專利名稱：造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)，主要涉及一種造血干/祖細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)的生物技術(shù)方法，尤其是涉及造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，能有效地提高造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增倍數(shù)。
目前上述兩類技術(shù)方法一般采用的是一次性擴(kuò)增法，造血干/祖細(xì)胞從進(jìn)入培養(yǎng)體系(種植)到擴(kuò)增結(jié)束(收獲)，是一次性的。這種擴(kuò)增方法雖然操作比較簡單些，但往往限制了擴(kuò)增時(shí)間，目前一般只能持續(xù)擴(kuò)增10天左右，否則會(huì)造成擴(kuò)增體系中的細(xì)胞因子耗竭或細(xì)胞因子活性降低而不利于繼續(xù)提高造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)和功能的激活。最近國外有在擴(kuò)增中采取分階段擴(kuò)增、但未有同時(shí)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的報(bào)道。
本發(fā)明解決造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增效率問題的技術(shù)方案是采用已建系的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(CD45-CD34-SH2+SH4+CD90+)為培養(yǎng)體系的滋養(yǎng)細(xì)胞，與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)合分階段擴(kuò)增的方法，構(gòu)成了一個(gè)培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)的完整體系。
本發(fā)明提出的體外擴(kuò)增程序是以造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增態(tài)勢(前6天內(nèi)不擴(kuò)增甚至數(shù)量下降，是對體外培養(yǎng)體系的適應(yīng)期；6天后造血干/祖細(xì)胞開始擴(kuò)增，是擴(kuò)增期)為依據(jù)，為達(dá)到模擬體內(nèi)造血干/祖細(xì)胞生長發(fā)育環(huán)境，并在適當(dāng)延長體外擴(kuò)增時(shí)間內(nèi)能依然保持?jǐn)U增支持體系活性的目的，把體外擴(kuò)增程序分二個(gè)階段進(jìn)行，第一階段是先在小容量培養(yǎng)條件下進(jìn)行，加快造血干/祖細(xì)胞對條件的適應(yīng)，第二階段是轉(zhuǎn)移至大容量培養(yǎng)條件下進(jìn)行，加快造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化速率。由此適當(dāng)延長體外有效擴(kuò)增時(shí)間，進(jìn)一步提高造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。
本發(fā)明提供的造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增程序，每個(gè)階段培養(yǎng)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞6-7天，至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)袋中鋪層。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)的具體步驟為(1)用培養(yǎng)液在小容量和大容量的培養(yǎng)袋中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞約6-7天，直至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)袋中鋪層。
(2)去除培養(yǎng)袋中的培養(yǎng)液，再加入相應(yīng)體積的造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液備用，該培養(yǎng)液可以是ADM培養(yǎng)液(Modified Ex-Vivo Expansion Medium)。造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中加有三種細(xì)胞生長因子SCF、G-CSF和MGDF，每種細(xì)胞因子濃度為100 ng/mL。
(3)從不同來源(臍帶血或骨髓)分離單個(gè)核細(xì)胞或純化CD34+細(xì)胞，首先種植到上述含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞層的小容量培養(yǎng)袋中，用小體積ADM培養(yǎng)液在5％CO2和37℃下培養(yǎng)6-7天。然后收獲培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到上述含有人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞層的大容量培養(yǎng)袋中，用大體積ADM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6-7天。
本發(fā)明技術(shù)的有益效果是分階段擴(kuò)增和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)相結(jié)合的技術(shù)適當(dāng)延長了造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增時(shí)間，并保證了延長的擴(kuò)增期內(nèi)擴(kuò)增支持體系的活性，有效地提高了造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增倍數(shù)。臍帶血造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增中，CD34+細(xì)胞培養(yǎng)的有核細(xì)胞擴(kuò)增了674倍(比報(bào)道單用骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的高5.7倍，比單用分階段培養(yǎng)的高1.5倍)，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增了39.7倍(比報(bào)道單用骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的高3.6倍，比單用分階段培養(yǎng)的高1.4倍)，粒-巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞(GM-CFC)和高增殖潛能祖細(xì)胞集落形成細(xì)胞HPP-CFC分別擴(kuò)增了92倍和71倍(比單用分階段培養(yǎng)的分別高1.4倍和1.5倍)。新擴(kuò)增技術(shù)具有明顯的擴(kuò)增優(yōu)勢。
