專利名稱：重組融合蛋白及其三聚體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠形成三聚體的重組融合蛋白，該重組融合蛋白包括至少一種組分A和至少一種組分B，組分B具有三聚化性能，而組分A具有生物性能；本發(fā)明還涉及這些重組融合蛋白的三聚體。本發(fā)明還涉及這些三聚體用于生產(chǎn)藥物的應(yīng)用及其用于體外診斷或生產(chǎn)體外診斷試劑的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼這種融合蛋白的DNA序列、表達(dá)載體和包括該DNA序列或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
大量的蛋白質(zhì)天然存在，其生理形式為三聚體形式。這些在溶液中發(fā)生三聚化的蛋白質(zhì)表面的相互作用可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，這種聚集自發(fā)發(fā)生或由于以下的事實(shí)而以延遲的方式，例如動(dòng)力學(xué)延遲的方式發(fā)生這些聚集是依賴于濃度或介質(zhì)的。這些原因作用力是疏水相互作用，氫鍵、共價(jià)鍵如二硫橋鍵和/或庫侖力。
但是此外，某些蛋白質(zhì)具有導(dǎo)致形成特定的結(jié)構(gòu)依賴性分子間超二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致形成蛋白質(zhì)三聚體和其它多聚化狀態(tài)的結(jié)構(gòu)基元。超二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成基于形成這些三聚體的蛋白質(zhì)特征氨基酸序列。例如可以提及的超二級(jí)結(jié)構(gòu)是已知的為“卷曲螺旋式三股螺旋”的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，它通過特征性α-螺旋的相互作用而發(fā)生蛋白質(zhì)的三聚化，這種現(xiàn)象在每一種形成卷曲螺旋形式的蛋白質(zhì)的情況下發(fā)現(xiàn)。作為蛋白質(zhì)的分子間“三聚化結(jié)構(gòu)域”的卷曲螺旋式三股螺旋在結(jié)構(gòu)方面是一種彼此卷曲環(huán)繞的三鏈超螺旋。這些具有三股螺旋特征的卷曲螺旋基元具體在細(xì)胞外蛋白質(zhì)三聚體中發(fā)現(xiàn)，但非常特別地在結(jié)締組織的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體中發(fā)現(xiàn)。
因此，例如Beck等人(J.Mol.Biol.(1996)256，909-923)描述一種已知為軟骨基質(zhì)蛋白(CMP)的結(jié)締組織蛋白，其聚集成為同源三聚體的基礎(chǔ)是具有卷曲螺旋模式的三股螺旋，這種螺旋導(dǎo)致三種互補(bǔ)螺旋(各自作為多肽組分)聚集。七氨基酸模式(abcdefg)n是這種形成三股螺旋的螺旋的氨基酸序列的特征。在位置a和d的七氨基酸模式的氨基酸通常已經(jīng)連接到它們的非極性側(cè)鏈，從而導(dǎo)致形成上述的超螺旋結(jié)構(gòu)，在這種情況下，三股螺旋包含三螺旋。
還在來自膠原家族的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)由于超二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致的特定的結(jié)構(gòu)依賴性多聚化現(xiàn)象。這里，膠原纖維的結(jié)構(gòu)特征是原膠原，它由三條螺旋扭曲的多肽組成。而且，頭發(fā)的原纖維由具有“卷曲螺旋”基元的α-角蛋白三股螺旋組成，雖然它是左旋形式。
此外，根據(jù)術(shù)語Clq家族，蛋白質(zhì)Clq、膠原α1(X)、α2(VII)、越冬(overwintering)蛋白質(zhì)、ACRP30，內(nèi)耳結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、小腦肽和多聚體蛋白(multimerin)歸類于蛋白質(zhì)家族，因?yàn)樗鼈兊母髯远嗑刍蛄衅尉哂行蛄型葱?Kischore和Reid，Immunopharmacol.，42(1999)15-21)，并且由于它們的結(jié)構(gòu)，這些蛋白質(zhì)是較高聚集體的形式，例如三聚體。例如，在此家族中發(fā)現(xiàn)的具有多聚化性能的蛋白質(zhì)中，已知來自補(bǔ)體系統(tǒng)的蛋白質(zhì)Clq的結(jié)構(gòu)特征是單體，這些單體的每一個(gè)具有一個(gè)已知為“頭”的球形結(jié)構(gòu)域和“膠原的(collagenaceous)”螺旋狀序列片段。這種螺旋狀序列片段形成卷曲螺旋式三股螺旋，由此發(fā)生單體的三聚化。接著，6個(gè)這些Clq三聚體形成寡聚體，接著蛋白質(zhì)三聚體的寡聚化基于單獨(dú)的卷曲螺旋式三股螺旋之間的相互作用。這種蛋白質(zhì)或多-(寡-)聚化蛋白質(zhì)復(fù)合體Clq的結(jié)構(gòu)排列是一種還稱為“花束”的構(gòu)建體，它確保18個(gè)球狀、C-末端排列的“頭”域連接得到一種三聚體的六聚體。
還在蛋白質(zhì)ACRP30，另一種來自Clq家族的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)類似于Clq蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)(Hu等人，J.Biol.Chem.，Vol.271，No.18，10697-10703，1996)。這種血清蛋白由脂肪細(xì)胞分泌，它三聚體的最可能四聚體，其中球狀C-末端結(jié)構(gòu)域通過膠原性三股螺旋連接；Clq蛋白質(zhì)的情況也是如此。據(jù)估計(jì)四個(gè)這些三股螺旋接著通過適宜的相互作用而最終形成寡聚體。Shapiro和Scherer的公開(Current Biology 1998，8335-338)表明了在X射線結(jié)構(gòu)分析的幫助下測(cè)得的ACRP30同源三聚體的結(jié)構(gòu)。
其它現(xiàn)有文獻(xiàn)中已知的蛋白質(zhì)是來自膠原凝集素類的蛋白質(zhì)，它們的特征是膠原結(jié)構(gòu)域、頸區(qū)以及球狀羧基末端凝集素結(jié)合域。同樣在生理學(xué)上發(fā)現(xiàn)這些膠原凝集素作為三聚體的寡聚體。因此，例如蛋白質(zhì)肺表面活性劑蛋白質(zhì)A(SP-A)和甘露糖結(jié)合蛋白(MBP)，各自來自膠原凝集素家族，由于它們的“膠原”結(jié)構(gòu)域的相互作用而發(fā)生三聚化作用，并最終作為三聚體的六聚體形式出現(xiàn)(Epstein等人，CurrentOpinion in Immunology，Vol.8，No.1，1996，29-35)。因此，已知名為膠原凝集素的蛋白質(zhì)還形成多聚體(例如三聚體)的寡聚體(例如六聚體)。
文獻(xiàn)還公開大量的在生理上作為信號(hào)分子的蛋白質(zhì)僅能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)處于特定狀態(tài)的生物信號(hào)。因此，例如膜結(jié)合的FasL具有生物活性，即細(xì)胞凋亡活性，但從膜結(jié)合的片段(已知為sFasL)中消去細(xì)胞外蛋白片段之后，該非膜結(jié)合的sFasL部分不再能夠在生理學(xué)上使靶細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡作用。Schneider等人的公開(J.Exp.Med.，Vol.187，No.8，1998，1205-1213)描述如何通過使用交聯(lián)抗體實(shí)現(xiàn)在從膜結(jié)合的蛋白片段消去以后得到的上述sFasL三聚體的生物作用的生理功能的再活化。為此目的，構(gòu)建并表達(dá)由FasL的三聚化結(jié)構(gòu)域、短接頭序列和flag標(biāo)記(具有flag氨基酸序列(一字母編碼)DYKDDDDK)組成的融合蛋白，通過指向?qū)筬lag標(biāo)記的抗體使這種非結(jié)構(gòu)依賴性三聚化(即不通過導(dǎo)致形成超二級(jí)結(jié)構(gòu)的特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)相互作用)融合蛋白發(fā)生交聯(lián)。
未公開的德國專利申請(qǐng)DE 19963859公開了二、三、四或五聚體的二聚體或寡聚體，即較高級(jí)的聚集體，它由包含兩組分A和B的重組融合蛋白組成。例如，為了增加TNF細(xì)胞因子的生物(細(xì)胞凋亡)活性，根據(jù)DE 19963859的重組融合蛋白的組分A可以例如是TNF細(xì)胞因子，而組分B是連接重組融合蛋白得到較高級(jí)聚集體的蛋白質(zhì)片段。
雖然這些具有潛在的細(xì)胞凋亡活性的復(fù)合體在許多醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥中是理想的，但許多疾病的治療需要提供可靠地阻斷細(xì)胞凋亡事件觸發(fā)的物質(zhì)。根據(jù)Suda等人的公開(J.Exp.Med.1997，186，pp.2045-2050)已知可溶的FasL三聚體可以在某些情況下阻斷由寡聚分子導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。物質(zhì)如基于蛋白質(zhì)的物質(zhì)能夠可靠地阻斷例如受體本身的細(xì)胞凋亡事件的觸發(fā)，它在性質(zhì)上不是天然的，因而被更好的保護(hù)以對(duì)抗體內(nèi)生理退化，但它在現(xiàn)有技術(shù)中是未知的。
因此，本發(fā)明的目的是提供這樣的物質(zhì)作為一種生物分子，它能夠用作受體本身的生物阻斷劑，從而例如抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的引發(fā)。
本發(fā)明的目的定義為權(quán)利要求1的主題，即包括至少一種組分A和至少一種組分B的重組融合蛋白的三聚體，組分A包括一種具有生物功能，特別是具有結(jié)合功能的蛋白質(zhì)或蛋白片段，而組分B包括一種將不具有第三分子活性的重組融合蛋白三聚化，即產(chǎn)生生物學(xué)活性組分A的三聚體的蛋白質(zhì)或蛋白片段。因此本發(fā)明提供這樣的三聚體它不能形成較高級(jí)聚集體，例如三聚體的二聚體；但在每種情況下以三聚體的總數(shù)計(jì)，基本上以至少90％，優(yōu)選至少95％，非常具體地優(yōu)選至少99％的數(shù)量作為三聚化重組融合蛋白存在于溶液。
