR擴(kuò)增得到OsDMC1cDNA的5′端，通過瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到有關(guān)載體上并測序。
最后將320 bp cDNA序列、3′和5′端序列拼結(jié)成OsDMC1全長cDNA序列，如SEQ NO 1所示。4)OsDMC1的表達(dá)用非放射性的地高辛(DIG)標(biāo)記的OsDMC1 cDNA探針，通過Northern印漬雜交分析OsDMC1在水稻穎花、葉、幼芽和根中的表達(dá)，檢測不到雜交信號。因此用RT-PCR Southern印漬雜交分析OsDMC1的表達(dá)。OsDMC1 cDNA特異的正義和反義引物分別是GTCCAAGCAGTACGACGAAGG和TTCCTCGACATGTGCAAAGT。以水稻微管蛋基因tubA作對照，所用的正義和反義引物分別是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
分別用來源于穎花、葉、幼芽和根的RNA合成第一鏈cDNA，以稀釋的第一鏈cDNA作PCR模板。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖電泳分離后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用DIG標(biāo)記的OsDMC1 cDNA探針雜交。雜交結(jié)果顯示OsDMC1主要在穎花中表達(dá)，在根中有微量表達(dá)，而在葉和幼芽中不表達(dá)。該結(jié)果與擬南芥AtDMC1相似，RT-PCR分析結(jié)果表明AtDMC1在生殖器官中表達(dá)活性最高，在葉中有微量表達(dá)(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。而原位雜交和AtDMC1啟動子-GUS融合基因分析顯示AtDMC1僅在花藥和雌蕊的減數(shù)分裂細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明人認(rèn)為，造成其與RT-PCR結(jié)果差異的原因可能是RT-PCR過于靈敏的原因(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4)。5)OsDMC基因的特征OsDMC1 cDNA全長為1348 bp(SEQ NO 1))，由1035bp長的閱讀框(ORF)、45bp的5′端非翻譯區(qū)和268bp的3′端非翻譯區(qū)組成。閱讀框從核苷酸46開始到核苷酸1080結(jié)束，終止密碼是TGA。Poly(A)信號ACTAAA位于核苷酸1168-1173。Poly(A)位點(diǎn)在核苷酸1337。該cDNA編碼由344個氨基酸組成的蛋白質(zhì)(OsDmc1)(SEQ NO 2)。OsDmc1的分子質(zhì)量是37.6kD，等電點(diǎn)是5.53，其與酵母Dmc1、鼠MmDmc1、人HsDmc1和擬南芥AtDmc1氨基酸序列的同源性分別為51.8％、59.5％、60％和81.7％。OsDmc1含有在上述提及的Dmc1及其同源蛋白和其它NTP-結(jié)合蛋白中存在的ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)GXXXXGKT(OsDmc1氨基酸殘基133-140)。本發(fā)明人首次從OsDmc1中鑒定出基元(motif)LXXXGIXXXDXXK(氨基酸34-46)和LXXXKGXSXXKV(氨基酸66-77)，分析發(fā)現(xiàn)該基元在上述提及的Dmc1及其同源蛋白中是保守的，可能與OsDmc1在減數(shù)分裂中作用的特異性有關(guān)。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)OsDmc1有一個cAMP/cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)KRKS(氨基酸101-104)、一個酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)TGSD(氨基酸94-97)、一個酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)KKLQDAGIY(氨基酸45-53)、五個蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)[TKK(氨基酸62-64)、SGK(氨基酸137-139)、TFR(氨基酸171-173)、SGR(氨基酸239-141)與TIR(氨基酸302-304)]和七個十四烷?；稽c(diǎn)[GINSGD(氨基酸38-43)、GIYTCN(氨基酸51-56)、GLSEAK(氨基酸71-76)、GGIETL(氨基酸121-126)、GMDANA(氨基酸185-190)、GMFITD(氨基酸282-287)與GIMDAK(氨基酸338-343)]。