圖2為兩種培養(yǎng)體系中粒-巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞(GM-CFC)和高增殖潛能祖細(xì)胞集落形成細(xì)胞(HPP-CFC)的擴(kuò)增。
圖3為體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)下的造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增態(tài)勢。
圖4為擴(kuò)增細(xì)胞移植小鼠后各種細(xì)胞數(shù)量變化態(tài)勢。
圖5為造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)照片。
具體實(shí)施實(shí)例本發(fā)明結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1本發(fā)明技術(shù)采取的具體方法(1)用α-20培養(yǎng)液(AMEM/20％FBS)在小體積和大體積的Teflon培養(yǎng)袋中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞約7天，直至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)袋中鋪層。
(2)去除培養(yǎng)袋中的α-20培養(yǎng)液，再加入相應(yīng)體積的ADM培養(yǎng)液(造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液)備用。造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液中加有三種細(xì)胞生長因子SCF、G-CSF和MGDF，每種細(xì)胞因子濃度為100ng/mL。
(3)從不同來源(臍帶血或骨髓)分離單個(gè)核細(xì)胞或純化CD34+細(xì)胞，首先種植到上述含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞層的小容量培養(yǎng)袋中，用小體積ADM培養(yǎng)液在5％CO2和37℃下培養(yǎng)7天。7天后收獲培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到上述含有人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞層的大容量培養(yǎng)袋中，用大體積ADM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天。
實(shí)施例2臍帶血造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增效果1.1 有核細(xì)胞的擴(kuò)增從凍存的臍帶血分離單個(gè)核細(xì)胞，并進(jìn)一步分選出CD34+細(xì)胞，然后按本擴(kuò)增技術(shù)體系進(jìn)行體外擴(kuò)增。
在單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中，有核細(xì)胞的數(shù)量都是先開始逐步下降，然后在第6-7天開始出現(xiàn)回升趨勢，直至14天后收獲細(xì)胞。CD34+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中前期沒有單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增那樣的明顯下降現(xiàn)象，但也是在第6-7天后出現(xiàn)擴(kuò)增趨勢，結(jié)果參見

圖1，圖中—◆—為共培養(yǎng)體系，—■—為非共培養(yǎng)體系，圖1a是單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)的有核細(xì)胞擴(kuò)增趨勢(0-7天)，圖1b是單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)的有核細(xì)胞擴(kuò)增趨勢(7-14天)，圖1c是CD34+細(xì)胞培養(yǎng)的有核細(xì)胞擴(kuò)增趨勢(0-14天)。14天后單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中有核細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)是346；CD34+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中有核細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)是674(表1)。
表1 單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞培養(yǎng)中有核細(xì)胞的擴(kuò)增擴(kuò)增細(xì)胞起始細(xì)胞(×106) 擴(kuò)增細(xì)胞(×106) 擴(kuò)增倍數(shù)單個(gè)核細(xì)胞 13.9 4,804345.6CD34+細(xì)胞 0.41 276.2673.71.2 GM-CFC和HPP-CFC的擴(kuò)增單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)和CD34+細(xì)胞培養(yǎng)的粒-巨噬細(xì)胞集落形成細(xì)胞(GM-CFC)和高增殖潛能祖細(xì)胞集落形成細(xì)胞(HPP-CFC)擴(kuò)增效率見圖2，圖中A起始集落B非共培養(yǎng)擴(kuò)增集落 C共培養(yǎng)擴(kuò)增集落，圖2a為GM-CFC的擴(kuò)增，圖2b為HPP-CFC的擴(kuò)增。
單個(gè)核細(xì)胞的起始GM-CFC和HPP-CFC分別是23×104和14×104；CD34+細(xì)胞的起始GM-CFC和HPP-CFC分別是9.4×104和1.8×104。經(jīng)過14天的擴(kuò)增后，單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的GM-CFC和HPP-CFC分別是2048×104和716×104(分別擴(kuò)增了89倍和51倍)；CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的GM-CFC和HPP-CFC分別是864×104和128×104(分別擴(kuò)增了92倍和71倍)。
1.3 擴(kuò)增細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析擴(kuò)增后的細(xì)胞用相應(yīng)的單克隆抗體標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，其結(jié)果如表2。