具有生物功能的蛋白質(zhì)或蛋白片段(融合蛋白中的組分A)理解為具體意指具有配體功能的蛋白質(zhì)，非常具體地意指對(duì)抗體或受體，(即它能夠作為一種結(jié)合配偶體與一種或多種分子相互作用)、修飾的氨基酸序列如具有共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的活性成分(如果合適的話具有有機(jī)化學(xué)性質(zhì))的氨基酸序列、具有互補(bǔ)位的抗體或抗體片段或者激素如肽激素。在上下文中，本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)用作本發(fā)明組分A的特定的信號(hào)蛋白、其片段或衍生物僅在較高級(jí)聚集體形式時(shí)具有生物活性；相反作為三聚體，它們?cè)隗w外和體內(nèi)與受體結(jié)合，但不激活這些受體，而是競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，且不能觸發(fā)生物激活信號(hào)，而僅僅是阻斷。
在生理學(xué)膜結(jié)合信號(hào)蛋白中，例如在TNF細(xì)胞因子的情況下，包含膜外，特別是細(xì)胞外蛋白片段的裂解產(chǎn)物優(yōu)選作為三聚化重組信號(hào)蛋白的組分A。但是，可以用作抗原的氨基酸序列也可以用作重組融合蛋白中的組分A。最后，受體，如來自TNF受體家族的受體(例如FasR)或這種受體的片段或衍生物同樣具有結(jié)合功能(因而作為結(jié)合配偶體與另一種分子如膜結(jié)合FasL相互作用)，因而對(duì)于本發(fā)明的目的它也被術(shù)語“配體”所涵蓋，它也可以用作組分A。當(dāng)患者身上存在高非生理濃度的互補(bǔ)生物配體時(shí)，這些能夠結(jié)合的生物受體片段特別適于用作藥物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明的三聚體中存在的組分A可以包含相同的組分A(同源三聚體)或不同的組分A(異源三聚體)，即多種重組融合蛋白可以形成本發(fā)明的三聚體。通過這種方式，具有多種組分A，如果合適的話具有不同生物功能的蛋白質(zhì)可以在本發(fā)明的三聚體中結(jié)合在一起。這里兩種重組蛋白質(zhì)的組分A可以相同，而第三個(gè)融合蛋白可以關(guān)于其組分A不同，或者所有三個(gè)融合蛋白可以關(guān)于其組分A不同。以這種方式選擇、排列、特定組合和/或三聚體中的組分A的數(shù)目一般可以細(xì)微地調(diào)節(jié)抑制作用，如果合適的話可以完成與激活作用組合。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組融合蛋白中的組分A采用以下形式肽類激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素或這些物質(zhì)的片段，優(yōu)選能夠結(jié)合的片段。但是，上述肽、蛋白片段和/或蛋白質(zhì)的功能衍生物也可以用作是本發(fā)明三聚體成分的重組融合蛋白中的組分A。
根據(jù)本發(fā)明的三聚重組融合蛋白的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，它的組分A包含一種受體，例如肽類激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素的受體，或者本發(fā)明的融合蛋白的組分A采用這些受體的片段或衍生物的形式。這些受體的特別優(yōu)選的實(shí)例為來自TNF受體家族的受體，特別是FasR(下文簡(jiǎn)稱為Fas)。
術(shù)語生物活性蛋白質(zhì)、蛋白片段或肽的功能衍生物具體指保持生物功能，特別是與相互作用的配偶體，如膜結(jié)合的受體結(jié)合的性能，但其序列表現(xiàn)出與對(duì)應(yīng)的天然序列不同的蛋白質(zhì)。這些序列衍生物可以采用一種或多種插入、缺失和/或置換的形式，所用的衍生物和天然序列之間的序列同源性優(yōu)選為至少70％，更優(yōu)選至少85％，特別優(yōu)選至少90％。術(shù)語功能衍生物具體涵蓋具有與生理序列比較有更保守置換的氨基酸序列。術(shù)語保守置換指同類氨基酸彼此交換的置換。具體而言，存在具有脂肪族側(cè)鏈、帶正電或負(fù)電的側(cè)鏈、位于側(cè)鏈的芳基的氨基酸，或者側(cè)鏈能夠形成氫橋鍵，例如具有羥基官能的側(cè)鏈的氨基酸。這意味著例如具有極性側(cè)鏈的氨基酸被另一個(gè)具有相同極性的側(cè)鏈的氨基酸置換，或例如以疏水側(cè)鏈為特征的氨基酸被另一個(gè)具有同樣的疏水側(cè)鏈的氨基酸置換(例如絲氨酸(蘇氨酸)被蘇氨酸(絲氨酸)置換，或者亮氨酸(異亮氨酸)被異亮氨酸(亮氨酸)置換)。插入和置換具體可能存在于不發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化或涉及結(jié)合區(qū)域的序列位置。例如，可以借助CD光譜(圓二色譜)容易地檢測(cè)插入或缺失導(dǎo)致的空間結(jié)構(gòu)的變化(Urry，1985，Absorption，circular Dichroism和ORD of Polypeptides，inModern Physical Methods in Biochemistry，Neuberger等人(Ed.)，Elsevier，Amsterdam)。例如在以下出版物中公開了用于產(chǎn)生具有包含相較于天然序列的置換的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的適宜的方法US4,737,462、US 4,588,585、US 4,959,314、US 5,116,943、US 4,879,111和US 5,017,691。Sambrook等人(1989，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press)也具體描述了衍生物的產(chǎn)生，它可遺漏、補(bǔ)充或置換密碼子。其它衍生物可以具體為這樣的蛋白質(zhì)該蛋白質(zhì)被穩(wěn)定以避免生理學(xué)降解，例如通過取代酰胺類型鍵，如還可以使用β-氨基酸穩(wěn)定蛋白質(zhì)主鏈。
為本發(fā)明目的，配體理解為意指所有參與結(jié)合反應(yīng)的分子。因此，配體還可以是一般稱為受體的蛋白質(zhì)。而且這種受體可以是用于本發(fā)明目的的“配體”，例如當(dāng)它與它的相互作用的配偶體如信號(hào)分子結(jié)合時(shí)。
重組融合蛋白的三聚體具體優(yōu)選的情況是該重組融合蛋白中的組分A是來自TNF細(xì)胞因子家族的細(xì)胞因子，這種TNF細(xì)胞因子的片段，或者TNF細(xì)胞因子或?qū)?yīng)的TNF細(xì)胞因子片段的功能衍生物。通過與對(duì)應(yīng)的受體在體內(nèi)結(jié)合(例如在以較高級(jí)聚集體的形式結(jié)合的情況下)，用于靶細(xì)胞的TNF細(xì)胞因子的生物作用可以導(dǎo)致諸如細(xì)胞凋亡、增殖或激活等作用，但這些三聚體一般僅確保與所關(guān)注的受體結(jié)合而不再發(fā)揮激活功能。在一個(gè)非限制性的列舉中，適宜的TNF細(xì)胞因子和因此的適宜的融合蛋白中的組分A，具體為蛋白質(zhì)OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI和BAFF或它們的片段或衍生物。非常具體優(yōu)選蛋白質(zhì)CD40L、FasL、TRAIL、TNF(特別是與受體TNF-R2結(jié)合的TNF)、CD30L和EDA或者它們的片段或衍生物。優(yōu)選使用的重組融合蛋白中的組分A是上述膜結(jié)合的TNF細(xì)胞因子的細(xì)胞外片段或它們的功能衍生物。這些裂解產(chǎn)物在保持它們對(duì)所關(guān)注的受體的結(jié)合能力時(shí)非常特別優(yōu)選。上述TNF細(xì)胞因子或TNF細(xì)胞因子的片段的上述意義的功能衍生物還可以用作融合蛋白的組分A。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組融合蛋白的組分A是本發(fā)明三聚體的組分，它選自hFasL(AA139-281)、hTRAIL(AA9 5-281)、hCD40L(AA 116-261)和m或hTNFα(AA 77-235)。
因此，根據(jù)本發(fā)明以下可能結(jié)果已經(jīng)以在三聚體形式存在于溶液中選擇重組融合蛋白的組分A，而該重組融合蛋白將成為本發(fā)明寡聚物的組分。在這種情況下，組分B將更進(jìn)一步促進(jìn)組分A的三聚化。例如這種情況發(fā)生在已在溶液中發(fā)生典型的三聚化的組分A如TNF配體或它的片段或衍生物進(jìn)一步被組分B穩(wěn)定化為它的三聚形式的時(shí)候。相反，在重組融合蛋白的組分A本身在溶液或體內(nèi)不表現(xiàn)出表面相互作用調(diào)節(jié)的三聚體結(jié)構(gòu)的情況下，本發(fā)明的組分B必須確保重組融合蛋白的組分A的三聚化。后者的情況是例如典型地當(dāng)僅天然蛋白質(zhì)的片段同樣不能三聚化或至少在體內(nèi)不以三聚體形式存在的時(shí)候，例如因?yàn)槠胶庀騿误w大大轉(zhuǎn)移，也就是說，例如細(xì)胞因子的片段，特別是以下C-末端片段(例如包含來自C末端的至少100 AA(在每種情況下根據(jù)C末端計(jì)算)，優(yōu)選至少120 AA，特別優(yōu)選至少150AA)FasL、CD40L、CD30L、TRAIL、EDA或TNF用作重組融合蛋白的組分A。
但是在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組融合蛋白的組分A還可以采用本發(fā)明的氨基酸序列的形式，其適于用作受體激動(dòng)劑或受體拮抗劑的載體。因此，例如藥理學(xué)活性小有機(jī)化學(xué)分子一般可以共價(jià)偶聯(lián)成這種氨基酸序列，例如通過與蘇氨酸或絲氨酸形成的醚鍵，一種類酰胺鍵或者通過酯鍵共價(jià)偶聯(lián)。這種偶聯(lián)的激動(dòng)劑或拮抗劑可以增大本發(fā)明三聚體的結(jié)合常數(shù)，優(yōu)選將其增大到至少10-9M-1，或者可以調(diào)節(jié)生物活性，特別是本發(fā)明三聚體的抑制行為，尤其是關(guān)于抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)級(jí)聯(lián)的觸發(fā)。此外，本發(fā)明的三聚體可以用作藥理學(xué)活性物質(zhì)的載體。通過選擇適宜的載體，可以這種方式將本發(fā)明的三聚體，一種藥理學(xué)活性成分選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)到特定細(xì)胞的附近空間，而這些特定的細(xì)胞構(gòu)成這些活性成分的藥理學(xué)靶體。例如一種可能性是使這種活性成分與FasL三聚體偶聯(lián)，F(xiàn)asL三聚體的結(jié)合阻斷FasR(從而根據(jù)本發(fā)明，以這種方式抑制細(xì)胞凋亡，安全地保護(hù)所述細(xì)胞的存活)，并使活性成分直接應(yīng)用于靶細(xì)胞。這種系統(tǒng)的一種可能的應(yīng)用例如可以是三聚體與細(xì)胞毒性物質(zhì)如活性成分連接導(dǎo)致的，所述的物質(zhì)阻止免疫細(xì)胞攻擊靶細(xì)胞，例如在發(fā)生變性，特別是神經(jīng)變性疾病，尤其是帕金森氏病或阿耳茨海默氏病的情況下。這樣根據(jù)本發(fā)明在帕金森氏病的情況下可以因此防止黑質(zhì)中產(chǎn)生多巴胺的細(xì)胞的凋亡。因此本發(fā)明總體上公開了本發(fā)明的這種載體系統(tǒng)和，如果合適的話共價(jià)偶聯(lián)活性成分的組分用作人或獸醫(yī)的藥物的應(yīng)用。