本發(fā)明的有益效果GenBank數(shù)據(jù)庫報(bào)道了擬南芥DMC1同源基因AtDMC1的DNA序列(登記號U43652)。研究表明，AtDMC1在生殖器官雄蕊和雌蕊中特異表達(dá)(KlimyukVI.和Jones JDG.，Plant J.，1997，111-4)。T-DNA插入突變AtDMC1，使之功能缺失，對植株?duì)I養(yǎng)生長無明顯影響，但導(dǎo)致減數(shù)分裂同源染色體不能配對，使雌雄性不育(Couteau F.等，Plant Cell，1999，791081-1092)。除AtDMC1外，GenBank數(shù)據(jù)庫還報(bào)道了單子葉植物大麥DMC1同源基因的DNA序列(登記號AF234170)和雙子葉植物大豆DMC1同源基因的cDNA序列(登記號U66836)，但這僅僅是兩個基因序列報(bào)告，沒有基因的表達(dá)分析，不知它們是否是在生殖器官特異性表達(dá)以及基因結(jié)構(gòu)特性，因此其可用性尚不確定。
依據(jù)本發(fā)明人所掌握的資料，在克隆基因的方法上，本發(fā)明是第一個用兩對簡并性引物(MP1與MP4及MP2與MP3)、通過嵌合式PCR得到植物DMC1同源基因cDNA克隆。這說明所用的簡并性引物MP1-MP4正位于植物DMC1同源基因的外顯子區(qū)。由于是簡并性引物，該引物包含了編碼所對應(yīng)氨基酸保守區(qū)的各種密碼組合，它們能用于分離所有植物DMC1同源基因的cDNA克隆。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物、由其組成的引物組合和用該引物進(jìn)行的嵌合式PCR適用于各種高等植物DMC1同源基因cDNA克隆的分離。
本發(fā)明報(bào)道的水稻減數(shù)分裂基因OsDMC1，是首例單子葉植物DMC1同源基因cDNA序列的報(bào)道。表達(dá)分析證明，該基因在生殖器官中特異(優(yōu)勢)表達(dá)；用該cDNA序列進(jìn)行的反義RNA分析證明OsDMC1控制水稻減數(shù)分裂同源染色體的配對，基因功能缺失導(dǎo)致雌雄性不育。因此它也是首例知道基因功能和表達(dá)特性的植物DMC1同源基因cDNA序列。OsDMC1編碼的蛋白質(zhì)(OsDmc1)與已知功能的酵母Dmc1、鼠MmDmc1、人HsDmc1和擬南芥AtDmc1氨基酸序列的同源性分別是51.8％、59.3％、60％和81.7％，表明OsDMC1是水稻的減數(shù)分裂基因。鑒于此，本發(fā)明所報(bào)道的OsDMC1 cDNA可用于通過反義RNA等技術(shù)產(chǎn)生雄性不育、雌性不育或雌雄不育植株；也可用于生產(chǎn)雜交種子，以提高作物的產(chǎn)量；也可根據(jù)需要控制植物的育性，例如，使楊樹不育，以減少楊樹種子(白色的毛)對環(huán)境尤其是城市環(huán)境的污染。
具體實(shí)施例方式一、水稻OsDMC1 cDNA的分離1)RNA的分離用Trizol試劑盒(GIBICO-BRL，Life Technologies，USA)從花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的穎花中提取總RNA，隨后用無RNA水解酶的DNA水解酶(TaRaKaBiotechnology(Dalian)Co.，Ltd)除去RNA中殘留的DNA。除去DNA后的RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。2)cDNA片段的分離根據(jù)在酵母Dmc1和擬南芥AtDmc1中保守的氨基酸序列合成的簡并性引物MP1、MP2、MP3和MP4。以由RNA反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA作模板，通過嵌合式PCR分離OsDMC1的cDNA片段。引物對MP1和MP4用于第一輪PCR，而MP2和MP3用于第一輪PCR產(chǎn)物的再擴(kuò)增。
為了合成第一鏈cDNA，將4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加無菌水使混合物體積達(dá)到12微升，70℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。
第一輪PCR反應(yīng)混合物為20微升，含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1微升第一鏈cDNA，40pmol MP1，40pmolMP4，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，48-55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72℃保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖電泳后呈淺的彌散狀。
