專(zhuān)利名稱(chēng)：含泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的感染性嗜肝dna病毒顆粒的制備及其使用方法
本申請(qǐng)要求2001年6月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/299,906的權(quán)益，該申請(qǐng)的內(nèi)容在本文引入作為參考。
在本申請(qǐng)的正文中，以作者和日期的形式引用了各種出版物。在說(shuō)明書(shū)之后，權(quán)利要求書(shū)之前以字母順序列出了這些出版物的完整引文。包括前文和后文中引用的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物都作為一個(gè)整體在此引入作為參考。為了更全面地介紹本發(fā)明完成時(shí)技術(shù)人員所了解的本技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)狀，這些專(zhuān)利申請(qǐng)的內(nèi)容也作為一個(gè)整體在本申請(qǐng)中引用作為參考。
背景技術(shù)：
HBV復(fù)制原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞及數(shù)種肝癌細(xì)胞系中HBV全長(zhǎng)DNA分子克隆的瞬時(shí)表達(dá)可以產(chǎn)生B型肝炎病毒(HBV)顆粒。這種方式產(chǎn)生的病毒顆粒與受HBV感染個(gè)體中的感染性病毒毒粒(Dane顆粒)相似，它們的感染性已在黑猩猩上得到證實(shí)。不幸的是，此類(lèi)體外細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的HBV顆粒不能有效地感染體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞系(如HepG2細(xì)胞系)，使HBV復(fù)制研究和抗病毒藥物研發(fā)受到限制。
與此相似，正如美國(guó)專(zhuān)利NO.6,242,187所述，利用HBV耐藥試驗(yàn)載體產(chǎn)生的HBV病毒顆粒不能感染靶宿主細(xì)胞，此點(diǎn)在建立HBV雙細(xì)胞藥物敏感性分析方法時(shí)也是一大障礙。感染受阻的原因尚不清楚，可能它反映了目前可用肝細(xì)胞系的表面上缺乏功能性HBV受體，但也有數(shù)據(jù)支持其他解釋。HBV受體至今仍未得以鑒定。
因此，需要建立合適的手段和方法，以便產(chǎn)生可以感染體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞系的嗜肝DNA病毒顆粒。另外，也需建立合適的手段和方法來(lái)產(chǎn)生嗜肝DNA病毒顆粒，并使用這種嗜肝DNA病毒顆粒在一種宿主細(xì)胞和一種靶細(xì)胞——即體外雙細(xì)胞體系中進(jìn)行藥物敏感性及抗性試驗(yàn)、病毒適合度分析和基因型分析。
發(fā)明概述相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生可以感染體外維持的(maintained)肝細(xì)胞系的嗜肝DNA病毒顆粒的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用感染性嗜肝DNA病毒顆粒在雙細(xì)胞體系中進(jìn)行藥物敏感性和抗性試驗(yàn)的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用感染性嗜肝DNA病毒顆粒在體外進(jìn)行藥物敏感性和抗性試驗(yàn)的方法，其中產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)來(lái)測(cè)定感染性。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述的在體外進(jìn)行藥物敏感性和抗性試驗(yàn)的方法，其利用含有來(lái)源于病人的片段、具有感染性的嗜肝DNA病毒顆粒。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用感染性嗜肝DNA病毒顆粒測(cè)定病人嗜肝DNA病毒復(fù)制能力的體外方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒定嗜肝DNA病毒中賦予化合物抗性的突變的方法，所述化合物可以抑制嗜肝DNA病毒的復(fù)制。
本發(fā)明可以通過(guò)制備一種在體外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒(virion)達(dá)到本發(fā)明的上述及其它目的，所述制備包括(a)將(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，和(ii)包含編碼泡沫病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸的泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體，導(dǎo)入細(xì)胞，和(b)培養(yǎng)該細(xì)胞，從而產(chǎn)生至少含有泡沫病毒包膜蛋白一個(gè)片段的嗜肝DNA病毒毒粒，其中病毒毒粒在體外具有感染性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1-HBV指示性基因病毒載體圖2-HBV抗性試驗(yàn)載體圖3-HBV及HFV包膜蛋白的組構(gòu)發(fā)明詳述本發(fā)明提供了制備具體外感染性的嗜肝DNA病毒毒粒的方法，該方法包括(a)將(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，和(ii)包含編碼至少泡沫病毒包膜蛋白一個(gè)片段的核酸的泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，和(b)培養(yǎng)該細(xì)胞，從而產(chǎn)生至少含有泡沫病毒包膜蛋白一個(gè)片段的嗜肝DNA病毒，其中該病毒毒粒在體外具有感染性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體缺失編碼嗜肝DNA病毒包膜蛋白的核酸。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體包含來(lái)源于嗜肝DNA病毒基因組的至少一個(gè)基因，所述基因組選自以下基因組土撥鼠肝炎病毒(WHV)基因組、黃鼠肝炎病毒(GSHV)基因組、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)基因組、雪雁肝炎病毒(SGHV)基因組及人乙型肝炎病毒(HBV)基因組。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體包含來(lái)源于人乙型肝炎病毒(HBV)基因組的一個(gè)基因。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體還包含一外源調(diào)控元件。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中外源調(diào)控元件為人巨細(xì)胞病毒即早基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV-IE)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體包含來(lái)源于泡沫病毒基因組的基因的至少一個(gè)片段，所述基因組選自以下基因組猿猴(siman)泡沫病毒(SFV)基因組、貓泡沫病毒(FFV)基因組、牛泡沫病毒(BFV)基因組、海獅泡沫病毒(SLFV)基因組、倉(cāng)鼠泡沫病毒(HaFV)基因組和人泡沫病毒(HFV)基因組。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中所述基因編碼包膜蛋白或其片段。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體包含來(lái)源于人泡沫病毒(HFV)基因組的一個(gè)基因或其片段。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中來(lái)源于人泡沫病毒(HFV)基因組的基因或基因片段編碼gp130env包膜基因產(chǎn)物或其片段。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)肝細(xì)胞(hepacyte)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了上述方法，本發(fā)明提供了上述方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人肝癌(hepatoma)細(xì)胞。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中人肝癌細(xì)胞為HepG2或Huh7細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在體外具有感染性的嗜肝DNA病毒顆粒，它包含泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的至少一個(gè)片段。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒是分離的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種嗜肝DNA病毒毒粒，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒選自以下病毒猿猴泡沫病毒(SFV)、貓泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海獅泡沫病毒(SLFV)、倉(cāng)鼠(hampster)泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒包含嵌合包膜蛋白，所述嵌合包膜蛋白主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒還包含從嗜肝DNA病毒感染者分離的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種嗜肝DNA病毒毒粒，其中從嗜肝DNA病毒感染者分離的核酸編碼一種逆轉(zhuǎn)錄酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種嗜肝DNA病毒毒粒，嗜肝DNA病毒顆粒還包含了指示性核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞，其中人類(lèi)細(xì)胞為人腎細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞，其中人類(lèi)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)定抗嗜肝DNA病毒藥物的敏感性的方法。該方法包括(a)向第一細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，(ii)編碼泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸，和(iii)指示性核酸；(b)培養(yǎng)步驟(a)得到的第一細(xì)胞以產(chǎn)生嗜肝DNA病毒毒粒；(c)將步驟(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒與第二細(xì)胞混合，其中將抗嗜肝DNA病毒藥物加入第一或第二細(xì)胞中，或加入第一和第二細(xì)胞中。