重組融合蛋白的組分B一般將采用來自Clq蛋白質(zhì)家族或膠原凝集素家族的蛋白質(zhì)的形式。特別優(yōu)選來自Clq或膠原凝集素家族的蛋白質(zhì)作為重組融合蛋白的組分，即作為組分B，此時(shí)僅三聚化結(jié)構(gòu)域，而不是寡聚化結(jié)構(gòu)域被轉(zhuǎn)錄或翻譯成為重組融合蛋白的組分。優(yōu)選重組融合蛋白中的組分B也不包括球狀“頭”域，即上述天然狀態(tài)蛋白質(zhì)的特征。因此，本發(fā)明的重組融合蛋白中的上述組分B會(huì)具有一般僅包括如膠原、片段的序列，這種序列具有由于形成三股螺旋而發(fā)生三聚化的功能，但它不是還具有與其它三股螺旋形成二或寡聚結(jié)構(gòu)(例如三股螺旋的四或六聚體)的能力的序列片段。
因此三聚化融合蛋白一般僅包含來自Clq蛋白質(zhì)家族或膠原凝集素家族的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域作為負(fù)責(zé)三聚化的組分B，而它們各自的“頭”域?qū)⒈黄渌鳛橥瑯颖憩F(xiàn)生物功能的組分A的蛋白質(zhì)或蛋白片段取代。因此為本發(fā)明的目的，術(shù)語“重組融合蛋白”理解為意指重組融合蛋白中至少一種組分A和至少一種組分B發(fā)生人工融合，即用于本發(fā)明目的的融合蛋白對(duì)應(yīng)于非天然存在的蛋白質(zhì)。
Clq蛋白質(zhì)家族或膠原凝集素家族的蛋白質(zhì)的功能性，即三聚化衍生物，或者上述蛋白質(zhì)的片段的功能衍生物也可以用作使重組融合蛋白聚集得到三聚體的組分B。例如，組分B將包括相關(guān)的蛋白質(zhì)Clq、MBP、SP-A(肺表面活性劑蛋白質(zhì)A)、SP-D(肺表面活性劑蛋白質(zhì)D)、BC(牛血清膠固素)、CL43(牛膠原凝集素-43)和/或ACRP30的序列片段，或者這些蛋白片段的功能衍生物。
特別優(yōu)選重組融合蛋白的三聚體的情況是當(dāng)重組融合蛋白的組分B包括來自形成三股螺旋的膠原序列區(qū)域的序列片段長(zhǎng)度至少為8AA，一般至少20AA的蛋白質(zhì)Clq或蛋白質(zhì)ACRP30的蛋白片段，或者這些蛋白片段的功能衍生物。本發(fā)明的非常特別優(yōu)選的實(shí)施方案是重組融合蛋白的三聚體，它的組分B包括如

圖1所示的氨基酸序列(讀框序列，AA 45-111)或這種鼠(m)氨基酸序列的功能衍生物(例如同源的人序列或同源的另一種哺乳動(dòng)物的序列)或這種序列的片段。
特別優(yōu)選包含來自不同宿主微生物的序列的融合蛋白的三聚體。非常特別優(yōu)選本發(fā)明的聚集體的情況是它們來自嵌合融合蛋白，組分A來自不同于組分B的動(dòng)物種類。因此，這種情況可能是有利的組分A對(duì)應(yīng)于來自小鼠、大鼠、豬或另一種脊椎動(dòng)物，特別是哺乳動(dòng)物的氨基酸序列，或者對(duì)應(yīng)于這種序列的功能衍生物，而組分B來自人，反之亦然?？蛇x擇地，形成本發(fā)明的三聚體的本發(fā)明的融合蛋白中的組分A和組分B的序列還可以優(yōu)選來自相同的動(dòng)物種類。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在重組融合蛋白中作為組分B存在的大于6個(gè)氨基酸，優(yōu)選8-30個(gè)氨基酸，非常特別優(yōu)選8-20個(gè)氨基酸的短氨基酸序列引起重組融合蛋白三聚化。由于這些短氨基酸序列實(shí)現(xiàn)的這種融合蛋白的三聚化一般基于超二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，特別是基于卷曲螺旋式三股螺旋的形成。例如，適用于此目的是所有由于形成超二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如典型的膠原三股螺旋或這些螺旋的片段而產(chǎn)生三聚體的蛋白質(zhì)的序列片段(在它們[脫漏]例如在蛋白質(zhì)CMP、COMP、膠原或?qū)诱尺B蛋白的情況下)。
由于根據(jù)本發(fā)明，導(dǎo)致三聚化的重組融合蛋白的組分B應(yīng)該基本上不形成較高的聚集體，組分B通常應(yīng)當(dāng)不包括能形成分子間二硫橋鍵的半胱氨酸殘基。優(yōu)選重組融合蛋白中的組分B因此[脫漏]不是半胱氨酸殘基，或者僅僅是包含分子內(nèi)二硫橋鍵的半胱氨酸殘基，也就是說處在重組融合蛋白本身之內(nèi)，以避免在氧化條件下可能出現(xiàn)與另一種三聚體的融合蛋白的至少一種半胱氨酸殘基形成共價(jià)鍵的情況。
除了組分A和B之外，該融合蛋白可以包括其它序列片段。在上下文本中，優(yōu)選用于本發(fā)明目的的序列是已知為標(biāo)記序列，如至少一個(gè)flag標(biāo)記序列，即氨基酸序列DYKDDDDK，和/或例如至少一個(gè)組氨酸標(biāo)記(包括若干連續(xù)的組氨酸，例如至少5個(gè))和/或其它標(biāo)記序列或抗原序列。此外，本發(fā)明的融合蛋白的各種片段(組分A、B或標(biāo)記序列，也可以是在本發(fā)明的融合蛋白中存在的兩個(gè)或更多個(gè)組分A)可以通過接頭序列彼此分離。這些接頭序列(至少2AA，優(yōu)選至少5AA)用于重組融合蛋白中各種功能性組分的結(jié)構(gòu)界定，并還可以優(yōu)選發(fā)揮“絞鏈”功能，即具有柔性結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。特別優(yōu)選包括至少一個(gè)蛋白酶剪切位點(diǎn)的接頭，它使組分A能與組分B分離。該接頭中的蛋白酶剪切位點(diǎn)優(yōu)選是凝血酶共有序列。
原則上，可以將組分A排列為與組分B發(fā)生C-或N-末端相聯(lián)，優(yōu)選C-末端。標(biāo)記序列可以存在于本發(fā)明重組融合蛋白的任何位置，優(yōu)選在N末端。
用于阻斷細(xì)胞膜外受體的方法也公開為本發(fā)明的另一個(gè)主題。這些方法的特征是至少一種對(duì)應(yīng)于具有生物功能的蛋白質(zhì)或蛋白片段的組分A和至少一種三聚化組分B的重組，其中首先(a)在例如表達(dá)載體中表達(dá)這種重組融合蛋白，(b)分離，然后(c)加到細(xì)胞培養(yǎng)物，例如細(xì)胞懸浮液，用于進(jìn)行體外研究。因此本發(fā)明的方法適于在體外研究中保護(hù)細(xì)胞，例如保護(hù)細(xì)胞免于細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。這些具有如該方法所述結(jié)合的本發(fā)明的三聚體的細(xì)胞可以進(jìn)一步用于體外研究或用于生產(chǎn)藥物。如果結(jié)合常數(shù)高，則這種體外處理的細(xì)胞可以再移植。例如，這種方法適用于自身免疫疾病或變性疾病的情況，以保護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生體內(nèi)細(xì)胞凋亡性死亡。
上述類型的方法在以下情況下特別優(yōu)選組分A為TNF細(xì)胞因子、TNF細(xì)胞因子的片段或這種蛋白質(zhì)或蛋白片段的功能衍生物。
本發(fā)明的三聚體適于生產(chǎn)藥物或用于治療疾病或病癥以進(jìn)行醫(yī)學(xué)應(yīng)用，即用于人和獸醫(yī)學(xué)，特別是當(dāng)組分A為信號(hào)蛋白或這種信號(hào)蛋白的片段或所述蛋白質(zhì)或片段的衍生物?？梢杂帽景l(fā)明主張的三聚體(異源或同源三聚體)治療大量的疾病或病癥。它們具體應(yīng)用于在這些癥狀中觀察到各種生理學(xué)配體的細(xì)胞外濃度增大或膜結(jié)合的受體的數(shù)量增大的時(shí)候。實(shí)例是細(xì)胞本身的膜結(jié)合的信號(hào)分子如TNF細(xì)胞因子(例如FasL)或可溶性信號(hào)分子如由于蛋白酶剪切而可溶的TNF細(xì)胞因子的濃度增大。在一個(gè)非限制性的舉例中，本發(fā)明的這種三聚體可以用于例如生產(chǎn)治療過度炎癥、自體免疫疾病、基于過度細(xì)胞凋亡反應(yīng)，或者變性的疾病，特別是神經(jīng)變性疾病(例如帕金森氏病)的藥物，如果合適的話還病毒感染。本發(fā)明的三聚體在以下情況下非常特別地合適當(dāng)所述疾病要求意在防止天然細(xì)胞因子的生物活性的治療，即用于阻斷對(duì)應(yīng)的細(xì)胞因子受體。提及的實(shí)例為治療病毒性肝炎(HBV，HCV)、酒精性肝炎病、膽汁淤積性肝炎、威爾森病、由自體免疫系統(tǒng)無功能導(dǎo)致的肝炎，治療以下肝移植排斥反應(yīng)GvHD、TEN(毒性表皮壞死松解癥)、橋本甲狀腺炎或多發(fā)性硬化。
本發(fā)明還涉及編碼上述類型的融合蛋白的DNA序列。這些DNA序列在表達(dá)載體上表達(dá)，對(duì)應(yīng)的包括本發(fā)明融合蛋白的DNA序列的的表達(dá)載體也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明還延伸到用編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中非常特別優(yōu)選用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，該表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼本發(fā)明的融合蛋白的DNA序列。所有上述的本發(fā)明的主題適于作為藥物或用于生產(chǎn)藥物，特別是用于治療本專利申請(qǐng)公開的疾病，如果合適的話作為組合物的組分。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的三聚體或本發(fā)明的其它主題優(yōu)選以這種方式用于生產(chǎn)藥物或用于治療上述疾病或病癥，因而它們適于腸胃外，例如皮下、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi)或口服或鼻內(nèi)或肛門、腹膜內(nèi)、陰道或頰的、大腦內(nèi)、眼內(nèi)給藥(注射或灌輸)，如果合適的話還用于局部應(yīng)用。