表2 擴(kuò)增細(xì)胞膜表面抗原表型的比例(％)擴(kuò)增細(xì)胞 CD33CD15CD14CD34CD34擴(kuò)增倍數(shù)單個(gè)核細(xì)胞81 67 36 0.7790.2CD34+細(xì)胞 89 77 40 5.9 39.7擴(kuò)增后的細(xì)胞中，大部分是CD33+和CD15+細(xì)胞。但是其所占的比率有所不同在單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞中CD33+和CD15+細(xì)胞分別為81％和67％，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞中CD33+和CD15+細(xì)胞分別為89％和77％。
其次占比較大比例的是CD14+細(xì)胞，在單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的CD14+細(xì)胞分別為36％和40％。
擴(kuò)增后CD34+細(xì)胞的比例都已大幅度減少，單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞分別為0.77％和5.9％。雖然擴(kuò)增后CD34+細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例下降了，但根據(jù)擴(kuò)增細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞比例，計(jì)算CD34+細(xì)胞的總量，也表現(xiàn)出擴(kuò)增趨勢單個(gè)核細(xì)胞和CD34+細(xì)胞擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞分別擴(kuò)增了90.2倍和39.7倍。
實(shí)施例3體外擴(kuò)增小鼠造血干/祖細(xì)胞及重建小鼠造血功能采集小鼠骨髓并分離單個(gè)核細(xì)胞，并分選CD34+/c-kit+細(xì)胞。采用本擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行小鼠造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增小鼠移植模型實(shí)驗(yàn)。
2.1 有核細(xì)胞的擴(kuò)增在單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中，有核細(xì)胞的數(shù)量也是先開始逐步下降，到第4天開始出現(xiàn)回升，直至14天后收獲細(xì)胞。CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中雖然沒有明顯下降的現(xiàn)象，但有核細(xì)胞開始增長的時(shí)間也在4天之后，結(jié)果參見圖3，其中圖3a為單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增，圖3b為CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增。
概括圖3的擴(kuò)增結(jié)果，單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中有核細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)是10.8；CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)中有核細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)是76.1。2.2 GM-CFC和HPP-CFC的擴(kuò)增分別對單個(gè)核細(xì)胞和CD34+/c-kit+細(xì)胞及其擴(kuò)增后的GM-CFC和HPP-CFC進(jìn)行了比較分析(表3)經(jīng)過14天的擴(kuò)增后，單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的GM-CFC和HPP-CFC分別擴(kuò)增了65.9倍和38.8倍；CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增的GM-CFC和HPP-CFC分別擴(kuò)增了71.7倍和51.8倍。
表3 GM-CFC和HPP-CFC的擴(kuò)增

2.3 擴(kuò)增細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析單個(gè)核細(xì)胞和CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增后的細(xì)胞用相應(yīng)的單克隆抗體標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，其中單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞分析結(jié)果見表4。
表4 擴(kuò)增后細(xì)胞類群的比例

擴(kuò)增后的大部分細(xì)胞是CD15+和細(xì)胞CD14+。但是其所占的比率有所不同單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞中CD15+和CD14+細(xì)胞分別為49％和13％，CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞中CD15+和CD14+細(xì)胞分別為41％和17％。
擴(kuò)增后CD34+細(xì)胞的比例都已減少，單個(gè)核細(xì)胞和CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增的細(xì)胞中CD34+細(xì)胞分別為0.41％和3.8％。但根據(jù)擴(kuò)增細(xì)胞中的CD34+細(xì)胞比例，計(jì)算CD34+細(xì)胞的總量，則表現(xiàn)出擴(kuò)增趨勢單個(gè)核細(xì)胞和CD34+/c-kit+細(xì)胞擴(kuò)增的CD34+細(xì)胞分別擴(kuò)增了4.8倍和2.9倍。
2.4 擴(kuò)增細(xì)胞移植后對亞致死劑量照射小鼠的快速植入和長期造血60Coγ射線致死劑量照射后，未移植擴(kuò)增細(xì)胞的對照組小鼠在第18-20天死亡率達(dá)到100％，而移植擴(kuò)增細(xì)胞的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠在相同時(shí)期的平均死亡率分別為16.7％(單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞)和20％(CD34+/c-kit+細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞)。血液分析系統(tǒng)的檢測結(jié)果見圖4，其中—◆—單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組，—■—CD34+/c-kit+細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組，—▲—對照組。未移植擴(kuò)增細(xì)胞的對照組小鼠的各種血細(xì)胞數(shù)量在照射后的3-6天內(nèi)快速下降，然后下降速度趣緩，直至死亡。