(d)測(cè)定第二細(xì)胞中指示性核酸產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)的量，其中可檢測(cè)信號(hào)的量取決于嗜肝DNA病毒毒粒對(duì)第二細(xì)胞的感染；和(e)將步驟(d)中測(cè)定到的信號(hào)量與無(wú)藥物存在時(shí)測(cè)得的信號(hào)量相比較，其中在藥物存在的情況下，如果信號(hào)量下降說(shuō)明對(duì)藥物敏感，如果信號(hào)量無(wú)變化或上升則說(shuō)明對(duì)藥物產(chǎn)生抗性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中步驟(a)的嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體還包含了來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染的病人的核酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因中至少一個(gè)片段。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中基因是HBV P基因、HCV C基因、HBV X基因或HBV S基因。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸編碼逆轉(zhuǎn)錄酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中第二細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中第二細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)肝細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中人肝癌細(xì)胞為HepG2或Huh7細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒選自以下病毒猿猴泡沫病毒(SFV)、貓泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海獅泡沫病毒(SLFV)、倉(cāng)鼠泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中步驟(a)(i)的核酸編碼gp130env包膜蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中(a)(i)的核酸編碼嵌合的包膜蛋白，其主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述的敏感性測(cè)定方法，其中第二細(xì)胞在其表面表達(dá)一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可與人泡沫病毒包膜蛋白結(jié)合。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)定來(lái)源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的復(fù)制能力的方法，該方法包括(a)向第一細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，(ii)編碼泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸，和(iii)指示性核酸；(b)培養(yǎng)步驟(a)得到的細(xì)胞以產(chǎn)生嗜肝DNA病毒毒粒；(c)將步驟(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒與第二細(xì)胞混合；(d)測(cè)定第二細(xì)胞中指示性核酸產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)的量，其中可檢測(cè)到的信號(hào)量取決于嗜肝DNA病毒毒粒對(duì)第二細(xì)胞的感染；(e)將步驟(d)的測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化(normalizing)；和(f)將步驟(e)標(biāo)準(zhǔn)化后的測(cè)量值與采用對(duì)照參比嗜肝DNA病毒經(jīng)步驟(a)至(d)而測(cè)得的信號(hào)量相比較，其中與對(duì)照組相比，信號(hào)量上升意味著來(lái)源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的復(fù)制力增強(qiáng)，信號(hào)量降低意味著來(lái)源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的復(fù)制力下降。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)定抗嗜肝DNA病毒藥物敏感性的方法，該方法包括(a)向第一細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，(ii)編碼泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸，和(iii)指示性核酸；(b)培養(yǎng)步驟(a)得到的細(xì)胞；
(c)將細(xì)胞與抗嗜肝DNA病毒藥物接觸；(d)測(cè)定細(xì)胞中指示性核酸產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)的量；和(e)將步驟(d)所測(cè)得的信號(hào)量與不存在藥物的條件下測(cè)得的信號(hào)量相比較，其中藥物存在時(shí)信號(hào)量降低說(shuō)明對(duì)藥物敏感，信號(hào)量無(wú)變化或升高則說(shuō)明對(duì)藥物有抗性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中步驟(a)中的嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體還包括來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中來(lái)源于受嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因的至少一個(gè)片段。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中基因?yàn)镠BVP基因或HBV C基因。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定嗜肝DNA病毒中與抗嗜肝DNA病毒藥物抗性相關(guān)的突變的方法，該方法包括(a)在應(yīng)用抗嗜肝DNA病毒藥物前對(duì)嗜肝DNA病毒核酸進(jìn)行測(cè)序；(b)依據(jù)第50項(xiàng)權(quán)利要求的方法測(cè)定步驟(a)中測(cè)序的嗜肝DNA病毒對(duì)藥物的敏感性；(c)將該嗜肝DNA病毒與藥物相接觸，使步驟(b)中測(cè)量的嗜肝DNA病毒對(duì)藥物的敏感性降低；(d)將步驟(a)測(cè)定的序列與步驟(c)中嗜肝DNA病毒接觸藥物后所測(cè)定的序列相比較，以鑒定嗜肝DNA病毒核酸中與抗嗜肝DNA病毒藥物抗性相關(guān)的突變。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法，其中測(cè)量步驟(b)包括使用雙細(xì)胞分析法測(cè)定經(jīng)步驟(a)測(cè)序的嗜肝DNA病毒對(duì)抗嗜肝DNA病毒藥物的敏感性。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)利用來(lái)源于人泡沫病毒(HFV)的包膜蛋白使HBV病毒毒粒偽型化(pseudotyping)來(lái)制備感染性人乙型病毒(HBV)顆粒的方法。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了一種通過(guò)利用來(lái)源于HBV和HFV包膜蛋白中特定功能結(jié)構(gòu)域的嵌合包膜蛋白進(jìn)行偽型化來(lái)制備感染性HBV顆粒的方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案包括利用人泡沫病毒包膜蛋白，或來(lái)源于嗜肝DNA病毒和人泡沫病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制備其他各種嗜肝DNA病毒。舉例來(lái)說(shuō)，其他嗜肝DNA病毒包括土撥鼠肝炎病毒(WHV)、黃鼠肝炎病毒(GSHV)、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)、雪雁肝炎病毒(SGHV)及人乙型肝炎病毒(HBV)和其他從貓、嚙齒類(lèi)、有袋動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)分離出來(lái)的文獻(xiàn)資料不多的嗜肝DNA病毒，但并不僅限于這些。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括利用各種其他泡沫病毒包膜蛋白，或來(lái)源于嗜肝DNA病毒和各種其他泡沫病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制備嗜肝DNA病毒的方法。所述其他泡沫病毒包括猿猴泡沫病毒(SFV)、貓泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海獅泡沫病毒(SLFV)、倉(cāng)鼠泡沫病毒(HaFV)，但并不僅限于這些。
