專利名稱：轉(zhuǎn)基因萬壽菊屬植物的產(chǎn)生的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬(Tagetes)能育植物的方法，其包含以下步驟(a)培養(yǎng)欲轉(zhuǎn)化的起始植物，并獲得合適的外植體，(b)將DNA序列轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，(c)選擇已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及(d)再生轉(zhuǎn)基因能育植物。而且該方法包含可通過例如根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)將DNA序列轉(zhuǎn)移入欲轉(zhuǎn)化植物或其外植體。而且該方法包含可用葉作為外植體，可與土壤桿菌共培養(yǎng)2至8天并可在共培養(yǎng)期間使用含有生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基。該方法進(jìn)一步包含例如可用膦絲菌素選擇以及用生長調(diào)節(jié)劑的兩種不同組合以再生完整的轉(zhuǎn)基因植物。此方法適于轉(zhuǎn)化萬壽菊種或孔雀草種。本發(fā)明也涉及通過所述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因能育萬壽菊屬植物自身及它們的轉(zhuǎn)基因種子。
屬于紫菀科的萬壽菊屬植物顯示出很多令人感興趣的特性，這解釋了它作為農(nóng)作物及觀賞植物的用途。該屬中的許多種可產(chǎn)生具有殺線蟲、殺真菌和殺昆蟲作用的生物活性化合物；可累積具有抗氧化和生色活性的類黃酮和類胡蘿卜素；為耐鹽的；以及因?yàn)樗鼈兓ㄉ突ㄐ蔚膶挿秶米餮b飾目的。
萬壽菊屬根的殺線蟲作用是基于噻吩衍生物的合成。噻吩衍生物為雜環(huán)含硫化合物，其主要累積在根和下胚軸。它們的特征為含一個(gè)硫原子的五元環(huán)。來源于氨基酸半胱氨酸的巰基參與環(huán)的形成。也可在萬壽菊屬中形成的重要噻吩代表物為例如BBT(5-(丁-3-烯-1-炔基)-2，2’-二噻吩基)、BBTOAc(5-(4-乙酰氧基-1-丁炔基)-2，2’-二噻吩基)、BBTOH(5-(4-羥基-1-丁炔基)-2，2’-二噻吩基)以及α-T(2，2’5’，2”-三噻吩基)。
萬壽菊屬的花瓣含有9-22％的類黃酮和約27％的類胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素占0.4％、隱黃素酯占1.5％且葉黃素酯占86.1％(Benk等人，Riechst，Aromen und Koerpen，26(1976)，216-221)。
根據(jù)1975的估計(jì)，存在2000種不同的類黃酮。一些重要的代表物為例如250種已知結(jié)構(gòu)的花色素甙、60種查耳酮、20種橙酮以及350種已知結(jié)構(gòu)的黃酮，它們?nèi)季哂蓄伾匦浴?50種黃酮醇和15種異黃酮類化合物代表物可賦予植物如吞噬保護(hù)特性或?qū)φ婢卸拘宰饔谩?br> 類胡蘿卜素屬于類萜大組。它們大部分為四萜類。類胡蘿卜素-烴也稱為胡蘿卜素，它們的氧化衍生物為葉黃素。類胡蘿卜素為所有植物、藻類和藍(lán)細(xì)菌中光合成活性膜的必需組分。它們可在葉綠體的色素系統(tǒng)(光反應(yīng)中心)中找到，并參與初級光吸收過程且為光合作用的光子通道。而且它們也作為植物中一系列其它光誘導(dǎo)過程的光受體。許多花呈黃色是因?yàn)槠渚哂泻惡}卜素且通常不含葉綠素的葉綠體。植物類胡蘿卜素也可作為植物生長調(diào)節(jié)劑脫落酸和維生素A生物合成的前體，其對人類和動(dòng)物營養(yǎng)是重要的。它作為潛在的抗癌劑已引起人們越來越多的興趣，且它被用作化妝品和食品工業(yè)的著色劑。來自萬壽菊屬干燥和粉碎花瓣的類胡蘿卜素已被用作家禽飼料添加劑，用于強(qiáng)化小雞卵黃的顏色。
目前增加或提高植物中類胡蘿卜素含量以及類胡蘿卜素組成可帶來大的經(jīng)濟(jì)利益。
已知的萬壽菊屬品種中有限的遺傳變異性大大限制了借助常規(guī)生物學(xué)的植物育種法來改善這些品種的可能性。
遺傳工程法允許外源基因直接轉(zhuǎn)移入植物基因組中。該方法稱為轉(zhuǎn)化，所得植物為轉(zhuǎn)基因的。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的基本前提條件是合適轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的可用性、選擇性標(biāo)志的存在、對成功轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的鑒定以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞向完整能育植物的再生。