每一種本發(fā)明的三聚體或形成本發(fā)明的三聚體的宿主細(xì)胞，或者編碼能夠形成三聚體的重組融合蛋白的DNA序列，或者適宜的表達(dá)載體可以本身作為藥物或用于生產(chǎn)藥物。但是，它們還可以用作與其它活性成分組分或藥學(xué)助劑、載體或添加劑組合的藥物。因此，本發(fā)明的三聚體或本發(fā)明的另一主題可以與藥學(xué)上可接受的載體、助劑和/或添加劑結(jié)合成為組分。因此本發(fā)明還公開了包括本發(fā)明的主題，特別是本發(fā)明的三聚體的(藥物)組合物。適宜的制備方法公開在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(Mack Pub.Co.，Easton，PA，1980)，這里引用該文獻(xiàn)的內(nèi)容作為參考。例如，用于腸胃外給藥的適宜的載體為無菌水、無菌鹽水、聚亞烷基二醇、氫化萘，特別是生物相容的交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。本發(fā)明的組合物可以包括填充劑或諸如以下的物質(zhì)乳糖，甘露醇，用于將聚合物如聚乙二醇共價(jià)連接到本發(fā)明的抑制劑上、與金屬離子絡(luò)合或?qū)⒉牧习谔囟ǖ木酆衔锘衔镏苿﹥?nèi)部或上面的物質(zhì)，例如聚乳酸、聚乙酸、水凝膠或脂質(zhì)體、微乳劑、膠束、單層或多層脂質(zhì)體、紅細(xì)胞片段或原生質(zhì)球。各組合物的實(shí)施方案的選擇取決于物理行為，例如根據(jù)溶解度、穩(wěn)定性、生物利用度或降解性。本發(fā)明的組合物中受控或恒定釋放的活性成分組分包括基于親脂貯存物(例如脂肪酸、蠟或油)的配方。本發(fā)明的物質(zhì)的包衣或包括這些物質(zhì)的組合物，即含聚合物的包衣同樣在本發(fā)明的公開范圍之內(nèi)(例如泊洛沙姆或poloxamines)。而且，可以提供具有保護(hù)性包衣，例如蛋白酶抑制劑或滲透劑的本發(fā)明的物質(zhì)或組合物。
本發(fā)明的三聚體還優(yōu)選用于體外診斷或例如生物化學(xué)純化方法領(lǐng)域。本發(fā)明三聚體在生物化學(xué)純化方法中，特別是在層析方法中的應(yīng)用也是可行的，例如用于填充有這種復(fù)合體例如以能夠分離表達(dá)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞外受體的細(xì)胞的純化柱。因此，這種復(fù)合體用于檢測(cè)目的的應(yīng)用也公開本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
這里描述的本發(fā)明的另一個(gè)主題是適于進(jìn)行[缺漏]三聚化的融合蛋白，條件是該重組融合蛋白包括至少一種組分A和至少一種組分B，組分A包括一種具有生物功能，特別是對(duì)抗體或受體的配體功能的蛋白質(zhì)或蛋白片段，而組分B包含三聚化片段或這種蛋白片段的功能衍生物，如上述作為本發(fā)明的三聚體的組分的片段。因此，所有這些重組融合蛋白為以上公開的作為本發(fā)明的三聚體組分的本發(fā)明公開的重組融合蛋白。因此以上的公開-關(guān)于本發(fā)明的三聚體-關(guān)于組分A和B和關(guān)于重組融合蛋白的構(gòu)建對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)的實(shí)施方案。因此，本發(fā)明重組融合蛋白的組分B通常是一種選自Clq蛋白質(zhì)家族或膠原凝集素家族，或者選自膠原蛋白家族的蛋白片段；而該重組融合蛋白的組分B優(yōu)選排它地包括三聚片段，但不包含三聚體寡聚結(jié)構(gòu)或球形“頭”域。因此通常組分B將包括至少一個(gè)具有七氨基酸模式的氨基酸序列(abcdefg)n，該氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上形成一種形成三股螺旋的螺旋，其中在位置a和d的氨基酸優(yōu)選與它們的非極性側(cè)鏈連接，因而能夠形成上述的超螺旋結(jié)構(gòu)，在這種情況下三股螺旋由三條螺旋組成。這種至少一個(gè)七氨基酸模式，優(yōu)選至少2個(gè)七氨基酸模式的序列可以來自例如以下蛋白質(zhì)之一的角蛋白膠原、Clq、MBP、SP-A、SP-D、BC、CL43或ACRP30。上述蛋白質(zhì)的這種片段的功能衍生物也可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用，以上選擇的組分A的功能衍生物的定義也類似地適用于組分B。
本發(fā)明的其它主題是一種由于形成二硫橋鍵(ApoFasL-060)而在體外在溶液中作為六聚體(2×3)存在的抑制劑。這種抑制劑在體內(nèi)存在-如果合適的話存在于氧化介質(zhì)-以三聚體形式存在，或者表現(xiàn)為類似三聚體的方式，因而發(fā)揮抑制性能。ApoFasL-060由N-末端flag序列、接頭和特定的接頭與來自hFasL的AAs 103-138，同樣來自hFasL的AAs139-281(組分A)組成(見圖1)。類似地，作為組分A的ApoFasL-060類型的抑制劑還可以具有對(duì)應(yīng)的其它TNF細(xì)胞因子的結(jié)合片段，例如OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、APRIL、VEGI和BAFF或它們的片段或衍生物。非常特別優(yōu)選蛋白質(zhì)CD40L，F(xiàn)asL，TRAIL，TNF(特別是與受體TNF-R2結(jié)合的TNF)、CD30L和EDA和它們的片段和衍生物，尤其是它們各自的人序列。
通過以下的圖更為詳細(xì)地例示本發(fā)明圖1表示一個(gè)字母編碼的本發(fā)明的FasL嵌合體(FasL-199、FasL-060和FasL-267)的氨基酸序列。兩種蛋白質(zhì)嵌合體FasL-199和FasL-267包括蛋白質(zhì)ACRP30組分，一種在結(jié)構(gòu)上類似互補(bǔ)因子Clq并由脂肪細(xì)胞生產(chǎn)的血漿蛋白質(zhì)。天然ACRP30蛋白質(zhì)的長(zhǎng)度為247個(gè)氨基酸，具有在N末端的分泌信號(hào)序列(AA1 to 17)和其后的27個(gè)氨基酸的序列(AA18-44)，所述序列負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的寡聚。天然蛋白質(zhì)之后的片段(AA45-110)包括22個(gè)膠原序列重復(fù)，從而形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。在天然狀態(tài)下，這種卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域?qū)е掳l(fā)生三聚化。
蛋白質(zhì)嵌合體FasL-199(對(duì)照)在PCR擴(kuò)增的幫助下構(gòu)建，并包括完全的鼠ACRP30(mACRP30)的寡聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸18-110)。在C末端方向，F(xiàn)asL嵌合蛋白FasL的三聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸139-281)、接頭序列位于N-末端flag標(biāo)記和mACRP30片段之間，并位于mACRP30(組分B)和人hFasL片段(組分A)(LQ)之間。
嵌合蛋白FasL-267主要對(duì)應(yīng)于構(gòu)建體FasL-199，但它缺失mACRP30片段。它不包含ACRP30的寡聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸18-44)。缺失突變體由EST克隆AA673154通過PCR方法產(chǎn)生。mACRP30的氨基酸18-44的缺失導(dǎo)致構(gòu)建體以三聚體的形式存在，這得到凝膠過濾實(shí)驗(yàn)證明。
嵌合蛋白質(zhì)FasL-060具有在N末端的flag序列，隨后是接頭(GPGQVQLQ)，一種可以形成二硫橋鍵的特定接頭，人FasL(hFasL)的AA103-138，和最后作為組分A的hFasL的AA139-281。根據(jù)是否形成二硫橋鍵，ApoFasL-060表現(xiàn)為類似于三聚體或六聚體。
在圖2A中，圖2顯示ApoFasL-060和ApoFasL-267的體外關(guān)于Bjab細(xì)胞的存活力的活性。在Y軸上繪制在OD490nm處的吸光率，并在X軸繪制該細(xì)胞毒性試驗(yàn)中加入的融合蛋白的濃度(取對(duì)數(shù))。在490nm處的光密度是細(xì)胞存活力的度量(高光密度對(duì)應(yīng)于加入物質(zhì)的低細(xì)胞凋亡活性，從而對(duì)應(yīng)于高細(xì)胞存活力)。所示的曲線是關(guān)于在每一種不加入交聯(lián)抗體的情況下，或者在每一種加入交聯(lián)抗體(●，■)的情況下的ApoFasL-267(o)、ApoFasL-060()的試驗(yàn)曲線。與具有交聯(lián)抗體的FasL-267相比，F(xiàn)asL-267單獨(dú)對(duì)細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性，甚至在高濃度(即微稀釋)下也如此。
圖2B顯示圖2A所示的ApoFasL-267(o)和ApoFasL-060()的抑制活性。為了能夠測(cè)定抑制活性，在所有的實(shí)驗(yàn)中加入濃度為50ng/ml的寡聚FasL以觸發(fā)細(xì)胞凋亡。
圖2C顯示親合力研究的結(jié)果，并在每種情況下將FasL-199和FasL-267對(duì)Bjab細(xì)胞的親合力進(jìn)行比較。ApoFasL-267和FasL-199與ZB4抗體競(jìng)爭(zhēng)以結(jié)合到BJAB細(xì)胞上的Fas。分別繪制結(jié)合的ZB4(抗Fas抗體)的百分率對(duì)FasL199()和FasL-267(o)的濃度的圖。在測(cè)定誤差的范圍內(nèi)，在兩種FasL配體的親合力方面沒有發(fā)現(xiàn)差別。因此證明兩種配體之間在它們的細(xì)胞毒性方面的差別的基礎(chǔ)不是對(duì)受體的不同結(jié)合親合力。
圖3顯示體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，即ApoFasL-060對(duì)激動(dòng)性抗Fas抗體J02誘導(dǎo)的肝細(xì)胞溶解的抑制作用。圖3A顯示實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中對(duì)小鼠在靜脈內(nèi)注射5μg的J02抗體之前靜脈內(nèi)注射ApoFasL-060(25μg/小鼠)或鹽水(對(duì)照)。圖3A中的實(shí)心棒條代表ALT的血清滴定度(以U/ml為單位)，而空心的棒條代表AST的，作為靜脈注射注射后4小時(shí)的測(cè)定結(jié)果。右邊的圖表示對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖3B表示小鼠的存活率，該小鼠已在用鹽水溶液(實(shí)心棒條)或ApoFasL-060(20μg)(淺灰色棒條，在每種情況下為從左開始的第二個(gè)棒條)預(yù)處理或僅用ApoFasL-060(深灰色棒條，在每種情況下為從左開始的第三個(gè)棒條)或ApoFasL-060和交聯(lián)抗體(中等灰色棒條，在每種情況下處在右邊)預(yù)處理之后接受10μg的J02抗體，將所述存活率作為給藥后經(jīng)過的時(shí)間(2小時(shí)、4小時(shí)、24小時(shí))的函數(shù)。在4小時(shí)后，僅接受激動(dòng)性J02抗體(黑色棒條)的小鼠無一存活，而抑制劑(淺灰色棒條)使基本上所有的小鼠存活。因此，ApoFasL-060防止激動(dòng)性抗Fas抗體J02對(duì)小鼠的致死作用。進(jìn)而交聯(lián)抗體取消ApoFasL-060(中等灰色棒條)的抑制作用。