本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括利用逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白，或來(lái)源于嗜肝DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制備HBV或其他各種嗜肝DNA病毒的方法。舉例來(lái)說(shuō)，其他逆轉(zhuǎn)錄病毒包括但不限于下列病毒(i)B型逆轉(zhuǎn)錄病毒(鼠乳腺瘤病毒)；(ii)哺乳類(lèi)C型逆轉(zhuǎn)錄病毒(親嗜性鼠白血病病毒、雙嗜性鼠白血病病毒、長(zhǎng)臂猿白血病病毒、貓白血病病毒、B亞群)；(iii)鳥(niǎo)肉瘤/白血性增生(leukosis)逆轉(zhuǎn)錄病毒(A、B/E、D亞群)；(iv)D型逆轉(zhuǎn)錄病毒(Mason-Pfizer猴病毒、猿猴逆轉(zhuǎn)錄病毒1和2)；(v)人T細(xì)胞白血病病毒(I型和II型)和牛白血病病毒；(vi)慢病毒(1型及2型人類(lèi)免疫缺陷病毒、馬感染性貧血病毒、冰島病毒(maedi virus)/綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎病毒)；(vii)魚(yú)逆轉(zhuǎn)錄病毒(大眼梭鱸魚(yú)白血病及肉瘤病毒、黑魚(yú)逆轉(zhuǎn)錄病毒)；(viii)果蠅逆轉(zhuǎn)錄病毒(gypsy)本發(fā)明的其他實(shí)施方案包括利用來(lái)源于其他各種包膜病毒的包膜蛋白或來(lái)源于嗜肝DNA病毒和其他各種包膜病毒包膜蛋白的特定功能域的嵌合包膜蛋白制備嗜肝DNA病毒的方法。舉例來(lái)說(shuō)，其他具包膜的病毒包括披膜病毒、黃病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、絲狀病毒、副粘液病毒、正病毒(orthoviruses)、布尼亞病毒、沙粒病毒、皰疹病毒、痘病毒、虹色病毒和輪狀病毒，但并不限于這些。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)定HBV和其他各種嗜肝DNA病毒復(fù)制能力的方法。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法以測(cè)定HBV和其他各種嗜肝DNA病毒對(duì)抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶及其他嗜肝DNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的藥物的敏感性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定HBV逆轉(zhuǎn)錄酶及其他嗜肝DNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶的新的和/或另外的抑制劑的方法。
本發(fā)明中測(cè)定HBV復(fù)制能力的手段(means)和方法可應(yīng)用于鑒定新型HBV復(fù)制抑制劑，其中HBV復(fù)制包括但不局限于抑制cccDNA形成、毒粒裝配及從細(xì)胞中排出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定HBV P基因中突變的方法，所述突變使HBV對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的敏感性發(fā)生變化。
本發(fā)明中用于鑒定改變對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑敏感性的突變的手段和方法可適用于HBV復(fù)制的其他步驟，包括但不局限于cccDNA形成、毒粒裝配及從細(xì)胞中排出。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了鑒定HBV P基因中改變HBV復(fù)制能力或“適合度(fitness)”的突變的一種方法。
本發(fā)明用于鑒定HBV P基因中改變復(fù)制能力的突變的方法可用于鑒定其他HBV基因(核心(C)，表面(S)和反式激活(X))中改變HBV復(fù)制能力的突變。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)測(cè)定HBV藥物敏感性來(lái)指導(dǎo)HBV感染患者抗病毒治療的方法在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)測(cè)定HBV復(fù)制能力來(lái)指導(dǎo)治療抗HBV藥物治療失敗的患者的方法。
用來(lái)源于泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白制備偽型化的嗜肝DNA病毒毒粒，就可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中的實(shí)施方案。
泡沫病毒(foamy virus或spumavirus)的復(fù)制嗜肝DNA病毒(包括HBV)和逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制途徑有些相似，二者均包裝基因組長(zhǎng)度的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)生成的雙鏈(ds)DNA作為病毒基因在受感染細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄模板。泡沫病毒(亦稱(chēng)為泡沫病毒)是逆轉(zhuǎn)錄病毒種中一個(gè)非典型的逆轉(zhuǎn)錄病毒屬，其復(fù)制途徑的多個(gè)方面都與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒屬不同。值得注意的是，泡沫病毒復(fù)制中這些不同尋常的方面與包括HBV在內(nèi)的嗜肝DNA病毒的復(fù)制特征非常相似，這也反應(yīng)了嗜肝DNA病毒和泡沫病毒間共同的進(jìn)化性聯(lián)系。據(jù)報(bào)道泡沫病毒可感染來(lái)源于多種哺乳動(dòng)物及鳥(niǎo)類(lèi)的多種細(xì)胞，提示泡沫病毒受體是一種普遍表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。
嗜肝DNA病毒和泡沫病毒復(fù)制間的相似性嗜肝DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒在復(fù)制過(guò)程中均利用RT。在嗜肝DNA病毒的復(fù)制過(guò)程中，RT將包裝好的單鏈前基因組RNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈基因組DNA的轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)生于病毒顆粒進(jìn)入新的宿主細(xì)胞之前。相較之下，在逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制過(guò)程中，逆轉(zhuǎn)錄步驟發(fā)生于病毒進(jìn)入細(xì)胞之后。
最近的研究表明，和其它所有已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，約有10％～15％泡沫病毒顆粒包含基因組長(zhǎng)度的雙鏈DNA(Yu等，1996，“泡沫病毒的復(fù)制——一種不同于嗜肝DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制途徑”，Science2711579-1582；Yu等，1999，“有證據(jù)證明人泡沫病毒基因組是DNA”，J.Virol.701250-1254)。在此類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒中，病毒顆粒感染新細(xì)胞前明顯有逆轉(zhuǎn)錄發(fā)生，因而與嗜肝DNA病毒復(fù)制過(guò)程中的RT步驟類(lèi)似。
在新感染的細(xì)胞中，嗜肝DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒均產(chǎn)生大量的病毒核心蛋白。對(duì)于嗜肝DNA病毒來(lái)說(shuō)核心蛋白為C蛋白，而對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)說(shuō)，核心蛋白包括了含基質(zhì)(MA)、衣殼(CA)和核殼(NC)等蛋白功能域的Gag多聚蛋白。嗜肝DNA病毒和泡沫病毒的核心蛋白瞬時(shí)定位到細(xì)胞核。而其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的從頭合成的核心蛋白(Gag多聚蛋白)僅存在于受感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)。除了泡沫病毒外，所有逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag多聚蛋白的NC域都有一高度保守的半胱氨酸-組氨酸(Cys-His)基序，該基序?qū)τ贜C與逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA的結(jié)合及包裝是必需的(Berkowitz等，1996，RNA的包裝，Curr.Top.Microbiol.Immunlo.214177-218)。泡沫病毒Gag多聚蛋白的NC域缺乏Cys-His基序，但有數(shù)個(gè)富含甘氨酸和精氨酸的區(qū)域(Gly-Arg)(Schliephake等，1994，泡沫病毒前Gag蛋白的核定位，J.Virol.684946-4954.。Yu等，1996，人泡沫病毒Gag蛋白的羧基端包含可分離的核酸結(jié)合域和核轉(zhuǎn)運(yùn)域，J.Virol.708255-8262)。其中一個(gè)區(qū)域具有充當(dāng)核定位信號(hào)的功能。嗜肝DNA病毒的核心蛋白(C蛋白)中存在相似的Aly-Arg基序，它可能在RNA的包裝和C蛋白的核定位中發(fā)揮重要作用(HattonT等，1992，乙型肝炎病毒衣殼蛋白的RNA及DNA結(jié)合活性一種測(cè)定其在病毒復(fù)制中作用的模型，J.Virol.665232-5241.Nassal，M，1992，乙型肝炎核心蛋白中富含精氨酸域?qū)τ趯⒒蚪M包入衣殼和有效的病毒正鏈DNA合成是必需的，但對(duì)于病毒的裝配并非必需，J.Virol.664107-4116)。
除了泡沫病毒外，所有已知逆轉(zhuǎn)錄病毒都以Gag-Pol多聚蛋白的形式表達(dá)pol基因(RT和整合酶(IN)蛋白)。(Jacks，T，1990.逆轉(zhuǎn)錄病毒基因表達(dá)中的翻譯抑制和逆轉(zhuǎn)座子，p.93-124；In R.Swanstrom和P.K.Vogt(ed)，逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制策略，Springer-Veriag，Berlin，Germany.)。相較之下，泡沫病毒以與Gag多聚蛋白分離的形式表達(dá)其Pol蛋白，這一點(diǎn)與嗜肝DNA病毒的Pol表達(dá)類(lèi)似(YU S.F.等，1996，人泡沫病毒的復(fù)制——一種與逆轉(zhuǎn)錄病毒及嗜肝DNA病毒不同的途徑，Science 2711579-1582；Lochelt，M.等，1991，含全長(zhǎng)人泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的感染性DNA克隆的構(gòu)建和bel-1基因的誘變，Virology 18443-54；YU S.F.等，1996，人泡沫病毒對(duì)造血細(xì)胞的有效持續(xù)性感染，J.Virol.，vol.701250-1254)。