第二輪PCR反應(yīng)混合物為20微升，含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％Nonidet P-40，1微升第一輪PCR產(chǎn)物，40pmol MP2，40pmolMP3，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，48-55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72℃保溫10分鐘。第二輪PCR擴(kuò)增后得到OsDMC1的320bp cDNA片段。該片段經(jīng)瓊脂糖電泳純化后，克隆到pGEM-T載體(Promega Corporation，USA)上，測序。3)cDNA 3′和5′端的分離根據(jù)用嵌合式PCR分離的水稻OsDMC1的320bp cDNA序列合成引物MP5、MP6、MP7和MP8。通過cDNA末端的快速擴(kuò)增方法分離OsDMC1 cDNA的3′和5′端。
對于3′的分離，將5微克RNA和10pmol寡聚-dT銜接頭(CTGATCTAGAGGTACCGGATCTTTTTTTTTTTTTTTTT)引物混合，加無菌水使混合物體積達(dá)到12微升，70℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，LifeTechnologies，USA)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。該cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的體積50微升，含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2，0.05％ Nonidet P-40，1微升cDNA，10pmol MP5，10pmol銜接頭引物(CTGATCTAGAGGTACCGGATC)，200μM dNTPs和2.5U Pfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，52-60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72℃保溫10分鐘。第二次PCR使用1微升第一次PCR的產(chǎn)物作模板和MP6與銜接頭引物對，其它條件與第一次PCR的相同。第二次PCR擴(kuò)增后得到OsDMC1 cDNA的3′端cDNA片段，瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到pGEM-T載體上，測序。
對于OsDMC1 cDNA的5′端片段克隆，將5微克RNA與2.5pmol MP7混合，加無菌水使混合物體積達(dá)到12微升，70℃保溫10分鐘，迅速轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1微升 SuperScript II RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。用GlassMax Cartridge(GIBCO-BRL，LifeTechnologies，USA)純化第一鏈cDNA，除去多余的引物。按GIBCO-BRL 5′RACE試劑盒(GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)的指導(dǎo)，在第一鏈cDNA的5′端加多聚G尾。加尾的cDNA用作PCR模板。第一次PCR混合物的體積50微升，含10mM Tris-HCl，pH8.3、50mM KCl、2mM MgCl2、0.05％ Nonidet P-40、1微升加尾的cDNA、10pmol MP7、10pmol UAP引物、200uM dNTPs和2.5UPfu DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1分鐘；隨后在94℃變性1分鐘，52-60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘3秒鐘，共進(jìn)行30個循環(huán)；最后在72℃保溫10分鐘。第二次PCR使用1微升第一次PCR的產(chǎn)物作模板和MP8與UAP引物對，其它條件與第一次PCR的相同。第二次PCR擴(kuò)增后得到OsDMC1 cDNA的5′端cDNA片段，瓊脂糖電泳純化后，將其克隆到pGEM-T載體上，測序。
