專利名稱：小鼠膽固醇酯合成酶－2基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和DNA重組技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及小鼠膽固醇酯合成酶-2的啟動(dòng)子，以及它們的用途。
背景技術(shù)：
小鼠膽固醇酯合成酶-2基因啟動(dòng)子即小鼠?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶-2啟動(dòng)子(以下簡稱小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子)，它調(diào)控小鼠膽固醇酯合成酶-2基因的表達(dá)。
膽固醇既是生物膜的重要成分，也是合成膽汁酸、甾體激素和脂蛋白的前體，最近發(fā)現(xiàn)它還參與了信號傳導(dǎo)過程，因此是哺乳動(dòng)物生命過程中不可缺少的。但是動(dòng)物體內(nèi)膽固醇過高或過低都將影響其正常的生命過程，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重病變。過高會誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化或膽結(jié)石；過低，則引起大腦神經(jīng)發(fā)育不全，產(chǎn)生癡呆癥，近期的研究還表明高膽固醇是阿爾海默氏疾病的危險(xiǎn)因素。膽固醇分子極其疏水，體內(nèi)不能利用其作為碳源和能源，因此，生物體內(nèi)膽固醇及其酯類必須處于嚴(yán)格的平衡之中。
?；o酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)(EC2.3.1.26)是細(xì)胞中以脂肪酸和膽固醇為底物催化形成膽固醇酯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白。ACAT通過將膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减?，避免了過高的游離膽固醇對細(xì)胞的毒性。
早在上世紀(jì)50年代人們就提出ACAT酶的存在并認(rèn)識到其重要性，但直到1993年，才由美國Dartmouth醫(yī)學(xué)院的TY Chang教授實(shí)驗(yàn)室首先克隆了人ACAT-1的cDNA。在此基礎(chǔ)上，其它物種的ACAT-1 cDNA相繼被克隆。1998年三家實(shí)驗(yàn)室分別克隆到了不同種屬的ACAT-2 cDNA，它們是人(Oelkers P，Behari A，CromleyD et al.1998，J.Biol.Chem.，27326765-26771)、猿(Anderson RA，JoyceC，Davis M，Reagan JW et al.1998，J.Biol.Chem.，27326747-26754.)和小鼠(Cases S，Novak S，Zheng Y et al.1998，J.Biol.Chem.，27326755-26764)。
迄今為止，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了兩種形式的ACAT。ACAT-1廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，主要參與體內(nèi)的膽固醇代謝平衡；ACAT-2則主要在肝腸細(xì)胞中表達(dá)，參與外源膽固醇的吸收和脂蛋白的裝配。
小鼠ACAT-2基因定位在第十五號染色體上，和人ACAT-2基因定位在第十二號染色體上的位置相同。該區(qū)域上集中了一些和感應(yīng)低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白高脂肪、高膽固醇攝入有關(guān)的基因。小鼠的ACAT-2 cDNA編碼525個(gè)氨基酸，有一些高度疏水序列，預(yù)示著ACAT-2有多個(gè)跨膜區(qū)。
近來，小鼠的ACAT-2基因敲除成功(ACAT-2-/-)。ACAT-2-/-小鼠在肝臟及小腸中完全喪失了ACAT活性。這進(jìn)一步從基因組水平證實(shí)了ACAT-2在小鼠膽固醇吸收中的重要作用。
隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病和神經(jīng)蛻變性疾病越來越成為威脅人們生命健康的重要?dú)⑹?，大量流行病學(xué)和分子水平的研究已證明這些疾病與生物體內(nèi)膽固醇水平密切相關(guān)。最新文獻(xiàn)認(rèn)為，肝腸細(xì)胞特異表達(dá)的acat-2參與外源膽固醇的吸收和脂蛋白的裝配，直接影響血液中膽固醇水平，而以acat-2為作用靶蛋白的藥物，會在控制人體膽固醇水平的同時(shí)又不破壞細(xì)胞內(nèi)的膽固醇平衡，所以對acat-2的研究越來越受到人們的重視。
自從知道人體內(nèi)存在兩種形式的ACAT后，藥用ACAT抑制劑的研究發(fā)展很快。篩選ACAT的特異的抑制劑成為一些制藥公司競相研究的熱點(diǎn)。目前通過建立的幾種體外、體內(nèi)測活方法篩選到大量ACAT的抑制劑，這些抑制劑作用機(jī)理是1、增加細(xì)胞內(nèi)的膽固醇外流，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中ACAT可利用的膽固醇剝脫；2、有些抑制劑是膽固醇或單鏈不飽和脂肪酸的類似物，可競爭抑制ACAT與其天然底物的結(jié)合；3、直接抑制動(dòng)脈壁中ACAT的活性。但目前大部分的抑制劑還屬于非特異性的(Cases S，Novak S，Zheng Y et al.1998，J.Biol.Chem.，27326755-26764)。而且，由于天然形式的ACAT蛋白還沒有純化成功，因此尋找ACAT特異有效的抑制劑還很困難?，F(xiàn)在，雖然有不少關(guān)于人ACAT抑制劑方面的研究，但小鼠ACAT-1敲除實(shí)驗(yàn)研究表明，僅僅選擇性地抑制ACAT-1，會形成高脂血癥。抑制ACAT-2是否會對治療高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化有利，目前仍不得而知。由于acat-2只在膽固醇代謝的中樞器官-肝臟和小腸中特異表達(dá)，因此用小鼠做模型，研究開發(fā)針對acat-2的藥物，將在控制生物體內(nèi)膽固醇水平的同時(shí)，使其具有最小的毒副作用；對acat-2表達(dá)調(diào)控的多個(gè)方面進(jìn)行分子水平的研究探索具有重要意義。
啟動(dòng)子在基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，然而，在本申請之前，還沒有獲得小鼠膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子以及有關(guān)的調(diào)控序列。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)小鼠的膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子序列以及有關(guān)的調(diào)控序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的小鼠膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子序列以及有關(guān)的調(diào)控序列。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些調(diào)控序列的方法以及所述調(diào)控序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種啟動(dòng)子，它包含小鼠膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子的核苷酸序列。