現(xiàn)在有許多方法可用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化雙子葉植物最常用的方法為根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。該方法利用了土壤細(xì)菌將遺傳物質(zhì)整合入植物基因組的天然能力。其它合適的方法例如通過聚乙二醇誘導(dǎo)DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電穿孔法、超聲法或顯微注射法、以及通過顯微注射或常量注射將完整的細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化入組織或胚、組織電穿孔法、在含DNA的溶液中培育干燥胚、種子真空浸潤以及生物彈射擊的基因轉(zhuǎn)移。
Horsch等人(科學(xué)(science)228(1985)，1229-1231)、Fraley等人(美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983)，4803-4807)和Bevans等人(自然(Nature)304(1983)，184-187)描述了用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物，其中使用的植物為組織培養(yǎng)外植體。許多根癌土壤桿菌菌株可將含有的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入萬壽菊屬的種中，例如菌株EHA101[pEHA101]、EHA105[pEHA105]、LBA4404[pAL4404]、C58C1[pMP90]和C58C1[pGV2260]。Hood等人描述了菌株EHA101[pEHA101](細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)168(1986)，1291-1301)，Hood等人描述了菌株EHA105[pEHA105](轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Research)2(1983)，208-218)，Hoekema等人描述了菌株LBA4404[pAL4404](自然303(1983)，179-181)，Koncz和Schell等人描述了菌株C58C1[pMP90](分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)204(1986)，383-396)以及Deblaere等人描述了菌株C58C1[pGV2260](核酸研究(Nucl.Acids Res.)13(1985)，4777-4788)。
用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株除了包含其卸甲Ti-質(zhì)粒外，還包含欲轉(zhuǎn)移的具有T-DNA的雙質(zhì)粒，其中所述雙質(zhì)粒原則上包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因和欲轉(zhuǎn)移基因。這兩個(gè)基因必須具備轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和終止信號。雙質(zhì)粒可通過例如電穿孔或其它轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)移入農(nóng)桿菌菌株(Mozo &Hooykaas，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)16(1991)，917-918)。原則上植物外植體與農(nóng)桿菌菌株的共培養(yǎng)需要兩到三天。
外源基因可以組成型、誘導(dǎo)型(通過生物和非生物因子)、組織特異的或發(fā)育特異的方式表達(dá)。一種相關(guān)組成型表達(dá)例如是通過花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)35S啟動(dòng)子在植物中進(jìn)行的，Shewmaker等人(病毒學(xué)(Virology)140(1985)，281-288)和Gardner等人(植物分子生物學(xué)6(1986)，221-228)描述了這種表達(dá)。
可使用的選擇性標(biāo)記基因?yàn)槔鏱ialophos抗性基因(bar)、卡那霉素或G418抗性基因(NPT II)以及DOGR1基因。bialophos抗性基因最初是從吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)中分離的。它編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)，后者可對膦絲菌素(PPT)的游離氨基乙?；?，從而使PPT去毒(de Block等人，EMBO J.6(1987)，2513-2518)。NPT II基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，后者通過磷酸化作用降低卡那霉素、新霉素、G418和巴農(nóng)霉素的抑制作用。基因DOGR1為從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中分離的(Sonnewald和Ebneth，EP 0 807 836)。它編碼2-脫氧葡萄糖-6-磷酸鹽磷酸酶，后者賦予對2-DOG的抗性(Randez-Gil等人，酵母(Yeast)11(1995)，1233-1240)。