移植了擴(kuò)增細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組小鼠中，雖然在照射后的3-6天內(nèi)各種細(xì)胞的數(shù)量也出現(xiàn)大幅度下降，但之后開始出現(xiàn)回升趨勢單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組中，各種細(xì)胞數(shù)量都在移植后的第6天之后開始回升，其中血小板、白血細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量上升速度很快，并且血小板、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞在第24天恢復(fù)甚至超過了基數(shù)水平。
在CD34+/c-kit+細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組中，各種細(xì)胞數(shù)量上升的速度相對比較緩慢，但基本上在第6天之后一直處于上升趨勢，并且上升的態(tài)勢比較穩(wěn)定。
移植第8周后，對存活的小鼠進(jìn)行細(xì)胞核染色體組型分析，發(fā)現(xiàn)移植單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞和CD34+/c-kit+細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞的小鼠中，有核細(xì)胞XY染色體的檢出率分別為25.4％和32.8％。實(shí)例總結(jié)(1)本擴(kuò)增技術(shù)有效地提高了人臍帶血造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增效率CD34+細(xì)胞培養(yǎng)的有核細(xì)胞擴(kuò)增了674倍(報(bào)道的骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)擴(kuò)增119.6倍，報(bào)道的分階段培養(yǎng)擴(kuò)增438倍)，CD34+細(xì)胞擴(kuò)增了39.7倍(報(bào)道的骨髓基質(zhì)共培養(yǎng)擴(kuò)增11.1倍，報(bào)道的分階段培養(yǎng)擴(kuò)增29倍)，GM-CFC和HPP-CFC分別擴(kuò)增了92倍和71倍(報(bào)道的分階段培養(yǎng)分別擴(kuò)增65倍和49倍)，具有明顯的擴(kuò)增優(yōu)勢。
(2)本擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增的造血細(xì)胞有效地加快了小鼠短期快速恢復(fù)和長期重建造血功能擴(kuò)增細(xì)胞移植后可快速產(chǎn)生體內(nèi)嗜中性粒細(xì)胞的植入。在單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組中，各種細(xì)胞數(shù)量都在移植后的第6天之后開始回升，并在第24天前基本上恢復(fù)到了基數(shù)水平。在CD34+/c-kit+細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)組中，各種細(xì)胞數(shù)量上升的速度相對比較緩慢，但基本上在第6天之后一直處于上升趨勢。
2個(gè)月后存活小鼠的細(xì)胞核染色體組型分析表明，單個(gè)核細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞和CD34+/c-kit+細(xì)胞的擴(kuò)增細(xì)胞移植的小鼠中，有核細(xì)胞XY染色體的檢出率分別為25.4％和32.8％，表明擴(kuò)增的造血細(xì)胞在促進(jìn)體內(nèi)恢復(fù)長期重建造血功能起到了重要作用。參見圖5，其中圖5a是GM-CFC，圖5b是HPP-CFC，圖5c是在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上培養(yǎng)的人臍帶血造血干/祖細(xì)胞，圖5d是在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上培養(yǎng)的小鼠造血干/祖細(xì)胞。
本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)都被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，本發(fā)明是結(jié)合最佳實(shí)施例進(jìn)行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
本發(fā)明的參考文獻(xiàn)1、韓軍 徐激斌等，胎兒骨髓基質(zhì)細(xì)胞與外源性細(xì)胞因子的協(xié)同造血支持作用，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(5)439-4422、張毅 毛寧等，臍帶血中長期培養(yǎng)啟動(dòng)細(xì)胞在轉(zhuǎn)染FL和/或TPO基因骨髓基質(zhì)細(xì)胞層上的生長，中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2001，9(2)97-1003、楊吉成 王曉東等，骨髓基質(zhì)細(xì)胞的造血支持作用等生物學(xué)特性的研究，細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2001，17(1)41-454、蘇瑞軍 黃紹良，含人胚胎骨髓基質(zhì)細(xì)胞層體系對臍血造血干/祖細(xì)胞的擴(kuò)增效果，中華兒科雜志，1999，37(7)429-4335、吳瑞瓊 楊治華，骨髓基質(zhì)細(xì)胞對人造血CD^+34細(xì)胞體外擴(kuò)增及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，中國輸血雜志，1999，12(2)73-756、侯麗君 遠(yuǎn)藤一靖，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)上清對造血干細(xì)胞增殖作用的研究，中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，24(5)477-4797、梁輝 應(yīng)大明，長期培養(yǎng)起始細(xì)胞在不同的基質(zhì)細(xì)胞層上的培養(yǎng)，中華血液學(xué)雜志，1995，16(5)241-2438、趙柯，沈柏鈞，侯懷水等，條件培養(yǎng)液對臍血CD34+細(xì)胞擴(kuò)增效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(1)7-10.