在一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子包含選自下組的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1中47-1137位所示的核苷酸序列(對應(yīng)于圖1中的-1080至-1)；或(b)SEQID NO1中98-558位所示的核苷酸序列(對應(yīng)于圖1中的-1030bp至-569)。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明上述的啟動(dòng)子。
在一優(yōu)選例中，所述的載體還含有所述的啟動(dòng)子可操作地連接的外源基因。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的載體。較佳地，所述的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更佳地，所述的宿主細(xì)胞是小鼠、大鼠和人的細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明所述的啟動(dòng)子的用途，它被用于篩選治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種篩選治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物的方法，包括步驟(a)在適合生長的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有一表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明所述的啟動(dòng)子和與該啟動(dòng)子可操作性相連的報(bào)告基因，其中在第一組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加候選物質(zhì)，在第二組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中不添加候選物質(zhì)；(b)測定第一組和第二組宿主細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)量，其中第一組宿主細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)量高于第二組就表示該候選物質(zhì)是治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了小鼠膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子的序列。
圖2顯示了5’-RACE鑒定小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的電泳圖和相關(guān)序列。其中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)用“*”標(biāo)出。
圖3顯示了對小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子最大轉(zhuǎn)錄活性區(qū)段的確定。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次分離克隆得到ACAT-2基因的啟動(dòng)子序列，并對其進(jìn)行了分析，確定該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，分別構(gòu)建不同長度的小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，用以分析小鼠acat-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性和主要轉(zhuǎn)錄活性所在的區(qū)段，同時(shí)找出起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子”、“ACAT-2基因啟動(dòng)子”、“acat-2啟動(dòng)子””可互換使用，指具有acat-2啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO1)或其啟動(dòng)活性片段的多聚核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述啟動(dòng)子的多核苷酸變異體。這些多核苷酸變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實(shí)質(zhì)上改變該啟動(dòng)子的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含50個(gè)核苷酸，較好是至少100個(gè)核苷酸，更好是至少150個(gè)核苷酸，最好是至少200個(gè)核苷酸以上至膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子的全長。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或克隆本發(fā)明的啟動(dòng)子的核苷酸序列。
本發(fā)明的人acat-2啟動(dòng)子的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物，并用小鼠基因組DNA或含小鼠染色體的人工染色體克隆作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到本發(fā)明啟動(dòng)子(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的啟動(dòng)子。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)建物或載體，以及用所述構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生外源蛋白的方法。
適用于本發(fā)明的外源基因沒有特別限制，幾乎所有的外源基因都可用于本發(fā)明。代表性的外源基因的例子包括(但并不限于)各種報(bào)告基因，如GFP、熒光素酶報(bào)告基因，和各種功能基因等。應(yīng)注意，外源基因還包括來自宿主本身的基因。例如，對于某些遺傳病(例如因某蛋白表達(dá)不足或不表達(dá)所導(dǎo)致的疾病)，可以從病人本身分離得到有關(guān)基因，然后將其與本發(fā)明的膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子元件相連，形成含外源基因的構(gòu)建物，然后將所述構(gòu)建物用于基因治療。