盡管萬壽菊屬具有有趣的生物技術(shù)特性，它以前并不常用作重組修飾的對象。萬壽菊屬用作重組改進(jìn)的前提條件是良好的再生系統(tǒng)。Ketel(Physiol.Plant.93(1986)，298-304)、Khotari和Chandra(Hortscience19(1984a)，703-705)以及[lacuna](J.Plant Physiol.122(1986)，235-241)開發(fā)了用葉作為起始外植體通過器官發(fā)生進(jìn)行的再生。Khotari和Chandra也描述了從未成熟的、未受精的花盤再生植物(J.PlantPhysiol.117(1984b)，105-108)。下胚軸也可用于再生(Belarmino等人，日本育種雜志(Jpn J.Breed)42(1992)，835-841)。
Talou等人描述了Tagetes laxa根培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化和建立(Planta Médica60(1994)，260-262)，但接下來再生為轉(zhuǎn)基因能育植物的轉(zhuǎn)化方法至今在萬壽菊屬尚未見描述。
紫菀科其它已知屬為例如有已知種藥蒲公英(Taraxacum officinale)的蒲公英屬(Taraxacum)(dandelion)、大麗花屬(Dahlia)、有已知種向日葵(Helianthus annus)的向日葵屬(Helianthus)(sunflower)、紫菀屬(Aster)、金盞花屬(Calendula)(calendula)、飛廉屬(Carduus)(simplepappus)、菊苣屬(Cichorium)等。除了向日葵外，在該科的所有屬中沒有或僅有不充分的適于該種轉(zhuǎn)化的體外技術(shù)或其它技術(shù)。盡管紫菀科的單個(gè)代表物在形態(tài)學(xué)上相對一致，體外再生和轉(zhuǎn)化技術(shù)不能通用，因此針對例如向日葵所開發(fā)出的轉(zhuǎn)化方法不適用于其它屬，例如萬壽菊屬。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因萬壽菊屬能育植物的方法。
本發(fā)明的方法第一次使轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬植物細(xì)胞可再生為能育轉(zhuǎn)基因植物。
產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬植物的方法包括以下步驟(a)培養(yǎng)欲被轉(zhuǎn)化的起始植物，并獲得合適的外植體，(b)將DNA序列轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，(c)篩選已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及(d)再生這些已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，使成為能育轉(zhuǎn)基因植物。
直接和間接基因轉(zhuǎn)移均為合適的轉(zhuǎn)化方法。可成功使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可使用大范圍的起始外植體例如子葉、葉、下胚軸、枝條、根、愈傷組織、成熟和未成熟種子或花組織?；蜣D(zhuǎn)移可通過與農(nóng)桿菌菌株的簡單共培養(yǎng)/培育或濕潤實(shí)現(xiàn)，或者通過外植體與所述的細(xì)菌培養(yǎng)物的支持真空浸潤實(shí)現(xiàn)。在此方法中使用作為輔助的飼養(yǎng)培養(yǎng)物是有利的。包含轉(zhuǎn)移所需遺傳信息的Ti-或Ri-質(zhì)粒的每種農(nóng)桿菌菌株均適于作為轉(zhuǎn)化載體。合適的農(nóng)桿菌菌株為EHA101[pEHA101]、EHA105[pEHA105]、LBA4404[pAL4404]、C58C1[pMP90]和C58C1[pGV2260]。病毒載體似乎也適用于萬壽菊屬的轉(zhuǎn)化。其它將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移入萬壽菊屬的方法為例如聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔法、超聲法或顯微注射法、以及通過顯微注射或常量注射將完整的細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化入組織或胚、組織電穿孔法、在含DNA的溶液中培育干燥胚、種子真空浸潤，參見Galun，E.和Breiman，A.編輯的轉(zhuǎn)基因植物(Transgenic Plants，Imperial College Press，1997)。也可使用粒子槍用于轟擊大范圍的外植體，例如葉和愈合組織。