圖4顯示在寡聚FasL誘導(dǎo)肝損害之后的ApoFasL-267的作用。圖4顯示小鼠在靜脈內(nèi)注射寡聚FasL(FasL-199)之前靜脈內(nèi)注射鹽水或25μgApoFasL-267的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在過4小時(shí)后分析ALT(實(shí)心棒條)和AST(空心的棒條)的血清滴定度。而且，這些棒條代表各種以U/ml為單位的滴定度。圖4的中間和右邊的圖表示施用激動(dòng)性，即觸發(fā)細(xì)胞凋亡的FasL之后的結(jié)果，而左邊的圖代表不施用激動(dòng)性FasL的情況下的對(duì)比實(shí)驗(yàn)。因此圖4不僅表示對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，而且表示不含保護(hù)性配體的FasL-199的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及與保護(hù)性配體FasL-267結(jié)合的FasL-199的結(jié)果。
圖5顯示在AAP誘導(dǎo)的肝炎的情況下可溶的FasL的作用。在給小鼠腹膜內(nèi)注射AAP(300mg/kg)之前靜脈內(nèi)注射ApoFasL-267(圖5A)或ApoFasL-060(圖5B或5C)。圖5A和5B的圖是在每種情況下在注射后5小時(shí)測(cè)得的ALT(實(shí)心棒條)和AST(空心棒條)的滴定度(U/ml)。圖5A和5B中左邊的圖對(duì)應(yīng)于對(duì)比實(shí)驗(yàn)，而右邊的圖(圖5A)以及在圖5B的情況下中間和右邊的圖顯示施用本發(fā)明的抑制劑之后的結(jié)果。圖5C顯示與模擬處理(對(duì)照)動(dòng)物(100％)相比的氨基轉(zhuǎn)移酶滴定度的相對(duì)減小。
圖6顯示ApoFasL-267和ApoFasL-060對(duì)AAP處理的鼠肝的作用。如圖5所述處理小鼠。在誘導(dǎo)肝炎后24小時(shí)，解剖肝并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。圖6包含三幅組織學(xué)切片圖(加入AAP、加入AAP和ApoFasL-267，最后在加入鹽水后的對(duì)比設(shè)置(對(duì)照))。用ApoFasL-267(或ApoFasL-060，未顯示)處理小鼠防止肝損害，這可以從與對(duì)照動(dòng)物的組織切片的比較中看出。相反，單獨(dú)用AAP處理的動(dòng)物的肝表現(xiàn)為中央小靜脈區(qū)壞死和細(xì)胞凋亡、竇狀隙炎性充血和形成空泡的肝細(xì)胞。
圖7A顯示本發(fā)明的Fas嵌合體Fas-ACRP30(MKB216)的cDNA序列和它的衍生氨基酸序列。該構(gòu)建體包括細(xì)胞外Fas域(即Fas受體)的氨基酸17-172，通過長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸的接頭融合到鼠ACRP30的完全寡聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸18-110)。在其氨基末端，該構(gòu)建體還包括Ig重鏈的信號(hào)序列和flag標(biāo)記。而且，圖中顯示了限制切割位點(diǎn)。
圖7B顯示一個(gè)限制圖，表示圖7A的構(gòu)建體的剪切位點(diǎn)。
圖8記錄Fas-ACRP30的體外在A20細(xì)胞中抗FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用。在Y軸上繪制在490nm處的吸光率(細(xì)胞存活力測(cè)定；還參照?qǐng)D2)，而在X軸上繪制以ng/ml為單位的所關(guān)注的融合蛋白的濃度。將Fas-ACRP30的抑制作用與Fas-Fc，F(xiàn)as的二聚體形式的抑制作用和Fas-COMP，F(xiàn)as的五聚體形式的抑制作用進(jìn)行比較。所用的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑是本發(fā)明的FasL嵌合體，F(xiàn)asL-199。Fas-ACRP30構(gòu)建體抑制FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，且其IC50值為80ng/ml。此值與五聚Fas衍生物Fas-COMP(35ng/ml)的值相當(dāng)，而(二聚)FasFc的IC50值大于1μg/ml。
用以下實(shí)施例更詳細(xì)地例示本發(fā)明除非這里另外指定，以下的實(shí)驗(yàn)條件(a)-(f)適用于以下6個(gè)應(yīng)用實(shí)施例(a)FasL、TRAIL、TNFα和CD4OL融合蛋白的載體構(gòu)建體使用寡核苷酸JT398(ACT GCA GGA AAA AAA GGA GCT G)和J290(CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C)，由人cDNA擴(kuò)增FasL的三聚化結(jié)構(gòu)域(AA 139-281)。將此PCR產(chǎn)物連接到pCRII(InVitrogen)，然后在缺失堿基720-769的修飾的PCRIII載體(PS038，InVitrogen，NV Leek，The Netherlands)(PS 038)的限制剪切位點(diǎn)HindIII和BamHI之間亞克隆編碼序列，該編碼序列通過限制剪切位點(diǎn)PstI和EcoRI進(jìn)行讀框，包括編碼血細(xì)胞凝集素信號(hào)肽的DNA片段，包括5′-未翻譯的序列(CAA AAC ATG GCT ATC ATC TAC CTC ATC CTCCTG TTC ACC GCT GTG CGG GGC)和flag表位(GAT TAC AAA GACGAT GAC GAT AAA)的6個(gè)堿基、接頭(GGA CCC GGA CAG GTGCAG)、限制剪切位點(diǎn)PstI、SalI、XhoI和BamHI。
如下構(gòu)建FasL-199的表達(dá)載體。使用EST克隆AA673154，在寡核苷酸JT1147(ACA ATG CAT GAA GAT GAC GTT ACT AC)和JT1148(AGA CTG GAG AGC GGC TTC TCC AGG)的幫助下首先完成PCR擴(kuò)增。將通過限制剪切位點(diǎn)NsiI和PstI讀框的編碼鼠ACRP30的氨基酸18-111的序列[缺漏]克隆到編碼三聚FasL的載體的PstI剪切位點(diǎn)中(以這處方式使融合的NsiI/PstI剪切位點(diǎn)在該編碼序列的5′側(cè))。借助可選擇的5′-寡核苷酸JT1421(AAA ATG CAT GCA GGC ATC CCAGGA C)擴(kuò)增表達(dá)融合蛋白FasL-167(含mACRP30的AA44-111)的載體。將PCR產(chǎn)物連接到PCR“平”系統(tǒng)，并將Nsi/PstI盒亞克隆到上述含有FasL的載體。通過使各個(gè)配體序列進(jìn)入限制剪切位點(diǎn)PstI和EcoRI而取代表達(dá)載體FasL-ACRP30上的各FasL序列，從而產(chǎn)生其它具有可選擇的與ACRP30結(jié)合的TNF細(xì)胞因子的融合蛋白。
(b)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化借助磷酸鈣法穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。HEK293細(xì)胞在培養(yǎng)三天后在包括800μg/ml G418的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)兩周(還參見loc.cit.Schneider等人，J.Exp.Med.1998)。移出這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆并將其分配到含有選擇培養(yǎng)基的96孔平板。借助抗flag蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析上清液中重組蛋白質(zhì)的存在。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在處在燒瓶中的800ml非選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10-14天。將培養(yǎng)物離心，并將上清液過濾滅菌。然后如下純化含有鼠ACRP30(FasL-267或FasL-199)的FasL的融合蛋白。用NaCl和CaCl2(最終濃度分別為150mM和2mM)處理上清液，用鹽酸/氫氧化鈉水溶液使pH變?yōu)?.0。然后，將重組蛋白質(zhì)應(yīng)用于1ml M2-瓊脂糖柱(Sigma，Switzerland)(0.5ml/min，48小時(shí)，40℃)，并用10體積包括2mMCaCl2的TBS洗滌該柱，最后用TBS-EDTA(10mM)(0.1ml/min，40℃)或50mM檸檬酸鹽/NaOH(pH2.5)(1ml/min，40℃)洗脫，如果合適的話用0.2體積的1M Tris-HCl(pH8)中和。在30kDA排阻限的濃縮器(Millipore)中用PBS換緩沖液。通過bicinchonic酸法，使用牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定純化蛋白質(zhì)的濃度(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.USA)，并通過SDS-PAGE和考馬斯藍(lán)染色來測(cè)定樣品純度。
(c)細(xì)胞使人T-lymphoplastoma Jurkat細(xì)胞、BJAB Burkitt淋巴瘤細(xì)胞或Raji細(xì)胞在伴有10％FCS的RPMI中生長(zhǎng)。在補(bǔ)充2％FCS的DMEM多物質(zhì)混合物F12(1∶1)中培養(yǎng)人胚腎細(xì)胞293。所有的培養(yǎng)基包括抗生素(每種情況下5μg/ml的青霉素和鏈霉素和10μg/ml的新霉素)。
(d)細(xì)胞毒性試驗(yàn)基本上如上述Schneider等人(J.Biol.Chem.27218827-18833，1997)所述完成細(xì)胞毒性試驗(yàn)。這里在100μl培養(yǎng)基中將50 000個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)，所述培養(yǎng)基包括存在或不存在1μg/ml M2抗體的以上所示的配體濃度。借助PMS/MTS(phenanzine硫酸二甲酯3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-5-[3-羰基甲氧基苯基]-2-[4-磺苯基]-2H-四氮唑，鹽)(PromegaCorp.，Madison，WI)測(cè)定細(xì)胞存活率。使顏色在需要的時(shí)間內(nèi)發(fā)育(一般1-3小時(shí))。在490nm處測(cè)定吸光率。490nm處的光密度是細(xì)胞存活力的度量(高光密度對(duì)應(yīng)于加入物質(zhì)的低細(xì)胞凋亡作用，從而對(duì)應(yīng)于高細(xì)胞存活力)。