泡沫病毒顆粒的形成只在胞漿內(nèi)發(fā)生，但隨病毒不同其精確的定位可能不同。除泡沫病毒之外，所有已知逆轉(zhuǎn)錄病毒從細(xì)胞表面出芽，從質(zhì)膜獲得外層包膜。相較之下，泡沫病毒和嗜肝DNA病毒從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(ER)出芽，從細(xì)胞內(nèi)區(qū)室獲得包膜。后者可能解釋了為什么在很大程度上嗜肝DNA病毒和泡沫病毒均與細(xì)胞相連，而其他逆轉(zhuǎn)錄病毒易于從細(xì)胞脫離出來(lái)。Zeraba等，1998，人泡沫病毒Gag前體中p3Gag域的羧末端為病毒高效感染所必需，Virology 2477-13；Yu S.F.等，1993，利用新型定量方法分析人泡沫病毒中bel和bet開(kāi)放閱讀框的作用，J.Virol.676618-6624。
在顆粒形成之前及形成期間，嗜肝DNA病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒均在宿主細(xì)胞特定的區(qū)室內(nèi)富集特定的包膜蛋白，該區(qū)室為病毒包膜外膜的來(lái)源。對(duì)于嗜肝DNA病毒來(lái)說(shuō)，這些包膜蛋白為由S基因(大、中、小S基因)編碼的三表面蛋白，對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒來(lái)說(shuō)則是由包膜基因(env)編碼的表面蛋白(SU)和跨膜蛋白(TM)。據(jù)報(bào)道，嗜肝DNA病毒的S蛋白和泡沫病毒TM蛋白含有將其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)室的分選基序。Goepfer P.A.等，1997，將人泡沫病毒多聚蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分選基序，J.Virol.71778-784；T.Kamimura等和P.Roingeard，1990。除了泡沫病毒，在已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒中，即使不是全部，也有許多病毒env蛋白的表達(dá)對(duì)于病毒毒粒從細(xì)胞排出來(lái)說(shuō)可有可無(wú)(雖然env缺失的顆粒無(wú)感染性)。相較之下，感染性的泡沫病毒顆粒從細(xì)胞排出依賴(lài)于env基因的表達(dá)(4和22)。類(lèi)似地，感染性嗜肝DNA病毒毒粒的裝配依賴(lài)于S基因產(chǎn)物的表達(dá)。更為特別的說(shuō)，出芽需要大S蛋白的適當(dāng)表達(dá)。表中Bruss & Ganum，1991。
泡沫病毒和嗜肝DNA病毒共有的特征在表1中總結(jié)列出。
至于人乙型肝炎病毒，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞而產(chǎn)生的HBV顆粒在體內(nèi)具有感染性，但在體外無(wú)感染性。感染受阻可能是因?yàn)榧?xì)胞表面缺乏合適的HBV受體。相較之下，人泡沫病毒(HFV)可感染的宿主范圍廣泛，可感染大量不同的細(xì)胞系。說(shuō)明HFV受體可能是一種普遍表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白。
HBV和HFV的復(fù)制途徑在顆粒的裝配和出芽方面具有一些相似的特征。本發(fā)明介紹了利用HBV之類(lèi)嗜肝DNA病毒和HFV之類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒之間復(fù)制途徑的相似處，來(lái)繞過(guò)嗜肝DNA病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中感染性受限這一障礙的手段和方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可用HFV包膜蛋白或包含HBV和HFV包膜蛋白特定功能域的嵌合蛋白產(chǎn)生HBV顆粒，使之能夠利用人泡沫病毒受體進(jìn)入大量不同類(lèi)型的細(xì)胞。
本文所用的“嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體”是指包含嗜肝DNA病毒基因組至少一個(gè)片段、導(dǎo)入合適的細(xì)胞系之后能夠瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄嗜肝DNA病毒RNA并產(chǎn)生嗜肝DNA病毒蛋白的載體。
“泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體”是指包含泡沫逆轉(zhuǎn)錄包膜基因至少一個(gè)片段、并在導(dǎo)入合適的細(xì)胞系之后可瞬時(shí)產(chǎn)生泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的載體。
“指示性核酸”是指這種核酸能夠直接產(chǎn)生或通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)生可測(cè)定或可觀(guān)測(cè)特征或可檢測(cè)信號(hào)，比如可檢測(cè)波長(zhǎng)的顏色或光，或DNA或RNA充當(dāng)指示劑時(shí)特定DNA或RNA結(jié)構(gòu)的改變或產(chǎn)生。首選的指示性基因?qū)嵗蔷幋aβ-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因；來(lái)源于諸如photonis pyralis(熒火蟲(chóng))和Renilla reniformis(三色堇)的、編碼熒光素酶的1uc基因；編碼堿性磷酸酶、綠色熒光蛋白的大腸桿菌phoA基因及編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌性CAT基因。其他首選的指示性基因?qū)嵗且子谟梅派涿庖邷y(cè)定法(RIA)、熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)之類(lèi)方法測(cè)定的分泌蛋白或細(xì)胞表面蛋白，舉例來(lái)說(shuō)包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞表面抗原(如分別為生長(zhǎng)激素、IL-2、CD4)?！爸甘拘曰颉边€包括一個(gè)選擇性基因，也稱(chēng)為選擇性標(biāo)記物。舉例來(lái)說(shuō)，適當(dāng)?shù)幕虿溉閯?dòng)物細(xì)胞選擇性標(biāo)記物是二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、潮霉素、新霉素、zeocin或大腸桿菌gpt。對(duì)于上述的指示性基因?qū)嵗齺?lái)說(shuō)，指示性基因與病人來(lái)源的片段是獨(dú)立的，即不同的、單獨(dú)的基因。在某些情況下病人來(lái)源的片段也用作指示性基因。在病人來(lái)源的片段與用作抗病毒靶點(diǎn)的多個(gè)病毒基因相對(duì)應(yīng)的實(shí)施方案中，其中一個(gè)基因可以用作指示性基因。
正如美國(guó)專(zhuān)利NO.6,242,187所述，指示性核酸或指示性基因可能具有一定功能，也可能無(wú)功能。
“嗜肝DNA病毒指示性載體”或“指示性基因病毒載體”是指具有嗜肝DNA病毒基因組元件和一個(gè)指示性基因如熒火蟲(chóng)熒光素酶，并能瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄RNA的DNA載體。RNA包含了將RNA病毒裝配入嗜肝DNA病毒毒粒、利用嗜肝DNA病毒聚合酶將RNA轉(zhuǎn)錄物逆轉(zhuǎn)錄和表達(dá)指示性基因所需的信號(hào)/元件。
“包裝宿主細(xì)胞”或“第一細(xì)胞”是指支持嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體和泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞。
“靶細(xì)胞”或“第二細(xì)胞”是指表達(dá)泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜受體的細(xì)胞，由泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒偽型化的嗜肝DNA病毒毒粒一旦通過(guò)泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒受體進(jìn)入該細(xì)胞，該細(xì)胞即能支持嗜肝DNA病毒的復(fù)制?！坝膳菽孓D(zhuǎn)錄病毒偽型化的嗜肝DNA病毒毒?！敝赴幸粋€(gè)或多個(gè)來(lái)源于泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒的蛋白質(zhì)的嗜肝DNA病毒毒粒。
本文所用的“病人來(lái)源的片段”包括來(lái)源于人和各種動(dòng)物種屬的核酸片段。這些種屬包括但不局限于黑猩猩、馬、牛、貓和狗。
可利用數(shù)種可替換克隆技術(shù)中任何一種技術(shù)將病人來(lái)源的片段插入上述的載體中，如嗜肝DNA病毒表達(dá)載體。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)將II類(lèi)限制性位點(diǎn)同時(shí)引入質(zhì)粒骨架和病人來(lái)源的片段、或通過(guò)尿嘧啶DNA糖基化酶引物克隆、或利用重組方法或無(wú)縫克隆等方法所做的克隆。