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化可使用所有這樣的基因轉(zhuǎn)移載體載體中包含轉(zhuǎn)移T-DNA所必需的邊界序列(左和右邊界，分別為LB和RB)、攜帶在合適啟動(dòng)子和終止子控制下的一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記或報(bào)告基因和/或進(jìn)一步包含也在合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯單位控制下的有用基因或目標(biāo)基因?？尚械倪x擇性標(biāo)記或報(bào)告基因不僅可為bar/PAT、NPT II和DOGR1，也可為例如下列的來自轉(zhuǎn)座子Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因、章魚堿合成酶和胭脂堿合成酶基因(兩者均來自質(zhì)粒pTi的T區(qū))、大腸桿菌(E.coli)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)aroA基因(其編碼EPSP合成酶，從而介導(dǎo)對草甘膦的抗性)、大腸桿菌葡糖醛酸酶基因、螢光素酶基因和目前可得到的變種中的GFP基因(其編碼自發(fā)熒光蛋白質(zhì)，最初專門為綠色熒光)。進(jìn)一步地，所有其它編碼抗代謝抗性、抗生素抗性或除草劑抗性的基因也可用作選擇性標(biāo)記基因，參見Wilmink，A.和Dons，J.J.M.(植物分子生物學(xué)11(1993)，165-185)。也可使用陽性選擇系統(tǒng)，例如WO94/20627中所述的對糖的利用能力的獲得。
將DNA序列轉(zhuǎn)移入欲轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬植物或其外植體優(yōu)選地通過根癌土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明的再生培養(yǎng)基具有0.5-5％，優(yōu)選地1-3％的蔗糖濃度。如果合適的話，也可用其它糖類—葡萄糖或果糖或其它的糖代替蔗糖。
根據(jù)本發(fā)明的再生培養(yǎng)基進(jìn)一步包含生長調(diào)節(jié)劑例如生長素和/或生長素結(jié)合物，以及細(xì)胞分裂素和/或細(xì)胞分裂素結(jié)合物。合適的生長素有天然生長素以及合成生長素。天然生長素為吲哚乙酸(IAA)，合成生長素的實(shí)例為3-吲哚丁酸(IBA)、1-萘乙酸(NAA)以及除草劑2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。其它起生長素作用的除草劑也可作為生長調(diào)節(jié)劑。生長素結(jié)合物為生長素(IAA)與天冬氨酸、葡萄糖、肌醇及其它物質(zhì)形成的化合物。再者在為細(xì)胞分裂素的情況下，也可用天然細(xì)胞分裂素例如玉米素和合成組分如6-芐基氨基嘌呤(BAP)和6-糠基氨基嘌呤(激動(dòng)素)。玉米素核糖核苷通常作為細(xì)胞分裂素結(jié)合物使用。生長素和細(xì)胞分裂素在每種情況下可以單一組分使用，也可以生長素或細(xì)胞分裂素混合物使用。單一生長調(diào)節(jié)劑的濃度為0.05-10mg/l，優(yōu)選地0.1-5mg/l。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在外植體與細(xì)菌共培養(yǎng)期間或之后培養(yǎng)基中首先補(bǔ)充生長調(diào)節(jié)劑芐基氨基嘌呤和吲哚乙酸的培養(yǎng)基(1期)。共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移外植體至同樣的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基中還額外包含用于抑制細(xì)菌生長的抗生素和用于集中轉(zhuǎn)基因細(xì)胞材料的現(xiàn)行選擇劑，所述抗生素為例如羧芐青霉素、羧噻吩青霉素-棒酸復(fù)合劑、替卡西林、頭孢噻肟或β-bactyl。對每種情況14天后轉(zhuǎn)移至同樣組成的新鮮培養(yǎng)基，直至枝條芽和小枝條長出(持續(xù)時(shí)間約4-6周)。接下來用包含生長調(diào)節(jié)劑3-吲哚丁酸和赤霉酸GA3而非芐基氨基嘌呤和吲哚乙酸的培養(yǎng)基用作進(jìn)一步的枝條延伸和根的發(fā)育(2期)。
根據(jù)本發(fā)明用于產(chǎn)生萬壽菊屬轉(zhuǎn)基因能育植物的再生方法可用于以下種孔雀草、萬壽菊、T.laxa、T.minuta、T.lucida、T.argetina cabrera、T.tenuifolia、T.lemmonii或T.bipinata等。
實(shí)施例1
雙質(zhì)粒pPTGI的構(gòu)建為構(gòu)建雙質(zhì)粒pPTGI(


圖1A)，使用了質(zhì)粒pGPTV-Bar(Becker，D.等人，植物分子生物學(xué)20(1992)，1195-1197)。通過用限制性酶EcoRI和Sma I切割去除該質(zhì)粒缺失啟動(dòng)子的GUS基因。接下來用克列諾聚合酶填平突出端，并將該片段與PstI片段連接。該P(yáng)st I片段包含有內(nèi)含子的葡糖醛酸基因(GUS-IV2)(Vancanneyt，分子普通遺傳學(xué)220(1990)，245-250)且用同樣方式處理。