(e)小鼠的治療給雌性Balb/c小鼠(8-10周齡)靜脈內(nèi)注射多種構(gòu)建體。在指定的時(shí)間之后使小鼠流血，然后對(duì)氨基轉(zhuǎn)移酶AST和ALT(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)的滴定度進(jìn)行定量。
(f)材料從Sigma(Buchs，Switzerland)購得偶聯(lián)瓊脂糖的抗-flag-M1和抗-flag-M2抗體。從Pharmingen購得J02抗體，并從Life Sciences(Basle，Switzerland)購得細(xì)胞培養(yǎng)試劑。
(g)結(jié)合研究使用競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)測(cè)定ApoFasL-267和FasL-199的親合力。為此目的，利用iodo-Gen法(Pierce，Rockford，IL)用100μCi(125I)標(biāo)記單克隆ZB4抗Fas抗體。這導(dǎo)致1.5μCi/μg蛋白質(zhì)的特定活性。在37℃下用連續(xù)稀釋的(100μg/ml-10ng/ml)放射性標(biāo)記的ZB4和未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)物將1×105Bjab細(xì)胞培養(yǎng)1小時(shí)。用包括1％BSA的冷PBS洗滌三次后，使用γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞上結(jié)合的放射活性，并表示為結(jié)合的cpm的百分率。所有的實(shí)驗(yàn)以一式三份完成。
而且，關(guān)于用于實(shí)施應(yīng)用實(shí)施例的方法的說明，特別參考Schneider等人(J.Exp.Med.，Vol.187，No.8，1998，1205-1213)和本文引用作為參考的出版物。
應(yīng)用實(shí)施例1表達(dá)重組融合蛋白(1，F(xiàn)asL-199)，該重組融合蛋白包括hFasL(h人)的氨基酸139-281作為組分A，和組分A的氨基酸139的N末端長(zhǎng)度為94AA的序列(mACRP30的AA18-111)作為組分B。在融合蛋白的N末端(組分B的N末端)，還表達(dá)具有氨基酸DYKDDDDK的flag序列和排列在flag標(biāo)記和結(jié)合的偶聯(lián)B之間的接頭序列GPGQVQLQLH(見圖1)。組分A和B被接頭序列LQ分隔。
關(guān)于對(duì)比實(shí)驗(yàn)，表達(dá)這樣的融合蛋白(2，F(xiàn)asL-267)它在其N末端同樣包括上述flag序列和C末端之后的相同接頭序列，而在C末端的排列中包括hFasL的氨基酸139-281。因此通過缺失包含特定的接頭和hFasL的氨基酸103-138而使融合蛋白(1)不同于融合蛋白(2)(圖1)。
如以上方法所述構(gòu)建融合蛋白(1)和(2)的載體。表達(dá)該融合蛋白，并如在方法(b)中所述進(jìn)行純化。
通過電子顯微鏡法測(cè)定純化的融合蛋白(1和2)的多聚化或寡聚化程度。結(jié)果是作為六聚體(2×3聚體)的FasL-199和關(guān)于FasL-267的對(duì)應(yīng)的測(cè)定值得到三聚體和同樣作為六聚體的ApoFasL-060的結(jié)果。
應(yīng)用實(shí)施例2ApoFasL-060和ApoFasL-267對(duì)Fas介導(dǎo)的體外細(xì)胞凋亡的抑制作用移出根據(jù)(c)所述生長(zhǎng)的Bjab-Burkitt淋巴瘤細(xì)胞，并根據(jù)(d)所述對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。關(guān)于此細(xì)胞系，如下完成試驗(yàn)在每種情況下使用增加濃度的三聚化融合蛋白ApoFasL060和ApoFasL-267，在抗flagM2抗體(Sigma，Buchs，Switzerland)(圖2A)存在或不存在下，通過測(cè)定在OD 490nm下的吸光率。所用的抑制劑，ApoFasL-060和ApoFasL-267如圖1所示(參見應(yīng)用實(shí)施例1)。
當(dāng)與指向flag標(biāo)記的抗體交聯(lián)時(shí)，兩種抑制劑均揭示類似的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)性能(圖2A)。當(dāng)不存在交聯(lián)抗體時(shí)，由于ApoFasL-060的聚集體結(jié)構(gòu)，它也誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此應(yīng)用實(shí)施例2的結(jié)果證明，雖然ApoFasL-060和ApoFasL-267各自能夠與Fas受體結(jié)合，但它們需要寡聚化以轉(zhuǎn)導(dǎo)死亡信號(hào)。兩種抑制劑的細(xì)胞毒性降低并不有助于Fas受體親合力的減小，因?yàn)樗鼈儗?duì)寡聚FasL(FasL-199)的親合力沒有減小。
此外，用增加的ApoFasL-267濃度預(yù)培養(yǎng)Bjab細(xì)胞，然后加入FasL-199以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(參見圖2B)。它表明可以由ApoFasL-267防止FasL-199誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。從這一系列的測(cè)定可以看出，三聚體分子形式的ApoFasL-267能夠在體外防止抑制濃度(IC)100ng/ml下的細(xì)胞凋亡。因此，雖然三聚體形式的ApoFasL-267通過阻斷受體而防止細(xì)胞凋亡，但ApoFasL-060聚集不能在體外防止FasL-199誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因?yàn)樗旧碛捎谄浣Y(jié)構(gòu)導(dǎo)致其具有細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。
應(yīng)用實(shí)施例3誘導(dǎo)肝細(xì)胞溶解后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)A.ApoFasL-060的作用為此目的，給小鼠注射激動(dòng)性J02-抗-Fas抗體，從而由于暴發(fā)性肝功能衰竭而導(dǎo)致處理小鼠死亡。通過高氨基酸轉(zhuǎn)移酶(AST和ALT)血清滴定度來檢測(cè)這些小鼠的肝細(xì)胞溶解。用ApoFasL-060(1mg/kg)對(duì)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)預(yù)處理，從而保護(hù)在給動(dòng)物施用J02抗體之后免于由后者觸發(fā)的肝功能衰竭(肝細(xì)胞溶解)(參見圖3A)。如所預(yù)期的，ApoFasL-060的保護(hù)作用是依賴于劑量的。當(dāng)施用5μg的J02抗體時(shí)，所觀察到的AST和ALT滴定度對(duì)應(yīng)于對(duì)照小鼠的那些。在10μg的J02抗體的劑量下，觀察到顯著的保護(hù)作用(AST和ALT滴定度降低大約90％)。因此結(jié)果是，除非使用一種交聯(lián)抗體(圖3B)，ApoFasL-060本身不具有毒性，因而細(xì)胞凋亡抑制作用的也基于與Fas受體的結(jié)合而不觸發(fā)死亡信號(hào)。
J02抗體的致死劑量(10μg/每只小鼠，靜脈內(nèi)注射)導(dǎo)致所有研究的小鼠在4小時(shí)內(nèi)死亡(圖3B)。用ApoFasL-060預(yù)處理這些動(dòng)物大幅度地降低死亡率-24小時(shí)后的存活率總計(jì)86％。抑制劑ApoFasL-060(本身注射)證明無毒-但是在注射交聯(lián)抗體之后它具有高毒性作用，且在4小時(shí)后的死亡率為80％。
B.ApoFasL-267的作用在此應(yīng)用實(shí)施例中，在注射FasL-199之前給小鼠注射鹽水(作為對(duì)照)或ApoFasL-267。因此隨后評(píng)價(jià)在被處理的小鼠的肝細(xì)胞溶解分析中的各AST和ALT血清滴定度(參見圖4)。用ApoFasL-267預(yù)處理的小鼠被保護(hù)免于發(fā)生由寡聚FasL(FasL 199)誘導(dǎo)的肝細(xì)胞溶解。在用作對(duì)照的動(dòng)物中，可以在FasL-199給藥之后非常快速地觀察到FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞溶解(在2小時(shí)內(nèi))，表明氨基轉(zhuǎn)移酶滴定度增加10倍。因此，用ApoFasL-267預(yù)處理動(dòng)物防止動(dòng)物的肝損害，這可以由AST和ALT血清滴定度測(cè)得。
應(yīng)用實(shí)施例4對(duì)乙酰氨基酚(AAP)誘導(dǎo)的肝炎的抑制對(duì)乙酰氨基酚(AAP)，一種止痛藥，已知誘導(dǎo)暴發(fā)性肝功能衰竭。其分子機(jī)理基于Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此在本應(yīng)用實(shí)施例中研究了三聚ApoFasL-267和/或六聚ApoFasL-060保護(hù)肝細(xì)胞免于AAP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的可能性。為此目的，給小鼠腹膜內(nèi)注射次致死劑量的AAP(0.3g/kg)。5小時(shí)后，通過測(cè)定ALT和AST血清滴定度而測(cè)定肝損害。根據(jù)IFCC(國際臨床化學(xué)聯(lián)盟)指南在酶試驗(yàn)中測(cè)定ALT和AST滴定度。施用ApoFasL-267或ApoFasL-060防止AAP導(dǎo)致的AST或ALT滴定度增大。與未處理的小鼠相比，對(duì)已根據(jù)本發(fā)明預(yù)處理的小鼠進(jìn)行觀測(cè)時(shí)的氨基轉(zhuǎn)移酶滴定度顯著降低(75-90％)。
用ApoFasL-060預(yù)處理的保護(hù)作用證明是依賴于劑量的(參見圖5B和5C)。施用25μg的ApoFasL-060(1mg/kg)，沒有觀察到AAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞溶解；當(dāng)注射12.5μg時(shí)，氨基轉(zhuǎn)移酶滴定度稍微增加，即發(fā)生輕微的肝損害，而甚至更低的劑量如6μg/小鼠導(dǎo)致保護(hù)作用喪失。在低劑量和已用鹽水處理的對(duì)照動(dòng)物之間沒有觀察到差別。因此可以指出，所觀察的抑制作用采用受體上結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)的形式。
對(duì)AAP誘導(dǎo)的肝損害進(jìn)行組織學(xué)檢查(圖6A)。必須提及以下中心小靜脈區(qū)域的壞死和細(xì)胞凋亡、竇狀隙炎性充血、形成空泡的肝細(xì)胞。相反，如圖6B所示，在用ApoFasL-267(或ApoFasL-060，未顯示)預(yù)處理時(shí)這些肝損害的癥狀是不可辨別的。
應(yīng)用實(shí)施例5A.Fas受體嵌合體的構(gòu)建為了制備一種非常有效的FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制劑，制備一種由通過長(zhǎng)度為14個(gè)氨基酸的接頭連接的Fas受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸17-172)和鼠ACRP30的完全寡聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸18-110)組成的融合蛋白(圖7)。該重組蛋白用SDS-PAGE法分析，在還原條件下的表觀分子量為55kDa，而在非還原條件下的表觀分子量為150kDa。因此可以斷定構(gòu)建體MKB216(下文稱為Fas-ACRP30)基本上以六聚體(2×3聚體)的形式存在。
B.Fas-ACRP30對(duì)FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制作用為了證明本發(fā)明的融合蛋白Fas-ACRP30對(duì)FasL介導(dǎo)的體外細(xì)胞凋亡的抑制作用，用增加的Fas-ACRP30濃度預(yù)培養(yǎng)FasL-敏感性A20細(xì)胞，然后加入寡聚FasL。本發(fā)明的構(gòu)建體FasL199具體用作本實(shí)驗(yàn)中的特別有效FasL寡聚體。以這種方式將本發(fā)明的構(gòu)建體Fas-ACRP30的作用與Fas的二聚體形式(Fas-Fc)和Fas的五聚體形式(Fas-COMP)的作用進(jìn)行比較。如圖8所示，80ng/ml的Fas-ACRP30濃度可以導(dǎo)致FaSL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡降低大約50％。此值顯著低于二聚的對(duì)比構(gòu)建體Fas-Fc的值(IC50＞1μg/ml)。IC50為35ng/ml的Fas-COMP的抑制作用與Fas-ACRP30的抑制作用相當(dāng)。因此這些數(shù)據(jù)證實(shí)Fas-ACRP30是一種有效的FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制劑。
序列表<110>Apotech Research & Development Ltd.(除了US)TSCHOPP，Jur(僅US)SCHNEIDER，Pascal(僅US)<120>重組融合蛋白及其三聚體<130>AP01P002WO<140>PCT/EP02/05103<141>2002-05-08<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>213<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述ApoFasL-060<220>
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<221>結(jié)構(gòu)域<222>(9)..(16)<223>接頭<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(17)..(34)<223>特定的接頭<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(35)..(70)
<223>人FasL aa 103-138<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(71)..(213)<223>人FasL aa 139-281<220>
<221>二硫鍵<222>(29)<400>1Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln1 5 10 15Val Asp Leu Glu Gly Ser Thr Ser Asn Gly Arg Gln Cys Ala Gly Ile20 25 30Arg Leu Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala Glu Leu Arg Glu35 40 45Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu Lys Gln Ile Gly50 55 60His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His65 70 75 80Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp85 90 95Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly100 105 110Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr115 120 125Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr130 135 140Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys145 150 155 160Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr165 170 175
Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn180 185 190Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe195 200 205Gly Leu Tyr Lys Leu210<210>2<211>255<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述ApoFasL-199<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(8)<223>Flag<220>
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<400>2Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His1 5 10 15Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val Pro20 25 30Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His35 40 45Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro50 55 60Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly Leu Leu Gly Pro Lys Gly65 70 75 80Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe85 90 95Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Ala Ala Leu Gln100 105 110Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn115 120 125Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu130 135 140Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr145 150 155 160Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys165 170 175Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr180 185 190Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr195 200 205Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn210 215 220Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu
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<223>人工序列描述ApoFasL-267<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(1)..(8)<223>Flag<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(9)..(16)<223>接頭<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(17)..(84)<223>小鼠ACRP30 aa 44-111<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(85)..(86)<223>接頭<220>
<221>結(jié)構(gòu)域<222>(87)..(229)<223>人FasL aa 139-281<400>3Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu His1 5 10 15Ala Gly Ile Pro Gly His Pro Gly His Asn Gly Thr Pro Gly Arg Asp