可使用任何分子克隆或基因擴(kuò)增方法獲得病人來(lái)源的片段。如下所述，在欲引入嗜肝DNA病毒表達(dá)載體之類(lèi)載體的病人來(lái)源片段末端引入病人序列接頭位點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行修飾。舉例來(lái)說(shuō)，在諸如PCR之類(lèi)的基因擴(kuò)增方法中，在PCR反應(yīng)中所用引物的末端引入與病人序列接頭位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的限制性位點(diǎn)。類(lèi)似地，在諸如cDNA克隆之類(lèi)的分子克隆方法中，將所述的限制性位點(diǎn)引入到用于合成第一鏈或第二鏈cDNA的引物末端；或?qū)寺』蛭纯寺〉腄NA進(jìn)行引物-修復(fù)之類(lèi)的方法中，將所述限制性位點(diǎn)引入修復(fù)反應(yīng)所用引物的末端。病人序列接頭位點(diǎn)也可以是病人來(lái)源片段和嗜肝DNA病毒表達(dá)載體間進(jìn)行同源重組或互補(bǔ)退火的區(qū)域。設(shè)計(jì)病人序列接頭位點(diǎn)和引物是為了提高病人來(lái)源片段的表現(xiàn)度(representation)。設(shè)計(jì)有病人序列接頭位點(diǎn)的多組載體可以提供單個(gè)載體不能提供的、病人來(lái)源片段的表現(xiàn)度。
本文所用的“復(fù)制能力”在這里定義為病毒復(fù)制情況的量度，亦稱(chēng)之為病毒適合度。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)評(píng)價(jià)病毒復(fù)制一輪的能力來(lái)測(cè)定復(fù)制能力。
本文所用的“對(duì)照抗性試驗(yàn)載體”定義為包含一段標(biāo)準(zhǔn)肝DNA病毒(如HBVayw)序列和一個(gè)指示性基因的抗性試驗(yàn)載體。
本文所用的“標(biāo)準(zhǔn)化”定義為相對(duì)于引發(fā)指示性基因表達(dá)的病毒顆粒的數(shù)目，對(duì)所測(cè)定的指示性基因表達(dá)量加以標(biāo)準(zhǔn)化。例如，將測(cè)得的熒光素酶活性值除以感染時(shí)測(cè)得的病毒顆粒數(shù)來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
“質(zhì)粒”和“載體”用小寫(xiě)p后接字母和/或數(shù)字來(lái)命名。這里起始的質(zhì)粒可以從不受限制的商業(yè)途徑、公共途徑獲得，或可依據(jù)已發(fā)表的方法從現(xiàn)有質(zhì)粒構(gòu)建。另外，與那些所描述質(zhì)粒等效的質(zhì)粒在該技術(shù)領(lǐng)域都是已知的，對(duì)于普通的技術(shù)人員是直觀(guān)的。
本發(fā)明使用該技術(shù)領(lǐng)域熟知的常規(guī)連接技術(shù)及限制性酶切技術(shù)構(gòu)建載體(參見(jiàn)Ausubel等，1987，當(dāng)代分子生物學(xué)操作規(guī)程，WileyInterscience；或Maniatis等，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，Cold ApringHarbor Laboratory)。對(duì)提取的質(zhì)粒、DNA序列或人工合成的寡聚核苷酸依所需的形式進(jìn)行切割、加尾和連接。可以通過(guò)DNA測(cè)序分析對(duì)所有引入合成DNA的DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)(Sanger等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci，74，5463-5467)。
產(chǎn)生具有來(lái)源于泡沫病毒的包膜蛋白的、具有感染性的偽型化嗜肝DNA病毒毒粒的方法的建立，導(dǎo)致了使用體外細(xì)胞分析嗜肝DNA病毒的方法的建立。這些分析方法包括但不局限于藥物敏感性及抗性試驗(yàn)、病毒適合度試驗(yàn)和鑒定與藥物抗性相關(guān)的嗜肝DNA病毒突變的基因型分析。
下文提供的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明和解釋?zhuān)@些實(shí)施例對(duì)本發(fā)明不作任何限制。
實(shí)施例1利用來(lái)源于人泡沫病毒的包膜蛋白偽型化乙型肝炎病毒本實(shí)施例提供了產(chǎn)生可感染原代培養(yǎng)物和已建立細(xì)胞系HBV病毒毒粒的手段和方法，其中這些細(xì)胞表達(dá)人泡沫病毒(HFV)受體。此處提供的手段和方法描述了將HFV包膜蛋白引入HBV外膜，及感染可受HFV感染——即細(xì)胞表面表達(dá)有HFV受體的靶細(xì)胞的過(guò)程。以此法產(chǎn)生的HBV顆粒通與HFV受體結(jié)合并與之相互作用進(jìn)入細(xì)胞，從而繞過(guò)了HBV的正常進(jìn)入途徑，據(jù)認(rèn)為該途徑涉及到HBV表面蛋白(S)和宿主細(xì)胞上一種仍未得以鑒定的HBV受體。普遍認(rèn)為HBV不能感染培養(yǎng)細(xì)胞很可能是由于粘附和/或侵入等步驟受阻。本實(shí)施例中利用HFV包膜蛋白偽型化產(chǎn)生感染性HBV的手段和方法適用于其他嗜肝DNA病毒，其中一些可以充當(dāng)HBV疾病的有用動(dòng)物模型，如鴨嗜肝DNA病毒、土撥鼠嗜肝DNA病毒。另外，實(shí)施例中利用HFV包膜蛋白偽型化產(chǎn)生感染性HBV的手段和方法適用于利用其他泡沫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和各種具包膜病毒的包膜蛋白將HBV和其他嗜肝DNA病毒偽型化。
用于生成HFV包膜蛋白偽型化的HBV顆粒并成功感染所培養(yǎng)細(xì)胞的系統(tǒng)涉及到下列組分(i)HBV基因組表達(dá)載體包含HBV基因組的DNA載體，該載體在導(dǎo)入合適的細(xì)胞系后能瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄HBV RNA并產(chǎn)生HBV蛋白。
(ii)HBV指示性載體包含HBV基因組元件和一個(gè)指示性基因如熒火蟲(chóng)熒光素酶基因，并能完成RNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄的DNA載體。該RNA包含將RNA裝配入HBV病毒毒粒、利用HBV聚合酶將RNA轉(zhuǎn)錄物逆轉(zhuǎn)錄及表達(dá)指示性基因所必需的信號(hào)/元件。
(iii)HFV包膜表達(dá)載體包含HFV包膜基因的DNA載體，在導(dǎo)入合適的細(xì)胞系后該載體能瞬時(shí)產(chǎn)生HFV包膜蛋白。
(iv)包裝宿主細(xì)胞或第一細(xì)胞能支持HB V基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞。
(v)靶細(xì)胞或第二細(xì)胞表達(dá)HFV包膜受體的細(xì)胞，一旦經(jīng)HFV偽型化的HBV顆粒進(jìn)入，該細(xì)胞即能支持HBV的復(fù)制。
HBV基因組表達(dá)載體在導(dǎo)入包裝宿主細(xì)胞后能產(chǎn)生HBV顆粒。HBV調(diào)控元件、來(lái)源于其他物種的外源調(diào)控元件如人巨細(xì)胞病毒即早基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV-IE)可以調(diào)控HBV的基因表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用人巨細(xì)胞病毒即早基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV-IE)調(diào)控HBV基因組的表達(dá)。HBV基因組表達(dá)載體也可含有指示性基因，如熒火蟲(chóng)熒光素酶基因。在這種情況下，該載體稱(chēng)為“HBV指示性基因病毒載體”或更一般的“指示性基因病毒載體”。指示性基因?yàn)槔盟拗靼b細(xì)胞中所產(chǎn)生病毒感染后靶細(xì)胞感染性的測(cè)定提供了一種敏感、便利的機(jī)制。靶細(xì)胞中指示性基因的產(chǎn)物量即熒光素酶活性，是HBV完成單輪復(fù)制的一個(gè)直接指標(biāo)。通過(guò)以各種其他來(lái)源的HBV基因序列(如P基因逆轉(zhuǎn)錄酶序列)置換HBV指示性基因病毒載體中特定的HBV基因序列的方法，HBV指示性基因病毒載體可用于構(gòu)建“HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體”。這些來(lái)源可以包括攜帶有藥物敏感性或抗性HBV病毒株(如對(duì)拉米夫定耐藥或敏感的病毒，[3TC])的病人樣品和具明確RT序列的HBV分子克隆，其中該RT序列包含或缺失與藥物抗性相關(guān)的突變(M550V)。
HFV包膜表達(dá)載體包含HFV包膜基因區(qū)，用于產(chǎn)生HFV包膜基因產(chǎn)物(gp130env)。gp130env是一種多聚蛋白，它在細(xì)胞質(zhì)的區(qū)室內(nèi)被細(xì)胞的“弗林樣”蛋白酶切割為成熟的包膜表面部分(gp80SU)和跨膜部分(gp48TM)。SU和TM共同在HFV的識(shí)別及進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中起作用。將HFV包膜表達(dá)載體隨HBV基因組載體一同引入宿主包裝細(xì)胞導(dǎo)致病毒外膜中含HFV包膜蛋白的HBV病毒毒粒(偽型化的病毒顆粒)的產(chǎn)生。包括但不限于CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或HFV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的各種調(diào)控元件可以調(diào)控HFV包膜在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將HFV包膜基因區(qū)插入一含CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的表達(dá)載體(如pCXAS，Petropoulos等，1999，完整引用)中完成HFV包膜表達(dá)載體的裝配。
包裝宿主細(xì)胞可包括大量各種人類(lèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如人胚腎細(xì)胞(HEK293)和人肝癌細(xì)胞(HepG2，Huh7)，但并不局限于這些。理想的包裝宿主細(xì)胞在引入HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體DNA后可瞬時(shí)產(chǎn)生大量經(jīng)HFV偽型化的HBV病毒毒粒。
靶細(xì)胞可包括原代細(xì)胞和細(xì)胞系，更特別的說(shuō)包括原代肝細(xì)胞及肝源細(xì)胞系，包括但并不僅限于HepG2和Huh7細(xì)胞(ref)。理想的靶細(xì)胞表面表達(dá)HFV受體，能支持HBV復(fù)制過(guò)程中病毒粘附和侵入的下游步驟。