最后將320bp cDNA序列、3′和5′端序列拼結(jié)成全長的OsDMC1 cDNA序列(SEQ NO 1)。二、OsDMC1的表達(dá)分析用RT-PCR southern印漬雜交分析OsDMC1的表達(dá)。OsDMC1 cDNA特異的正義和反義引物分別是GTCCAAGCAGTACGACGAAGG和TTCCTCGACATGTGCAAAGT。以水稻微管蛋基因tubA作對照，所用的正義和反義引物分別是TCAGATGCCCAGTGACAGA和TTGGTGATCTCGGCAACAGA。
用來源于穎花、葉、幼芽和根的總RNA合成cDNA。將4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加無菌水使混合物體積達(dá)到12微升，70℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs和2微升0.1mM DTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。稀釋100倍的cDNA用作PCR的模板。50微升的PCR反應(yīng)混合物含1微升稀釋的cDNA模板、10pmol正義引物、10pmol反義引物、400μM dNTPs、1X GC PCR緩沖液和2.5U的LATaq DNA聚合酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)。PCR反應(yīng)條件是94℃預(yù)變性1分鐘；94℃，1分鐘，55-60℃，1分鐘，72℃，1分鐘30秒鐘，25個循環(huán)；72℃，10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖電泳分離后，通過毛細(xì)管作用轉(zhuǎn)移至Hybond N+尼龍膜上(Amershanm Pharmacia Biotech Ltd，EnGLand)，用DIG標(biāo)記的OsDMC1 cDNA探針雜交(Boehringer Mannheim，Germany)。雜交結(jié)果顯示OsDMC1主要在穎花中表達(dá)，在根中有微量表達(dá)，而在葉和幼芽中不表達(dá)。該結(jié)果與擬南芥AtDMC1相似，RT-PCR分析結(jié)果表明AtDMC1在生殖器官中表達(dá)活性最高，在葉中有微量表達(dá)(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。而原位雜交和AtDMC1啟動子-GUS融合基因分析顯示AtDMC1僅在花藥和雌蕊的減數(shù)分裂細(xì)胞中表達(dá)，Klimyuk和Jones認(rèn)為造成其與RT-PCR的結(jié)果差異的原因可能是RT-PCR過于靈敏(Klimyuk VI.和Jones JDG.，Plant J，1997，111-4)。三、OsDMC1的功能分析1)PCR擴(kuò)增所需的cDNA片段依據(jù)SEQ NO 1的OsDMC1 cDNA全序列，合成正義引物GACTGAGCTCGATGCTGGTATCTACACTTGC和反義引物CTGATCTAGATTCCTCGACATGTGCAAAGT。正義引物的5′端有一個SacI位點(diǎn)，反義引物3′端有一個XbaI位點(diǎn)，以便能將cDNA反向與啟動子連結(jié)。
用來源于減數(shù)分裂期穎花的RNA合成第一鏈cDNA。將4微克RNA和0.5微克寡聚-dT15引物混合，加無菌水使混合物體積達(dá)到12微升，70℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)至冰浴中，加入4微升5X第一鏈緩沖液，1微升10mM dNTPs，2微升0.1mMDTT，42℃預(yù)熱2分鐘后，加入1微升SuperScript II RNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/微升，GIBCO-BRL，Life Technologies，USA)，42℃反應(yīng)50分鐘，合成第一鏈cDNA，最后在70℃加熱15分鐘，失活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)混合物為50微升，含1X PCR緩沖液，1微升第一鏈cDNA，10pmol正義引物，10pmol反義引物，200uM dNTPs，2.5單位Taq DNA聚合酶(5U/微升，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，混合物在94℃預(yù)變性1分鐘，隨后在94℃，1分鐘，55-60℃，1分鐘和72℃，1分鐘30秒鐘，30個循環(huán)，最后在72℃延伸10分鐘。得到的cDNA長1015bp(核苷酸190至核苷酸1205)，覆蓋了近全長的閱讀框。將該cDNA片段連接到pGEM載體(Promega Corporation，USA)上，得到重組質(zhì)粒pRCM30。