20 25 30Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ala Gly35 40 45Leu Leu Gly Pro Lys Gly Glu Thr Gly Asp Val Gly Met Thr Gly Ala50 55 60Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Arg Lys Gly Glu Pro65 70 75 80Gly Glu Ala Ala Leu Gln Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys Val Ala His85 90 95Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu Trp Glu Asp100 105 110Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys Lys Gly Gly115 120 125Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Val Tyr130 135 140Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His Lys Val Tyr145 150 155 160Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met Glu Gly Lys165 170 175Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg Ser Ser Tyr180 185 190Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu Tyr Val Asn195 200 205Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln Thr Phe Phe210 215 220Gly Leu Tyr Lys Leu225<210>4<211>8
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述在本發(fā)明的重組融合蛋白中的Flag序列<400>4Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述在重組融合蛋白ApoFasL-060中的接頭序列<400>5Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln1 5<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述接頭序列(說明書28頁)<400>6Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln Leu His1 5 10<210>7<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸JT398(用于hFasL-三聚化結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增)(說明書24頁)<400>7actgcaggaa aaaaaggagc tg 22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸J290(用于hFasL-三聚化結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增)(說明書24頁)<400>8caacattctc ggtgcctgta ac 22<210>9<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述編碼血細(xì)胞凝集素的信號(hào)肽的DNA片段(說明書24頁)<400>9caaaacatgg ctatcatcta cctcatcctc ctgttcaccg ctgtgcgggg c 51<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述Flag表位，本發(fā)明的FasL-蛋白質(zhì)的部分編碼序列(說明書24頁)<400>10gattacaaag acgatgacga taaa 24<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述接頭，part本發(fā)明FasL-蛋白質(zhì)的部分編碼序列(說明書24頁)<400>11ggacccggac aggtgcag18<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸JT1147(在用于FasL-199的載體構(gòu)建體中用于PCR擴(kuò)增)(說明書25頁)<400>12acaatgcatg aagatgacgt tactac26<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸JT1148(在用于FasL-199的載體構(gòu)建體中用于PCR擴(kuò)增)
(說明書25頁)<400>13agactggaga gcggcttctc cagg 24<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述寡核苷酸JT1421(在用于FasL-167的載體構(gòu)建體中用于PCR擴(kuò)增)(說明書25頁)<400>14aaaatgcatg caggcatccc aggac 2權(quán)利要求
1.一種重組融合蛋白的三聚體，其特征在于所述重組融合蛋白包括至少一種組分A和至少一種組分B，組分A包括具有生物功能，特別是對(duì)抗體，對(duì)可溶或膜結(jié)合的信號(hào)分子或者對(duì)受體或抗體或抗體片段具有配體功能的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段；而組分B包括一種將組分A三聚化的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
2.如權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于在該三聚體中的重組融合蛋白的組分A相同或不同。
3.如權(quán)利要求1或2所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該重組融合蛋白的組分A為肽類激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、受體、這些物質(zhì)的片段或上述序列的功能衍生物。
4.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該重組融合蛋白的組分A為來自TNF細(xì)胞因子家族的細(xì)胞因子或TNF細(xì)胞因子受體，這種TNF細(xì)胞因子或受體的片段，或者TNF細(xì)胞因子或受體的功能衍生物，或者這種TNF細(xì)胞因子或受體的片段的功能衍生物。
5.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該重組融合蛋白的組分A為選自以下的TNF細(xì)胞因子或TNF細(xì)胞因子的片段CD40L、FasL、TRAIL、TNF-α、CD30L、OX40L、RANKL、TWEAK、Lta、Ltab2、LIGHT、CD27L、41-BB、GITRL、AP-RIL、EDA、VEGI和BAFF，或者上述序列的功能衍生物。
6.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于組分B包括一種蛋白質(zhì)片段，該蛋白質(zhì)片段包括至少一個(gè)七氨基酸模式的膠原結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域。
7.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于組分B包括蛋白質(zhì)ACRP30的片段，包括三聚化結(jié)構(gòu)域，而不能形成更高級(jí)的三聚體的聚集體。
8.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于組分B包括一種如圖1所示的關(guān)于ACRP30的氨基酸序列44-111的氨基酸序列，或這種序列的功能衍生物，其中圖1是權(quán)利要求的組成。
9.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該重組融合蛋白具有如圖1所示的FasL-267序列，其中圖1是本權(quán)利要求的組成。
10.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該重組融合蛋白包括組分A和組分B之間的接頭序列。
11.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該接頭序列包括二肽LQ。
12.如前述權(quán)利要求任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白的三聚體，其特征在于該重組融合蛋白包括標(biāo)記序列，優(yōu)選N-末端標(biāo)記序列。
13.一種重組融合蛋白的三聚體，其特征在于所述三聚體中存在的三個(gè)重組融合蛋白中的至少兩個(gè)具有不同的組分B。
14.如權(quán)利要求1-13任何項(xiàng)所述的三聚體用于制備藥物的用途。
15.如權(quán)利要求1-13任何項(xiàng)所述的三聚體用于制備治療以下疾病的藥物的用途病毒性肝炎(HBV、HCV)、酒精性肝炎、膽汁淤積性肝炎、威爾森氏病、自體免疫肝炎、肝移植排斥、過度細(xì)胞凋亡反應(yīng)導(dǎo)致的疾病、變性疾病，特別是神經(jīng)變性疾病、炎癥、毒性表皮壞死松解癥(TEN)、多發(fā)性硬化、橋本甲狀腺炎、GvHD。
16.一種重組融合蛋白，其特征在于該重組融合蛋白包括組分A和組分B，組分A是一種具有生物功能，特別是對(duì)抗體或受體或者抗體或抗體片段或者對(duì)可溶或膜結(jié)合的信號(hào)分子具有配體功能的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段，而組分B包括三聚化片段或蛋白質(zhì)的這種片段，特別是選自Clq蛋白質(zhì)家族和膠原凝集素家族的蛋白質(zhì)片段的功能衍生物。
17.一種DNA序列，其特征在于該DNA序列編碼如權(quán)利要求1-13任何項(xiàng)所述的重組融合蛋白。
18.一種表達(dá)載體，其特征在于該表達(dá)載體包括如權(quán)利要求17所述的DNA序列。
19.一種宿主細(xì)胞，其特征在于該宿主細(xì)胞被如權(quán)利要求18所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有能夠形成三聚體的性能的重組融合蛋白。該重組融合蛋白包括至少一種組分A和至少一種組分B。組分B具有三聚化性能，而組分A具有生物性能。本發(fā)明還涉及該重組融合蛋白的三聚體。本發(fā)明還涉及該三聚體在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用和它們用于體外診斷或體外診斷試劑的生產(chǎn)的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼該融合蛋白的DNA序列和表達(dá)載體和含有該DNA序列或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1602358SQ02813077
公開日2005年3月30日 申請(qǐng)日期2002年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月8日
發(fā)明者J·喬普, P·施奈德 申請(qǐng)人:阿波克西斯公司