為了產(chǎn)生感染性的HBV病毒顆粒，將HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體共同導(dǎo)入宿主包裝細(xì)胞。數(shù)天后，收集宿主包裝細(xì)胞產(chǎn)生的HFV偽型化HBV顆粒，接種宿主細(xì)胞。接種數(shù)天后，測(cè)定靶細(xì)胞的感染性?？衫冒ǖ幌抻诹姿徕}-DNA沉淀法、電穿孔法的各種非常完善的操作方法實(shí)現(xiàn)HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體的導(dǎo)入?？衫冒ǖ幌抻跈z測(cè)HBV抗原(基于抗體的Western印跡及ELISA檢測(cè))、HBV核酸(如PCR、RT-PCR、Northern印跡及Southem印跡檢測(cè))的方法完成HBV對(duì)靶細(xì)胞的感染性測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體。HBV基因組表達(dá)載體含有一個(gè)熒光素酶指示性基因。包裝宿主細(xì)胞為HEK293。利用磷酸鈣-DNA沉淀法將HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體導(dǎo)入包裝宿主細(xì)胞。每種載體DNA制劑的用量為5～10微克。轉(zhuǎn)染后，包裝細(xì)胞孵育24～72小時(shí)。收集并凍融細(xì)胞及培養(yǎng)基以便釋放與細(xì)胞相聯(lián)的病毒毒粒。將培養(yǎng)基離心并過(guò)濾，濾液作為感染宿主靶細(xì)胞的HFV偽型化HBV原種。靶細(xì)胞為HepaG2或Huh7。感染后48～72小時(shí)，裂解受感染的細(xì)胞，測(cè)定裂解液中的熒光素酶活性。受感染細(xì)胞中測(cè)得的熒光素酶活性值作為HBV完成單輪復(fù)制的直接指標(biāo)。
實(shí)施例2利用來(lái)源于人泡沫病毒和乙型肝炎病毒的嵌合包膜蛋白將乙型肝炎病毒偽型化本實(shí)施例提供了一種手段和方法以產(chǎn)生可感染原代培養(yǎng)細(xì)胞及表達(dá)人泡沫病毒(HFV)受體的已建立細(xì)胞系的HBV病毒毒粒。此處提供的手段和方法描述了將HBV/HFV嵌合包膜蛋白整合入HBV外膜，并感染可受HFV感染——即表面表達(dá)有HFV受體的靶細(xì)胞的過(guò)程。用此法產(chǎn)生的HBV病毒毒粒通過(guò)與HFV受體結(jié)合并相互作用侵入細(xì)胞，從而繞過(guò)了HBV的正常進(jìn)入途徑，據(jù)認(rèn)為該途徑涉及到HBV表面蛋白(S)和宿主細(xì)胞中一種仍未得以鑒定的HBV受體。普遍認(rèn)為HBV不能感染培養(yǎng)細(xì)胞很可能是由于粘附和/或侵入等步驟受阻?；诖藢?shí)例，很明顯的，利用HBV/HFV嵌合包膜蛋白偽型化方法產(chǎn)生感染性HBV的方法適用于偽型化其他含來(lái)源于其他泡沫病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和各種具包膜病毒的HBV和其他嗜肝DNA病毒。
用于生成HFV包膜蛋白偽型化的HBV顆粒和成功感染培養(yǎng)的細(xì)胞的系統(tǒng)涉及到了下列組分HBV基因組表達(dá)受體包含HBV基因組的DNA載體，該載體在導(dǎo)入合適的細(xì)胞系后能瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄HBV RNA，并產(chǎn)生HBV蛋白；HBV指示性基因病毒載體包含HBV基因組元件和一個(gè)指示性基因如熒火蟲(chóng)熒光素酶基因的DNA載體，并能完成RNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄。其中該RNA包含將RNA裝配入HBV病毒毒粒、利用HBV聚合酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄及表達(dá)指示性基因所必需的信號(hào)/元件；HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體含有編碼HBV/HFV嵌合包膜的基因序列的DNA載體，在導(dǎo)入合適的細(xì)胞系后能瞬時(shí)生成HBV/HFV嵌合包膜蛋白；包裝宿主細(xì)胞能支持HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞。
靶細(xì)胞表達(dá)HFV包膜受體的細(xì)胞，一旦HBV/HFV嵌合包膜偽型化的HBV顆粒進(jìn)入，該細(xì)胞支持HBV的復(fù)制。
在導(dǎo)入包裝宿主細(xì)胞后，HBV基因組表達(dá)載體能產(chǎn)生HBV顆粒。HBV調(diào)控元件、來(lái)源于其他物種的外源調(diào)控元件如人巨細(xì)胞病毒即早基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV-IE)可能調(diào)控HBV的基因表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用人巨細(xì)胞病毒即早基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV-IE)調(diào)控HBV基因組的表達(dá)。HBV基因組表達(dá)載體也可含有指示性基因，如熒火蟲(chóng)熒光素酶基因。在這種情況下，該載體稱(chēng)為“HBV指示性基因病毒載體”(圖1)。指示性基因?yàn)槔盟拗靼b細(xì)胞中所產(chǎn)生病毒感染后靶細(xì)胞感染性的測(cè)定提供了一種敏感、便利的機(jī)制。靶細(xì)胞中指示性基因的產(chǎn)物量即熒光素酶活性，是HBV完成單輪復(fù)制的一個(gè)直接指標(biāo)。HBV基因表達(dá)載體和/或HBV指示性基因病毒載體可用于“HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體”的構(gòu)建(參見(jiàn)圖2及后面的實(shí)例3)。通過(guò)用各種其他來(lái)源的HBV基因序列(如P基因逆轉(zhuǎn)錄酶序列)置換HBV指示性基因病毒載體中特定HBV基因序列的方法，HBV指示性基因病毒載體可用于構(gòu)建“HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體”。這些來(lái)源可以包括攜帶有藥物敏感性或抗性HBV病毒株(如對(duì)拉米夫定耐藥或敏感的病毒，[3TC])的病人樣品和具明確RT序列的HBV克隆，其中該RT序列包含或缺失與藥物抗性相關(guān)的突變(M550V)。
HFV包膜表達(dá)載體包含HFV包膜基因區(qū)，用于產(chǎn)生HFV包膜基因產(chǎn)物(gp130env)。gp130env是一種多聚蛋白，它在細(xì)胞質(zhì)的區(qū)室內(nèi)被細(xì)胞的“弗林樣”蛋白酶切割為成熟的包膜表面部分(gp80SU)和跨膜部分(gp48TM)。SU和TM共同在HFV的識(shí)別及進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中起作用。HBV的PreS1/PreS2/S基因隨所用啟動(dòng)子的不同編碼三種不同的蛋白。S、M和L這三種蛋白具有相同的C-端，在PreS1和/或PreS2的存在或缺失方面存在差異(參見(jiàn)圖3)。HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體包含編碼嵌合蛋白的序列，其中該嵌合蛋白包含來(lái)源于整個(gè)S域的氨基酸序列和附加的、與HFV SU(gp80)包膜基因區(qū)共價(jià)結(jié)合的PreS1和PreS2序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，HBV/HFV嵌合包膜包含融合在整個(gè)HBV S框架的HFV SU區(qū)、PreS2序列及缺失C-端的序列PreS1序列。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，HBV/HFV嵌合包膜包含融合在整個(gè)HBV S框架的HFV SU區(qū)，缺失N-端的PreS1序列及缺失C-端的PreS2序列。HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體用于產(chǎn)生HBV/HFV嵌合包膜基因產(chǎn)物。將HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體隨HBV基因組載體一同導(dǎo)入宿主包裝細(xì)胞導(dǎo)致病毒外膜中含HBV/HFV嵌合包膜蛋白的HBV病毒毒粒(偽型化的病毒顆粒)產(chǎn)生。包括但不限于CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子、或HFV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或HBV的S啟動(dòng)子的各種調(diào)控元件可以調(diào)控HFV包膜在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)將HBV/HFV嵌合包膜基因序列插入一含CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(如pCXAS，Petropoulos等，1999)的表達(dá)載體中完成HFV包膜表達(dá)載體的裝配。
包裝宿主細(xì)胞可包括大量不同的人類(lèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如人胚腎細(xì)胞(HEK293)和人肝癌細(xì)胞(HepG2，Huh7)，但并不局限于這些。理想的包裝宿主細(xì)胞在引入HBV基因組表達(dá)載體和HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體DNA后可瞬時(shí)產(chǎn)生大量經(jīng)HBV/HFV嵌合包膜蛋白偽型化的HBV病毒毒粒。
靶細(xì)胞可包括原代細(xì)胞和細(xì)胞系，更特別的說(shuō)包括原代肝細(xì)胞及肝源細(xì)胞系，包括但并不局限于HepG2和Huh7細(xì)胞。理想的靶宿主細(xì)胞表面表達(dá)HFV受體，能支持HBV復(fù)制過(guò)程中病毒粘附和侵入的下游步驟。