2)用限制性內(nèi)切酶XbaI和SacI在37℃分別雙酶切質(zhì)粒pRCM30和pBI121(Clontech Laboratories，Inc，USA)，瓊脂糖電泳純化后，得到雙酶切的OsDMC1 cDNA片段和pBI121。用T4DNA連接酶(TaKaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd)將cDNA片段連接到pBI121上，得到重組質(zhì)粒pARM。在pARM中，OsDMC1 cDNA反向與CaMV35S啟動子連接。3)用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切pARM，瓊脂糖電泳純化后，得到CaMV 35S啟動子-OsDMC1 cDNA-NOS終止子的構(gòu)建體，將該構(gòu)建體與植物表達(dá)載體連接，獲得在植物中表達(dá)OsDMC1反義RNA的重組表達(dá)載體pAEM.。4)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，經(jīng)頭孢霉素和潮霉素篩選獲得抗性愈傷組織。將生長良好、結(jié)構(gòu)致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含潮霉素的預(yù)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周，隨后轉(zhuǎn)到含潮霉素的分化培養(yǎng)基進(jìn)一步培養(yǎng)，得到潮霉素抗性的再生植株。5)用CTAB法(Murray和Thompson，Nucl Acid Res，1980，84321-4325)提取基因組DNA，通過PCR和Northern印漬雜交進(jìn)一步檢測得到轉(zhuǎn)OsDMC1反義基因的植株。6)將轉(zhuǎn)基因水稻T1代自交種子在含潮霉素的培養(yǎng)基上發(fā)芽，在溫度28℃(白天)/25℃(夜間)和光照14小時(shí)/黑暗10小時(shí)條件下生長，10天后檢測抗性，并對轉(zhuǎn)基因植株后代分離比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)7)用I2-KI染色檢查轉(zhuǎn)基因植株花粉育性和最后觀測結(jié)實(shí)率，證明轉(zhuǎn)反義基因?qū)е轮仓甏菩坌圆挥?br> 附錄SEQ NO 1CGCCGGCCGCCTCCGCCTACAGGTGCGGGGGGTCTGTGTGAGCAGATGGCGCCGTCCAAGCAGTACGACGAAGGCGGGCAGCTCCAGCTCATGGATGCAGAGAGGATCGAGGAGGAGGAGGAGTGCTTCGAGTCCATCGACAAGTTAATCTCGCAAGGGATAAACTCTGGAGATGTGAAGAAGCTGCAGGATGCTGGTATCTACACTTGCAATGGCCTCATGATGCATACAAAGAAGAGCCTGACAGGAATCAAGGGATTATCTGAAGCAAAGGTAGACAAGATCTGTGAAGCAGCTGAAAAGCTTCTGAGCCAGGGCTTCATGACAGGAAGTGATCTCCTTATCAAGCGGAAGTCTGTTGTTCGGATCACCACTGGGAGCCAGGCACTTGATGAGCTGCTTGGCGGAGGGATTGAAACACTCTGCATCACAGAGGCATTTGGAGAGTTCCGATCAGGGAAGACCCAGTTGGCTCACACTCTATGTGTCTCCACTCAGCTTCCAATTCACATGCATGGGGGGAATGGGAAGGTCGCTTATATCGATACTGAGGGAACATTCCGGCCTGAACGAATTGTGCCGATTGCTGAGAGATTTGGGATGGATGCCAATGCTGTTCTTGATAATATCATATATGCTCGTGCATACACCTATGAGCACCAGTACAACCTTCTCCTTGGCCTTGCCGCTAAGATGGCTGAAGAGCCTTTCAGGCCTCTGATTGTGGATTCTGTGATCGCACTATTCCGTGTCGATTTCAGTGGCAGGGGTGAACTTGCAGAGCGCCAGCAAAAATTGGCACAGATGCTCTCCCGCCTTACTAAAATAGCTGAGGAGTTCAATGTTGCAGTGTACATCACCAACCAAGTGATTGCCGACCCAGGTGGTGGAATGTTCATAACTGACCTGAAAAAACCAGCGGGAGGCCACGTGCTGGCGCATGCAGCTACCATCCGGTTGATGCTGAGGAAAGGCAAAGGAGAGCAGCGTGTCTGCAAGATCTTTGATGCCCCTAACCTGCCTGAGGGAGAAGCTGTTTTCCAGGTAACATCAGGTGGAATAATGGATGCGAAAGACTGAATGTTCATTGAGGGTGCTTCCTGTCTTCAAATTATTCAGGTTTCTCCTAGTAAATTCCTGCATAGGCCATATAGGTTTGGTACATTGACTAAACTACTACTGCTACTTTGCCACTGTCGAGGAAATATGCAACCTCATTTATCCAGACGATTATACCTTAAAATGGGTATTTTTCTATGCTTATGAGATCAACAGTTGTACTGAAACAAATACAGTATTGGCTTAAGTGAAAATATATAAGAGGGTTACATGATGGTAAAAAAAAAAASEQ NO 21MAPSKQYDEG GQLQLMDAER21IEEEEECFES IDKLISQGIN41SGDVKKLQDA GIYTCNGLMM61HTKKSLTGIK GLSEAKVDKI81CEAAEKLLSQ GFMTGSDLLI101KRKSVVRITT GSQALDELLG121GGIETLCITE AFGEFRSGKT141QLAHTLCVST QLPIHMHGGN161GKVAYIDTEG TFRPERIVPI181AERFGMDANA VLDNIIYARA201YTYEHQYNLL LGLAAKMAEE221PFRPLIVDSV IALFRVDFSG241RGELAERQQK LAQMLSRLTK261IAEEFNVAVY ITNQVIADPG281GGMFITDLKK PAGGHVLAHA301ATIRLMLRKG KGEQRVCKIF321DAPNLPEGEA VFQVTSGGIM341DAKD
權(quán)利要求
1.一種克隆基因的方法，其特征在于用兩對簡并性引物通過嵌合式PCR方法克隆基因；
2.權(quán)利要求1的方法，其中所說的基因?yàn)橹参餃p數(shù)分裂基因；
3.權(quán)利要求1的方法，其中所說的簡并性引物包括MP1、MP2、MP3和MP4。其各自的序列為MP1GGNATHAAYGCNGGNGAYGT；MP2GGNAARGTNGCNTAYATHGA；MP3ACNGCNACRTTRAAYTCYTCNGC和MP4GCRTGNGCNARNTGNCCNCC
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于簡并性引物中的MP1與MP4進(jìn)行第一輪PCR，簡并性引物中的MP2與MP3和以上述第一輪PCR的產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二輪PCR；
5.用權(quán)利要求1的方法所獲得的一種水稻減數(shù)分裂基因OsDMC1的cDNA序列，其特征在于該cDNA序列具有如SEQ NO 1所示的核苷酸1到1348的序列；
6.權(quán)利要求5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的部分序列；
7.權(quán)利要求5的cDNA序列，其中所說的cDNA序列包括該序列的同源序列；
8.一種多肽序列，其特征在于該多肽序列是由權(quán)利要求5的cDNA序列所編碼，且具有如SEQ NO 2所示的氨基酸1到344的序列；
9.權(quán)利要求8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的部分序列；
10.權(quán)利要求8的多肽序列，其中所說的多肽序列包括該序列的同源序列；
11.一種反義RNA(基因)構(gòu)建體，其特征在于該構(gòu)建體根據(jù)權(quán)利要求5至7的任何一種核苷酸序列所構(gòu)建。
12.權(quán)利要求11的反義RNA(基因)構(gòu)建體，其中所說的反義RNA(基因)構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn)化植物以控制植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
13.權(quán)利要求11的反義RNA(基因)構(gòu)建體，其中所說的反義RNA(基因)構(gòu)建體可用于生產(chǎn)雜交種子；
14.權(quán)利要求11的反義RNA(基因)構(gòu)建體，其中所說的反義RNA(基因)構(gòu)建體可用于使楊樹不育，以減少楊樹種子對環(huán)境的污染；
15.權(quán)利要求11的反義RNA(基因)構(gòu)建體，其中所說的反義RNA(基因)構(gòu)建體能夠轉(zhuǎn)化單子葉植物，以控制該植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
16.權(quán)利要求11的反義RNA(基因)構(gòu)建體，其中所說的反義RNA(基因)構(gòu)建體能夠轉(zhuǎn)化水稻，以控制該植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性；