一種構(gòu)建物的例子就是與膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子相連的外源基因。至于膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子與外源基因的位置關(guān)系，啟動(dòng)子應(yīng)位于外源基因的上游本發(fā)明中，含acat-2啟動(dòng)子元件的核苷酸序列可優(yōu)選地插入到載體，例如表達(dá)載體中。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細(xì)菌)、真核(如酵母)、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達(dá)載體中，除了含有復(fù)制起點(diǎn)、膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子之外，還可含有標(biāo)記基因和其他翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地與待表達(dá)的外源基因相連接，以指導(dǎo)所述外源基因mRNA合成。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)外源蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如小鼠，大鼠和人的細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。一些采用的轉(zhuǎn)化方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達(dá)外源基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長和表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過PCR擴(kuò)增得到了小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子序列，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ACAT-2基因和小鼠胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP-6)基因頭尾相連，二者之間的距離約1.1Kb，進(jìn)而對小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的序列分析結(jié)果顯示，這段序列中雖然沒有典型的TATA Box和CCAAT Box，但卻有許多對各種組織特異的潛在的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括一個(gè)HNF-1α，兩個(gè)Cdx-2，兩個(gè)GATA-1；一個(gè)反向的P300；一個(gè)C/EBP；一個(gè)DeltaE等，說明這段序列是典型的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)。
本發(fā)明還應(yīng)用5’-RACE(Rapid amplication of the 5’-cDNA end)的方法，鑒定了小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為腺嘌呤A。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明分別將不同長度的小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)，分析了小鼠acat-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性和主要轉(zhuǎn)錄活性所在的區(qū)段，同時(shí)找到了起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。
本發(fā)明的膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子具有廣闊的應(yīng)用前景。ACAT-2啟動(dòng)子無論對基礎(chǔ)理論研究還是對膽固醇相關(guān)疾病(包括動(dòng)脈粥樣硬化癥、阿爾海默氏疾病)的診斷、治療及藥物篩選都具有重要意義；尤其在利用小鼠做為藥物篩選模型方面具有很大的適用價(jià)值。例如，通過作用于該啟動(dòng)子，在特定時(shí)期、特定組織里能改變acat-2的表達(dá)水平，為治療膽固醇相關(guān)疾病(如動(dòng)脈粥樣硬化癥和阿爾海默氏疾病等)提供一條可能的途徑。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的克隆、鑒定為獲得小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子，參照Mouse GenomeWalkerTMKits(購自CLONTECH公司)，設(shè)計(jì)并合成兩條小鼠ACAT-2基因特異的引物GSP1和GSP2，引物序列如下GSP15’-CCCTTCTCTCCTCCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO2)GSP25’-TGCATGGTGCCAGTGTAGAGC-3’(SEQ ID NO3)用GSP1和Kit中提供的接頭引物(Adaport primer)AP1，以MouseGenome WalkerLibraaries(購自CLONTECH公司)為模板，進(jìn)行首輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。巢式PCR的引物為GSP2和AP2，循環(huán)參數(shù)參閱產(chǎn)品說明書，得到的PCR產(chǎn)物即為小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子，其長度約為1.1Kb。將該產(chǎn)物克隆到T-EasyVector(購自Promega)，測序并分析該序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
測得的ACAT-2啟動(dòng)子的序列如圖1和SEQ ID NO1所示。
實(shí)施例2小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的確定為確定ACAT-2基因5’端轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，采用5’-RACE的方法，以小鼠ACAT-2cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物mA2-1和mA2-2，它們的序列如下mA2-15’-CCCTTCTCTCCTCCGAAGCTG-3’(SEQ ID NO4)mA2-25’-TGCATGGTGCCAGTGTAGAGC-3’(SEQ ID NO5)以2μg小鼠腸組織的總RNA為模板，參照BOEHRINGER公司5′/3′RACE Kit中所述的方法，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、加尾反應(yīng)和兩輪PCR反應(yīng)，得到一條約130bp的產(chǎn)物(圖2，上方)。將該產(chǎn)物克隆到T-Easy Vector(購自Promega)中，然后挑選4株陽性克隆測序分析，確定腺嘌呤A為小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(見圖2，下方)。
實(shí)施例3