為了產(chǎn)生感染性的HBV病毒顆粒，將HBV基因組表達(dá)載體和HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體共同導(dǎo)入宿主包裝細(xì)胞。數(shù)天后，收集宿主包裝細(xì)胞產(chǎn)生的HBV/HFV嵌合包膜偽型化的HBV顆粒，接種宿主細(xì)胞。接種數(shù)天后，測(cè)定靶細(xì)胞的感染性?？衫冒ǖ幌抻诹姿徕}-DNA沉淀法、電穿孔法的各種非常完善的操作方法完成HBV基因組表達(dá)載體和HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體的導(dǎo)入?？衫冒ǖ幌抻跈z測(cè)HBV抗原(基于抗體的Western印跡及ELISA檢測(cè))、HBV核酸(如PCR、RT-PCR、Northern印跡及Southern印跡檢測(cè))的方法完成HBV對(duì)靶細(xì)胞的感染性測(cè)定。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用CMV-IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子調(diào)控HBV基因組表達(dá)載體和HFV包膜表達(dá)載體。HBV基因組含有一個(gè)熒光素酶指示性基因。包裝宿主細(xì)胞為HEK293。利用磷酸鈣-DNA沉淀法將HBV基因組表達(dá)載體和HBV/HFV嵌合包膜表達(dá)載體導(dǎo)入包裝宿主細(xì)胞。每種載體DNA制劑的用量為5～10微克。轉(zhuǎn)染后，包裝細(xì)胞孵育24～72小時(shí)。收集并凍融細(xì)胞及培養(yǎng)基以便釋放與細(xì)胞相聯(lián)的病毒毒粒。將培養(yǎng)基離心并過(guò)濾，濾液作為感染宿主靶細(xì)胞的HBV/HFV嵌合包膜偽型化HBV原種。靶細(xì)胞為HepaG2或Huh7。感染后48～72小時(shí)，裂解受感染的細(xì)胞，測(cè)定裂解液中的熒光素酶活性。感染細(xì)胞中測(cè)得的熒光素酶活性值作為HBV完成單輪復(fù)制的直接指標(biāo)。
實(shí)施例3HBV藥物敏感性和復(fù)制能力(“病毒適合度”)的測(cè)定方法本實(shí)施例提供了準(zhǔn)確、可重現(xiàn)地測(cè)定HBV藥物敏感性及鑒定新/另外的HBV復(fù)制抑制劑的手段和方法。本實(shí)例進(jìn)一步提供了手段和方法以測(cè)定對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或以HBV復(fù)制其他步驟為靶點(diǎn)的藥物/化合物表現(xiàn)出敏感性下降的HBV復(fù)制能力。本實(shí)例中測(cè)定藥物敏感性和復(fù)制能力的手段和方法適用于其他嗜肝DNA病毒，其中一些如鴨嗜肝DNA病毒、土撥鼠嗜肝DNA病毒可以充當(dāng)HBV疾病有用的動(dòng)物模型。
利用美國(guó)專(zhuān)利NO.6,242,187和美國(guó)系列號(hào)為No.09/766,344中所述的手段和方法進(jìn)行藥物敏感性和復(fù)制能力試驗(yàn)。專(zhuān)利的內(nèi)容在此引入作為參考。用上述的“HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體”、“HFV包膜包裝載體”、“包裝宿主細(xì)胞”和“靶細(xì)胞”完成藥物敏感性和復(fù)制能力試驗(yàn)。
包裝宿主細(xì)胞可包括各種人類(lèi)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括但并不局限于人胚腎細(xì)胞(HEK293)和人肝癌細(xì)胞(HepG2，Huh7)。理想的包裝宿主細(xì)胞在導(dǎo)入“HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體”DNA后將產(chǎn)生大量偽型化的HBV病毒毒粒。靶細(xì)胞可包括原代細(xì)胞和細(xì)胞系。更特別的說(shuō)包括原代肝細(xì)胞及肝源細(xì)胞系，包括但并不限于HepG2和Huh7細(xì)胞。理想的靶宿主細(xì)胞表面表達(dá)HFV受體(s)，能支持HBV復(fù)制過(guò)程中病毒粘附和侵入的下游步驟。
HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體表達(dá)HBV基因，在它們導(dǎo)入包裝宿主細(xì)胞后能產(chǎn)生HBV顆粒。HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體也包含一個(gè)功能性指示性基因，如熒火蟲(chóng)熒光素酶基因。感染后靶細(xì)胞中產(chǎn)生熒光素酶活性值為HBV復(fù)制能力的直接指標(biāo)。利用來(lái)源于各種來(lái)源的HBV P基因序列(編碼逆轉(zhuǎn)錄酶活性)構(gòu)建HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體。這些來(lái)源可包括攜帶有藥物敏感性或抗性HBV病毒株(如對(duì)拉米夫定耐藥或敏感的病毒)的病人樣品和具明確RT序列的HBV克隆，其中該RT序列包含或缺失與藥物抗性相關(guān)的突變(M550V)。
為了產(chǎn)生感染性HBV病毒顆粒，將HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體和實(shí)例中所述的HFV包膜包裝載體DNA共轉(zhuǎn)染包裝宿主細(xì)胞如HEK293。包膜包裝載體必須能產(chǎn)生HFV包膜蛋白gp80SU、gp48TM(如pCXAS-HFVenv)或含HBV及HFV包膜蛋白特定功能域的嵌合包膜蛋白(pCXAS-HBV/HFVenv)等HFV包膜蛋白。轉(zhuǎn)染數(shù)天后收集宿主包裝細(xì)胞產(chǎn)生的HFV偽型化HBV病毒顆粒，然后將之感染靶宿主細(xì)胞(對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍融可以釋放與細(xì)胞相聯(lián)的病毒顆粒從而提高滴度)。感染數(shù)天后，裂解靶細(xì)胞并測(cè)定熒光素酶活性。
受感染細(xì)胞所測(cè)得的熒光素酶活性值可作為“感染性”的直接指標(biāo)，感染性亦稱(chēng)為“復(fù)制能力”或“體外適合度”，即病毒完成單輪復(fù)制的能力。通過(guò)將受試病毒(如來(lái)源于病人樣品的RT序列)產(chǎn)生的熒光素酶活性值與一來(lái)源于HBVVayw等已鑒定HBV分子克隆的參照病毒所產(chǎn)生的熒光素酶活性值比較來(lái)評(píng)估相對(duì)適合度。適合度低于參照病毒的病毒在感染靶細(xì)胞后所產(chǎn)生的熒光素酶活性低于參照病毒。適合度測(cè)量值用參照病毒的百分?jǐn)?shù)表示，如參照病毒的25％、50％、75％、100％或125％。
在無(wú)藥物和藥物存在的條件下，測(cè)定同一受試病毒(如來(lái)源于病人樣品的RT序列)所產(chǎn)生的熒光素酶活性值，將測(cè)得的活性值加以比較來(lái)評(píng)價(jià)病毒對(duì)抗病毒藥物(如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)的敏感性。為了制作對(duì)藥物活性準(zhǔn)確定量的抑制曲線(xiàn)，可在大范圍的藥物濃度下對(duì)病毒進(jìn)行試驗(yàn)(Petropoulos等，1999)。典型地，藥物活性以抑制50％或95％病毒復(fù)制所需的藥物濃度表示，分別稱(chēng)為IC50和IC95。抑制藥物敏感性受試病毒復(fù)制的藥物濃度和抑制已鑒定的藥物敏感性參照病毒HBVayw復(fù)制的藥物濃度相同。這種情況下，受試病毒和參照病毒的IC50基本相同。抑制藥物敏感性降低的病毒復(fù)制的藥物濃度比抑制已鑒定藥物敏感性參照病毒復(fù)制的藥物濃度要高。這種情況下，受試病毒的IC50高于參照病毒的IC50。抑制藥物敏感性增加的病毒復(fù)制的藥物濃度比抑制已鑒定藥物敏感性參照病毒復(fù)制的藥物濃度要低。此時(shí)，受試病毒的IC50低于參照病毒的IC50。
實(shí)施例4與HBV藥物敏感性和/或復(fù)制能力相關(guān)的基因突變的鑒定方法本實(shí)施例提供了一種鑒定逆轉(zhuǎn)錄酶中改變HBV藥物敏感性和/或復(fù)制適合度的突變的手段和方法。此處鑒定逆轉(zhuǎn)錄酶改變HBV藥物敏感性和/或復(fù)制適合度的突變的手段和方法適用于HBV復(fù)制中包括但不限于cccDNA形成、病毒裝配、病毒出芽的其他步驟。本實(shí)例還提供了對(duì)特定逆轉(zhuǎn)錄酶突變對(duì)于藥物敏感性和/或復(fù)制適合度的影響進(jìn)行定量的手段和方法。對(duì)特定逆轉(zhuǎn)錄酶突變對(duì)于藥物敏感性和/或復(fù)制適合度的影響進(jìn)行定量的手段和方法適用于其他涉及到HBV復(fù)制的基因，包括C和X基因中的突變。
如實(shí)施例1中所描述和引用的那樣構(gòu)建HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體。對(duì)來(lái)源于病人樣品的抗性/適合度試驗(yàn)載體、或來(lái)源于HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體庫(kù)的克隆、或利用定點(diǎn)突變進(jìn)行人工改造使之含有特定突變的HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體進(jìn)行藥物敏感性和適合度測(cè)定，以準(zhǔn)確、定量地確定藥物敏感性和與已鑒定參照標(biāo)準(zhǔn)相比的相對(duì)適合度。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，從同一病人的不同時(shí)間點(diǎn)，例如，在開(kāi)始治療之前、藥物治療變化之前或之后、或疾病惡化的病毒標(biāo)記物(RNA拷貝數(shù))、免疫標(biāo)記物(CD4 T細(xì)胞)或臨床標(biāo)記物(機(jī)會(huì)性感染)變化之前或之后，收集病毒比較其藥物敏感性和/或適合度。可對(duì)病人樣品的檢測(cè)結(jié)果作進(jìn)一步檢驗(yàn)，驗(yàn)證與觀(guān)察到的藥物物敏感性和/或相對(duì)適合度相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性變化。
病人HBV樣品的逆轉(zhuǎn)錄酶活性可以利用廣泛應(yīng)用的任一分析方法來(lái)測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，這些方法包括但并不限于通過(guò)基于分子信標(biāo)(參考Kramer？)或5’-核酸外切酶活性(Liet和Petropoulos，1996)的常規(guī)或?qū)崟r(shí)PCR進(jìn)行同聚物延伸(如Oligo dTpoly rC)來(lái)測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用一種定量PCR分析法測(cè)定與病毒顆粒相關(guān)的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。該定量PCR分析法可以檢測(cè)與熱穩(wěn)定DNA聚合酶相關(guān)的5’-核酸外切酶活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將病人病毒的HBV RT活性與未接觸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或其他抗病毒藥物的參照病毒(即“野生型”)的HBV RT活性相比。在另一實(shí)施方案中，從同一病人的不同時(shí)間點(diǎn)，例如，在開(kāi)始治療之前、藥物治療變化之前或之后、或疾病惡化的病毒標(biāo)記物(RNA拷貝數(shù))、免疫標(biāo)記物(CD4 T細(xì)胞)或臨床標(biāo)記物(機(jī)會(huì)性感染)變化之前或之后，收集病毒進(jìn)行HBV的RT活性測(cè)定，并加以比較。