為構(gòu)建雙質(zhì)粒pPTGIDOG，通過PCR法擴(kuò)增DOGR1基因及其鄰近的35S啟動(dòng)子區(qū)和ocs終止子區(qū)。用由Sonnewald和Ebneth在EP0807836中描述的pBinAR-DOGR1構(gòu)建體作為模板序列。用兩條引物35S Xba I和Ocs Xba I進(jìn)行擴(kuò)增。35S Xba I與質(zhì)粒pBinAR 35S啟動(dòng)子的第1至24位核苷酸同源(Hofgen和Willmitzer，植物科學(xué)(Plant Science)66(1990)，221-230)并且在5’末端額外包含Xba I識別區(qū)(5’-ATTCTAGACATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA-3’)。Ocs XbaI與質(zhì)粒pBinAR ocs終止子區(qū)的后24個(gè)核苷酸同源并且包含額外的XbaI限制性位點(diǎn)(5’-ATTCTAGAGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG-3’)。用克列諾聚合酶將擴(kuò)增片段從其突出單式末端游離，并與Hind III接頭連接，克隆至質(zhì)粒pBS+(Stratagene，加利福利亞，美國)。序列分析后，將包含35S啟動(dòng)子、DOGR1基因及ocs終止子區(qū)的完整片段作為HindIII片段克隆入HindIII切割的載體pPTGI。
圖1顯示了雙質(zhì)粒載體pPTGI(5007bp)T-DNAs(
圖1A)和pPTGI-DOGR1(6209bp)(
圖1B)T-DNAs的基因圖譜，它們均用于轉(zhuǎn)化萬壽菊屬?？s略語具有如下含義35S-P CaMV 35S啟動(dòng)子35S-T CaMV 35S終止子NOS-P 胭脂堿合成酶啟動(dòng)子uidA β-葡糖醛酸酶基因bar膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因LB 左邊界
RB 右邊界IV2 基因ST-LS1的第二個(gè)內(nèi)含子pAg7 基因7 poly(A)信號DOGR1 釀酒酵母S288c的2-DOG-磷酸鹽磷酸酶基因ocs 章魚堿合成酶終止子實(shí)施例2膦絲菌素(PPT)毒性的測定體外建立的基因型TAG80和TAG81(Genbank，IPK Gatersleben)的孔雀草植物的葉橫切至中央脈絡(luò)，切為10-60mm2大小的圓盤并置于含2％蔗糖、3mg/l芐基氨基嘌呤(BAP)、1mg/l吲哚乙酸(IAA)和不同PPT濃度的MS培養(yǎng)基上。在以約50μE/m2s的16/8小時(shí)明/暗光周期下，于21-24℃培育2周。然后參照受試外植體的總數(shù)記錄損傷外植體數(shù)(圖2)。在受試的兩種孔雀草基因型中，以1mg/l PPT起始的濃度導(dǎo)致所有外植體的完全毀壞，這就是為什么該濃度用于共培養(yǎng)后選擇的原因。
實(shí)施例3萬壽菊的轉(zhuǎn)化萬壽菊TAG76(Genbank，IPK，Gatersleben)的體外籽苗外植體用作初級目標(biāo)材料。將種子于70％乙醇中放置5分鐘以表面滅菌，接下來用無菌蒸餾水充分洗滌。此后，濾紙上干燥種子，置于固體MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15，473-497)并在以約50μE/m2s的16/8小時(shí)明/暗光周期下，于21-24℃培育3至12周。收獲在此期間形成的所有葉(除了子葉外)并橫切至中央脈絡(luò)。這樣獲得的大小約為10至60mm2的葉外植體在制備過程中于室溫下液體MS培養(yǎng)基中放置不超過2小時(shí)。
通過接種單個(gè)菌落，將根癌土壤桿菌培養(yǎng)物EHA105[pPTGI]于含25mg/l卡那霉素的YEB(0.1％酵母提取物、0.5％牛肉膏、0.5％蛋白胨、0.5％蔗糖、0.5％硫酸鎂×7H2O)中28℃過夜培養(yǎng)16至20小時(shí)。接下來于6000g離心10分鐘收獲細(xì)菌懸液，并重懸于液體MS培養(yǎng)基中至得到的OD約為0.3至0.8。
在共培養(yǎng)前，用細(xì)菌懸液替換貯存有葉的MS培養(yǎng)基。將在農(nóng)桿菌懸液中的小葉于室溫下輕輕振搖培養(yǎng)30分鐘。接下來將感染的外植體置于含2％蔗糖、3mg/l芐基氨基嘌呤(BAP)和1mg/l吲哚乙酸(IAA)且用0.8％Plant Agar(Duchefa，NL)固化的MS培養(yǎng)基上。生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用對應(yīng)于由Kothari和Chandra開發(fā)的組合(Hort-Science19(1984)，703-705)。葉在培養(yǎng)基上的方向不重要。在與萬壽菊屬種子發(fā)芽所述的同樣條件下培養(yǎng)外植體6天。接下來將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移至具同樣生長調(diào)節(jié)劑的新鮮MS培養(yǎng)基，該第二種培養(yǎng)基額外地含有250mg/lβ-bactyl和1mg/l PPT。