小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的序列分析這段序列中雖然沒有典型的TATA Box，也沒有CCAAT Box，但詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，該段序列中集中了一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的特征序列-770～-757bp處有一個(gè)HNF-1α結(jié)合位點(diǎn)的特征序列；-664～-660處和-897～-893處各有一個(gè)Cdx-2結(jié)合位點(diǎn)；在-421～-410和-249～-236處有兩個(gè)GATA-1結(jié)合位點(diǎn)；-206～-188處有一個(gè)反向的P300結(jié)合位點(diǎn)；-721～-710處有一個(gè)C/EBP結(jié)合位點(diǎn)；-642～-614處有一個(gè)DeltaE結(jié)合位點(diǎn)，說明這段序列是典型的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)(參見圖1)。
實(shí)施例4小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建為確定小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū)段，利用高靈敏度的熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic(購自Promega公司)，分別將不同長度的小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子區(qū)段接在報(bào)告基因上游，構(gòu)建一系列重組表達(dá)質(zhì)粒。(參見圖3)實(shí)施例5細(xì)胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染和小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū)段及主要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的確定。
在本實(shí)施例中，分別將不同長度的小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子接入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic上游，用磷酸鈣方法分別轉(zhuǎn)染大鼠肝細(xì)胞(LW-13)、人肝癌母細(xì)胞瘤細(xì)胞(HepG2)和人結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)，分別測定相對熒光素酶活性。以確定小鼠acat-2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性和主要轉(zhuǎn)錄活性所在的區(qū)段，同時(shí)找出起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。
大鼠肝細(xì)胞LW-13的培養(yǎng)按Cell Res.1992，2139-152中所述的方法進(jìn)行；人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2的培養(yǎng)按Busch，S.J.，Barnhart，R.L.，Martin，G.A.，F(xiàn)lanagan，M.A.，和Jackson，R.L.，J.Biol.Chem.1990，26522474-22479所述的方法；人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的培養(yǎng)按Levy，E.，Mehran，M.，和Seidman，E.，F(xiàn)ASEB J.1995，9626-635所述的方法。DMEM培養(yǎng)基中含10％FBS(其中Caco-2為20％FBS)、10μg/ml streptomycin和10u/ml penicillin，培養(yǎng)條件皆為濕度95％，5％ CO2，37℃。
轉(zhuǎn)染前兩天將細(xì)胞接種到12孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為100,000-300,000，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞豐度達(dá)50-80％，其中Caco-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染分未分化和分化4天兩種情況。將pGL3-mD50(簡稱mD50)、pGL3-mD51(mD51)、pGL3-mD52(mD52)、pGL3-mD53(mD53)和陰性對照質(zhì)粒pGL3-Basic(Basic，不含啟動(dòng)子)以磷酸鈣方法分別轉(zhuǎn)染LW-13、HepG2和Caca-2細(xì)胞，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)研究。轉(zhuǎn)染參數(shù)為每孔2μg樣品DNA、1ug內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒pCH110和200μl轉(zhuǎn)染液，37℃轉(zhuǎn)染細(xì)胞12小時(shí)，44小時(shí)后收集細(xì)胞。
收集細(xì)胞后測定相對熒光素酶(luciferase)活力，方法參照Promega公司的產(chǎn)品說明書。根據(jù)相對熒光素酶活力判斷其上游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，而共表達(dá)的β-半乳糖苷酶活性作為內(nèi)標(biāo)，用以校正因細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境(細(xì)胞密度、細(xì)胞微分布、培養(yǎng)瓶內(nèi)壁等)不同而造成的轉(zhuǎn)染效率差異。相對熒光素酶活力的計(jì)算公式為 其中 測定時(shí)以熒光素酶基因上游不帶啟動(dòng)子的pGL3-Basic作陰性對照，同一批樣品之間的β-半乳糖苷酶基因轉(zhuǎn)染效率(β-半乳糖苷酶活力O.D.420/對應(yīng)的蛋白量)的波動(dòng)應(yīng)小于15％，每一實(shí)驗(yàn)作三份平行樣品。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明在大鼠肝細(xì)胞LW-13、人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2中，小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū)段都在-1030bp～-569bp之間。當(dāng)插入片段的5’端從-1030bp處縮短至-868bp時(shí)，其轉(zhuǎn)錄活性略有下降；當(dāng)插入片段的5’端從-1030bp處縮短至-569bp時(shí)，其轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。