17.權(quán)利要求11的反義RNA(基因)構(gòu)建體，其中所說的反義RNA(基因)構(gòu)建體能夠轉(zhuǎn)化雙子葉植物，以控制該植物的雄性育性、雌性育性或/和雌雄性育性。附錄SEQ NO 1CGCCGGCCGCCTCCGCCTACAGGTGCGGGGGGTCTGTGTGAGCAGATGGCGCCGTCCAAGCAGTACGACGAAGGCGGGCAGCTCCAGCTCATGGATGCAGAGAGGATCGAGGAGGAGGAGGAGTGCTTCGAGTCCATCGACAAGTTAATCTCGCAAGGGATAAACTCTGGAGATGTGAAGAAGCTGCAGGATGCTGGTATCTACACTTGCAATGGCCTCATGATGCATACAAAGAAGAGCCTGACAGGAATCAAGGGATTATCTGAAGCAAAGGTAGACAAGATCTGTGAAGCAGCTGAAAAGCTTCTGAGCCAGGGCTTCATGACAGGAAGTGATCTCCTTATCAAGCGGAAGTCTGTTGTTCGGATCACCACTGGGAGCCAGGCACTTGATGAGCTGCTTGGCGGAGGGATTGAAACACTCTGCATCACAGAGGCATTTGGAGAGTTCCGATCAGGGAAGACCCAGTTGGCTCACACTCTATGTGTCTCCACTCAGCTTCCAATTCACATGCATGGGGGGAATGGGAAGGTCGCTTATATCGATACTGAGGGAACATTCCGGCCTGAACGAATTGTGCCGATTGCTGAGAGATTTGGGATGGATGCCAATGCTGTTCTTGATAATATCATATATGCTCGTGCATACACCTATGAGCACCAGTACAACCTTCTCCTTGGCCTTGCCGCTAAGATGGCTGAAGAGCCTTTCAGGCCTCTGATTGTGGATTCTGTGATCGCACTATTCCGTGTCGATTTCAGTGGCAGGGGTGAACTTGCAGAGCGCCAGCAAAAATTGGCACAGATGCTCTCCCGCCTTACTAAAATAGCTGAGGAGTTCAATGTTGCAGTGTACATCACCAACCAAGTGATTGCCGACCCAGGTGGTGGAATGTTCATAACTGACCTGAAAAAACCAGCGGGAGGCCACGTGCTGGCGCATGCAGCTACCATCCGGTTGATGCTGAGGAAAGGCAAAGGAGAGCAGCGTGTCTGCAAGATCTTTGATGCCCCTAACCTGCCTGAGGGAGAAGCTGTTTTCCAGGTAACATCAGGTGGAATAATGGATGCGAAAGACTGAATGTTCATTGAGGGTGCTTCCTGTCTTCAAATTATTCAGGTTTCTCCTAGTAAATTCCTGCATAGGCCATATAGGTTTGGTACATTGACTAAACTACTACTGCTACTTTGCCACTGTCGAGGAAATATGCAACCTCATTTATCCAGACGATTATACCTTAAAATGGGTATTTTTCTATGCTTATGAGATCAACAGTTGTACTGAAACAAATACAGTATTGGCTTAAGTGAAAATATATAAGAGGGTTACATGATGGTAAAAAAAAAAASEQ NO 21MAPSKQYDEG GQLQLMDAER21IEEEEECFES IDKLISQGIN41SGDVKKLQDA GIYTCNGLMM61HTKKSLTGIK GLSEAKVDKI81CEAAEKLLSQ GFMTGSDLLI101KRKSVVRITT GSQALDELLG121GGIETLCITE AFGEFRSGKT141QLAHTLCVST QLPIHMHGGN161GKVAYIDTEG TFRPERIVPI181AERFGMDANA VLDNIIYARA201YTYEHQYNLL LGLAAKMAEE221PFRPLIVDSV IALFRVDFSG241RGELAERQQK LAQMLSRLTK261IAEEFNVAVY ITNQVIADPG281GGMFITDLKK PAGGHVLAHA301ATIRLMLRKG KGEQRVCKIF321DAPNLPEGEA VFQVTSGGIM341DAKD
全文摘要
本發(fā)明提供了利用簡并性引物通過嵌合式PCR克隆植物減數(shù)分裂基因的方法,提供了水稻減數(shù)分裂基因OsDMCl的全長cDNA序列及其編碼的氨基酸多肽序列。該cDNA序列全長1,348 bp,編碼344個氨基酸的多肽。該cDNA可用于構(gòu)建反義基因構(gòu)建體。利用該構(gòu)建體可控制植物的有性生殖。
文檔編號C12N15/10GK1351168SQ0013008
公開日2002年5月29日 申請日期2000年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月27日
發(fā)明者王臺, 丁兆軍 申請人:中國科學(xué)院植物研究所