每隔14天將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，直至發(fā)育出枝條芽和小枝條，并且接下來將它們轉(zhuǎn)移至同樣的含β-bactyl和PPT但生長調(diào)節(jié)劑的組合改變?yōu)?.5mg/l IBA和0.5mg/l GA3的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以生根。將生根枝條轉(zhuǎn)移至溫室。
實(shí)施例4孔雀草的轉(zhuǎn)化體外建立的孔雀草TAG80植物(Genbank，IPK，Gatersleben)用作轉(zhuǎn)化的目標(biāo)材料。用含生長調(diào)節(jié)劑IBA(0.5mg/l)和GA3(0.5mg/l)的固體MS培養(yǎng)基通過常規(guī)的芽尖培養(yǎng)獲得或繁殖它們。這些植物的葉與根癌土壤桿菌菌株EHA105[pPTGI-DOGR1]共培養(yǎng)4、6和8天。實(shí)驗(yàn)的建立及所用的再生條件類似于實(shí)施例3中所述。侯選轉(zhuǎn)基因枝條的再生在存在1mg/l PPT時(shí)生根。
實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因性的試驗(yàn)A.葡糖醛酸酶的檢測通過將它們真空浸潤于GUS底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(X-GlcA)在100mM磷酸鈉緩沖液pH7.0中1分鐘，對體外再生植物的葉和根部分進(jìn)行定性葡糖醛酸酶(GUS)酶檢測，其中所述磷酸鈉緩沖液含有10mM EDTA、0.1％ Triton X100和10mM DTT，接下來于37℃培育它們約15小時(shí)。然后將外植體室溫下用70％乙醇脫色。葉和根顯示出強(qiáng)烈的藍(lán)色，其證實(shí)了報(bào)告基因在萬壽菊屬中被表達(dá)。
B.基因組PCR分析用下列方法自欲檢測的侯選轉(zhuǎn)基因植物及三種未轉(zhuǎn)化的野生型植物分離基因組DNA于反應(yīng)器的液氮中冷凍約100mg葉材料，然后用勻漿器破碎。用900μl提取緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.0、500mM NaCl、50mMNa2EDTA、10mM巰基乙醇)提取該材料。加入100μl 20％SDS溶液后，混合該材料并于65℃培育10分鐘。加入200μl5M醋酸鉀溶液后，在冰浴中于4℃培育20分鐘。于12000g離心15分鐘以去除在此期間形成的沉淀，對在上清中的DNA通過加入800μl冰冷的異丙醇于-20℃沉淀30分鐘。離心樣本以收集DNA，然后用70％冰冷的乙醇洗滌，空氣中干燥，并重懸于25μl含0.2mg/ml RNase A的10mM Tris-HCl，pH8.0、1mM EDTA(TE)中。如此分離的3μlDNA用于PCR反應(yīng)。
DOGR1基因包含741bp，用兩條引物DOGR1-1和DOGR1-2擴(kuò)增它。DOGR1-1同源于DOGR1基因的第1至26位核苷酸且含有10個(gè)額外的核苷酸，其中包含限制性識別位點(diǎn)BamH I和Nco I(5’-ATGGATCCCCATGGCAGAATTTTCAGCTGATCTATG-3’)。DOGR1-2同源于DOGR1基因的第720至741位核苷酸且含有11個(gè)額外的核苷酸，其中包含限制性識別位點(diǎn)Sal I(5’-ATGTCGACTACTCAGGCCCTTGTCAAAGGGTTG-3’)。按廠商Takara(日本)的說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。采用下列溫育步驟1. 94℃-4分鐘2. 94℃-15秒3. 58℃-30秒4. 72℃-1分鐘步驟2-4重復(fù)4次5. 94℃-15秒6. 56℃-30秒7. 72℃-1分鐘步驟5-7重復(fù)4次8. 94℃-15秒9. 52℃-30秒10.72℃-1分鐘步驟8-10重復(fù)24次11. 72℃-10分鐘12. 4℃反應(yīng)結(jié)束PCR反應(yīng)后，用5μl終止溶液(10mM Tris-HCl，pH8.0、50％甘油、0.05％SDS、0.2％二甲苯腈藍(lán))處理5μl各個(gè)樣本并用1％瓊脂糖凝膠分離。100V電泳分離30分鐘，UV光下對凝膠進(jìn)行評估。表1為侯選孔雀草轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)基因性的分析結(jié)果。所有這些植物于1mg/lPPT存在時(shí)再生。只有那些在除草劑存在時(shí)能反復(fù)形成根的植物用于PCR分析。在所有這些植物中檢測DOGR1基因。令人吃驚的是只在極少的植物中可檢測到葉GUS活性。
表1用雙質(zhì)粒pPTGI-DOGR1轉(zhuǎn)化的侯選轉(zhuǎn)基因孔雀草植物的分析(見實(shí)施例4)
符號索引a)-存在1mg/lPPT時(shí)，該植物的枝條不能形成根，只顯示弱生長并死亡。
(+)枝條只顯示差的根形成能力。植物生長差。
+枝條顯示提高的根形成。植物生長正常。