這些結(jié)果說明，-1030bp～-569bp，即SEQ ID NO1中98-558位是小鼠ACAT-2基因啟動(dòng)子的主要轉(zhuǎn)錄活性區(qū)段，同時(shí)說明，在該啟動(dòng)子中，一個(gè)HNF-1α和兩個(gè)Cdx-2是主要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所<120>小鼠膽固醇酯合成酶-2基因啟動(dòng)子<130>024546<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1199<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<400>1tacacagcta gttagaaaga ttgctgttgg cttgtgtact aataaaacag tattgggggg60gtgtctctgg cttacgtctc tgcgtctgtc tcattcagat ctggggcctc gtgctcactg 120tctcccattg gtcatagtgt ttctaccttc cctgcagagc acagccagcc tcttccattg 180cccttggaat acagtagact gccactgcca caggcagcaa gccctttctt tatcctcacc 240cggataccca cccggagctc ccttgtggga ctgactgaga tcctggtctc agtccgagat 300cacagtgatt acaatcttgc ttctatcact gacctctgga ctgatggagg aggaggatta 360atagttaatc cccagcagga atttgccaaa gtggaactcc caaggcactc acctgcccta 420ctgcctacca gaaagaaaca aatgtgctca ggctctgtat ggtttatcca gactacctcc 480agactacctt atttgtgctg gcaatcacct gatgacgtag ggacattttg tcccataatt 540tttttttttt tcagaagaag cttaaaaagt ttggtccact ttcctgaagt tacataggta 600ggcaaggcaa cccctggcgc tatttactgt tgaataagtg tgtgtctgcc ctttctgctt 660atgtggtaac ccaaggtgta gggaagagct gacactgagg ggcctcgacc atcacacatg 720acacaaatag agctcctgac aaaaatattg ttgcacacac atgtcactac aggcctcatc 780ctgtgccctc agaaaaatga ctacaaggta cacgaagatg tttctggtcc ctccctgacc 840ttcagtcttg gtagagagag ccaggaagag ccaagctatg tgataagcct cggggaagca 900aagtccccct cacaacctga tgcacagact cactcccgaa agtgaaatag caatagcgtg 960aagctgatca tagtggttgt ggtgagagag ctgtgaaagc cgcaggcagg gccagagtat 1020
gagagacact gcctgcagat aacctatcta accctcaacg gggctccgga aaggacttta 1080gtccctggag ttgtcagatc tctgagtggg acacaagctc tgtaggtaga ttgagaaaga 1140aagaaaggaa gaagacagac aacagctgtg tgctgtccgc tctacactgg caccatgca 1199<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2cccttctctc ctccgaagct g 21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3tgcatggtgc cagtgtagag c 21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4cccttctctc ctccgaagct g 21<210>5
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5tgcatggtgc cagtgtagag c 2權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，其特征在于，它包含小鼠膽固醇酯合成酶-2啟動(dòng)子的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子，其特征在于，它包含選自下組的核苷酸序列(a)SEQ ID NO1中47-1137位所示的核苷酸序列，或(b)SEQ ID NO1中98-558位所示的核苷酸序列。
3.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，它還含有所述的啟動(dòng)子可操作地連接的外源基因。
5.如權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述的外源基因是報(bào)告基因。
6.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是小鼠、大鼠和人的細(xì)胞。
9.一種權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子的用途，其特征在于，用于篩選治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物。
10.一種篩選治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物的方法，其特征在于，包括步驟(a)在適合生長的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有一表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子和與該啟動(dòng)子可操作性相連的報(bào)告基因，其中在第一組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加候選物質(zhì)，在第二組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中不添加候選物質(zhì)；(b)測定第一組和第二組宿主細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)量，其中第一組宿主細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)量高于第二組就表示該候選物質(zhì)是治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了小鼠膽固醇酯合成酶－2啟動(dòng)子序列及其主要的順式作用元件，含所述序列的構(gòu)建物和載體，以及它們的用途。本發(fā)明的膽固醇酯合成酶－2啟動(dòng)子可用于研究篩選治療或輔助治療動(dòng)脈粥樣硬化癥的藥物并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白。
文檔編號C12N15/54GK1502695SQ0215073
公開日2004年6月9日 申請日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日
發(fā)明者李伯良, 宋保亮, 王燦華, 楊新穎, 姚曉敏 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所, 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化