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18、吳瑞瓊，楊治華，石遠(yuǎn)凱，董志偉，骨髓基質(zhì)細(xì)胞對人造血CD+34細(xì)胞體外擴(kuò)增及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，中國輸血雜志，1999，12(2)73-7519、秦鳳華，張忠森，謝蜀生，骨髓基質(zhì)細(xì)胞系QXMSC1體外促進(jìn)造血及其作用機(jī)理的研究，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，1997，5(4)367-37120、孫新，黃紹良，劉俊范，胎兒骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清對造血祖細(xì)胞集落生長的影響，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，1997，5(2)212-21321、侯麗君，仇琳，遠(yuǎn)藤一靖，金田京子，古山和道，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)上清對造血干細(xì)胞增殖作用的研究，中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，24(5)477-47922、侯麗君，人骨髓基質(zhì)細(xì)胞株培養(yǎng)上清對造血干細(xì)胞增殖作用的研究，沈陽醫(yī)學(xué)雜志，1994，14(3)3-423、McNiece I，Kubegov D，Kerzic P，et al.Increased expansion anddifferentiation of cord blood products using a two-step expansionculture[J].Exp.Hematology，2000，28(10)1181-1186.
權(quán)利要求
1.一種造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，采用已建系的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(CD45-CD34-SH2+SH4+CD90+)為培養(yǎng)體系的滋養(yǎng)細(xì)胞，其特征是滋養(yǎng)細(xì)胞與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)合體外分階段擴(kuò)增程序進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，其特征是體外擴(kuò)增程序分二個(gè)階段進(jìn)行，第一階段是先小容量培養(yǎng)擴(kuò)增，第二階段是將第一階段擴(kuò)增的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至大容量培養(yǎng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增。
3.如權(quán)利要求1和2所述的造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，其特征是本發(fā)明技術(shù)的具體步驟為(1)用培養(yǎng)液在小容量和大容量的Teflon培養(yǎng)袋中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞6-7天，直至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)袋中鋪層。(2)去除培養(yǎng)袋中的，再加入相應(yīng)體積的造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)液備用。(3)從不同來源分離單個(gè)核細(xì)胞或純化CD34+細(xì)胞，首先種植到上述含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞層的小容量培養(yǎng)袋中，用小體積培養(yǎng)液在5％CO2和37℃下培養(yǎng)6-7天。然后收獲培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到上述含有人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞層的大容量培養(yǎng)袋中，用大體積培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6-7天。
全文摘要
本發(fā)明提供一種造血干/祖細(xì)胞體外分階段共培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)，采用已建系的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為培養(yǎng)體系的滋養(yǎng)細(xì)胞，與造血干細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)合分階段擴(kuò)增的方法，構(gòu)成了一個(gè)培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)的完整體系。本發(fā)明采用分階段擴(kuò)增和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)相結(jié)合的技術(shù)適當(dāng)延長了造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增時(shí)間，并保證了延長的擴(kuò)增期內(nèi)擴(kuò)增支持體系的活性，有效地提高了造血干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增倍數(shù)。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK1415747SQ0215076
公開日2003年5月7日 申請日期2002年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月23日
發(fā)明者王金福 申請人:浙江大學(xué)