++枝條在短期內(nèi)形成旺盛的根系統(tǒng)。存在1mg/lPPT時(shí)對植物的生長無負(fù)面影響。
b)-未檢測到GUS活性(+)在葉表面可觀察到小藍(lán)點(diǎn)形式的弱GUS活性。
c)n.d.未測定+PCR反應(yīng)和接下來的凝膠電泳分離后，可檢測到一條明顯的約750bp的條帶。該條帶在以萬壽菊屬野生型植物的基因組DNA為對照的反應(yīng)中未檢測到。
實(shí)施例6子代分析使用轉(zhuǎn)基因萬壽菊TAG76植物No.2進(jìn)行子代分析，。該植物的產(chǎn)生如實(shí)施例3所述。
該植物種子和未處理的野生型植物種子播種于植物平皿(約30×60cm)并于溫室條件下在約25℃培養(yǎng)。12天后，幼苗形成約3至4葉且高度為約5至10cm。然后對它們以1天為間隔噴灑1∶1000稀釋的除草劑Basta溶液三次。最后一次噴灑除草劑后四天，評估實(shí)驗(yàn)。所有噴灑過的83株野生型幼苗顯示出大規(guī)模損害或已經(jīng)死亡。在轉(zhuǎn)基因植物No.2的幼苗后代中，噴灑過的190株植物中的134株未顯示損害，56株損害或死亡。分離比率為約2.5抗性植物∶1敏感植物，這暗示了為孟德爾遺傳，其理想情況下為3∶1。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬能育植物的方法，其包含以下步驟(a)培養(yǎng)欲轉(zhuǎn)化之起始植物，并獲得合適的外植體，(b)將DNA序列轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞，(c)篩選已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以及(d)再生能育轉(zhuǎn)基因植物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中DNA序列借助于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移入欲轉(zhuǎn)化植物或其外植體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中葉被用作外植體。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)進(jìn)行2-8天。
5.如權(quán)利要求2至4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所用的農(nóng)桿菌種類為根癌土壤桿菌。
6.如權(quán)利要求2至5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中在共培養(yǎng)期間使用含生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中使用除草劑抗性、抗生素抗性或抗代謝抗性篩選已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或使用陽性篩選方法。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中膦絲菌素(PPT)用于篩選。
9.如權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中生長調(diào)節(jié)劑的兩種不同組合用于再生完整的萬壽菊屬轉(zhuǎn)基因植物，芐基氨基嘌呤和吲哚乙酸用于一期，且吲哚丁酸和赤霉酸GA3用于二期。
10.如權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的方法，其中萬壽菊種或孔雀草種被轉(zhuǎn)化。
11.轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬植物，其通過權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述方法而產(chǎn)生。
12.轉(zhuǎn)化的萬壽菊屬植物種子，其由權(quán)利要求11所述的植物獲得。
全文摘要
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因萬壽菊屬植物的方法，它主要包括根癌土壤桿菌介導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)化、選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞并將它們再生為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。轉(zhuǎn)化細(xì)胞和再生轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)外源基因。
文檔編號C12N15/82GK1413255SQ00817646
公開日2003年4月23日 申請日期2000年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月21日
發(fā)明者I·孔策, K·赫伯斯, U·海姆 申請人:太陽基因兩合公司