病人HBV樣品的基因型分析利用廣為應(yīng)用的基因型分析方法(如核酸測(cè)序、差異探針雜交、寡核苷酸矩陣雜交)對(duì)HBV抗性/適合度試驗(yàn)載體DNA進(jìn)行分析，不管該載體DNA為庫(kù)還是構(gòu)成庫(kù)的單個(gè)克隆。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)病毒RNA純化、RT-PCR和雙脫氧核苷酸鏈末端測(cè)序來(lái)測(cè)定病人HBV樣品的序列。將測(cè)定的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的參照序列相比較，如有可能也與同一病人在開(kāi)始治療前的病人樣品相比較，鑒定基因型中與參照序列或處理前序列不同、且與所觀(guān)察到的藥物敏感性和/或復(fù)制能力改變相關(guān)的序列。
定點(diǎn)突變株的藥物敏感性和病毒復(fù)制適合度分析利用在已鑒定藥物敏感性病毒(即“野生型”)的明確遺傳背景的基礎(chǔ)上引入特定突變的抗性/適合度試驗(yàn)載體，來(lái)評(píng)估與HBV藥物敏感性和病毒復(fù)制適合度相關(guān)的基因型改變。突變可以單獨(dú)引入，也可和/或同其他調(diào)節(jié)病毒對(duì)藥物敏感性和/或藥物適合度的突變聯(lián)合引入。使用任何一種廣為有效的定點(diǎn)誘變方法將突變引入到抗性/適合度試驗(yàn)載體中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用了用于定點(diǎn)誘變的兆堿基引物PCR法。利用實(shí)例3中所述的藥物敏感性和/或適合度分析方法檢測(cè)包含特異的或一組突變的抗性/適合度試驗(yàn)載體。病毒突變株的適合度與缺乏特定突變的參照病毒相比較。觀(guān)察到的藥物敏感性和/或適合度變化歸因于在耐藥試驗(yàn)載體中引入的特定突變。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄酶上含有導(dǎo)致550位發(fā)生氨基酸替換(M550V，M550I)的定點(diǎn)突變的敏感性/適合度試驗(yàn)載體。適合度測(cè)定結(jié)果使特定的逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸替換和藥物敏感性/適合度的改變相關(guān)聯(lián)。
表1


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權(quán)利要求
1.一種制備在體外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒的方法，該方法包括(a)向細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，和(ii)包含編碼泡沫病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸的泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體；(b)培養(yǎng)細(xì)胞從而產(chǎn)生含有泡沫病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒在體外具有感染性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體缺失編碼嗜肝DNA病毒包膜蛋白的核酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體包含來(lái)源于嗜肝DNA病毒基因組的至少一個(gè)基因，所述基因組選自以下基因組土撥鼠肝炎病毒(WHV)基因組、黃鼠肝炎病毒(GSHV)基因組、鴨乙型肝炎病毒(DHBV)基因組、雪雁肝炎病毒(SGHV)基因組及人類(lèi)乙型肝炎病毒(HBV)基因組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體包含來(lái)源于人乙型肝炎病毒(HBV)基因組的基因。
5.權(quán)利要求3的方法，其中嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體還包含外源調(diào)控元件。
6.權(quán)利要求5的方法，其中外源調(diào)控元件為人巨細(xì)胞病毒即早基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(CMV-IE)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體包含來(lái)源于泡沫病毒基因組的基因的至少一個(gè)片段，所述基因組選自以下基因組猿猴泡沫病毒(SFV)基因組、貓泡沫病毒(FFV)基因組、牛泡沫病毒(BFV)基因組、海獅泡沫病毒(SLFV)基因組、倉(cāng)鼠泡沫病毒(HaFV)基因組和人泡沫病毒(HFV)基因組。
8.權(quán)利要求7的方法，其中基因編碼包膜蛋白或其片段。
9.權(quán)利要求1的方法，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體包含來(lái)源于人泡沫病毒(HFV)基因組的基因或其片段。
10.權(quán)利要求9的方法，其中來(lái)源于人泡沫病毒(HFV)基因組的基因或其片段編碼gp130env包膜基因產(chǎn)物或其片段。
11.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
12.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的方法，其中鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)肝細(xì)胞。
14.權(quán)利要求11的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞。
16.權(quán)利要求11的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì)胞。
17.權(quán)利要求14的方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中人肝癌細(xì)胞為HepG2或Huh7細(xì)胞。
19.一種在體外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒，它包含泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白的至少一個(gè)片段。
20.權(quán)利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒是分離的。
21.權(quán)利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒選自以下病毒猿猴泡沫病毒(SFV)、貓泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海獅泡沫病毒(SLFV)、倉(cāng)鼠泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
22.權(quán)利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒包含嵌合包膜蛋白，該嵌合包膜蛋白主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
23.權(quán)利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒毒粒還包含從嗜肝DNA病毒感染者分離的核酸。
24.權(quán)利要求23的嗜肝DNA病毒毒粒，其中從嗜肝DNA病毒感染者分離的核酸編碼逆轉(zhuǎn)錄酶。
25.權(quán)利要求19的嗜肝DNA病毒毒粒，其中嗜肝DNA病毒還包含指示性核酸。
26.包含權(quán)利要求19至25任一項(xiàng)中嗜肝DNA病毒毒粒的細(xì)胞。
27.權(quán)利要求26的細(xì)胞，其中細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì)胞。
29.權(quán)利要求27的細(xì)胞，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
30.權(quán)利要求29的細(xì)胞，其中人類(lèi)細(xì)胞為人腎細(xì)胞。
31.權(quán)利要求29的細(xì)胞，其中人類(lèi)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞。
32.一種測(cè)定抗嗜肝DNA病毒藥物敏感性的方法，該方法包括(a)向第一細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，(ii)編碼泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸，和(iii)指示性核酸；(b)培養(yǎng)步驟(a)得到的第一細(xì)胞以產(chǎn)生嗜肝DNA病毒毒粒；(c)將步驟(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒與第二細(xì)胞混合，其中抗嗜肝DNA病毒藥物加入第一或第二細(xì)胞中，或加入第一和第二細(xì)胞中；(d)測(cè)定第二細(xì)胞中指示性核酸產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)的量，其中可檢測(cè)信號(hào)的量取決于嗜肝DNA病毒毒粒對(duì)第二細(xì)胞的感染；和(e)將步驟(d)中測(cè)定到的信號(hào)量與無(wú)藥物存在時(shí)測(cè)得的信號(hào)量相比較，其中藥物存在時(shí)信號(hào)量下降說(shuō)明對(duì)藥物敏感，信號(hào)量無(wú)變化或上升則說(shuō)明對(duì)藥物產(chǎn)生抗性。
33.權(quán)利要求32的方法，其中步驟(a)的嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體還包含來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸。
34.權(quán)利要求33的方法，其中來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因的至少一個(gè)片段。
35.權(quán)利要求34的方法，其中基因是HBV P基因、HCV C基因、HBV X基因或HBV S基因。
36.權(quán)利要求34的方法，其中來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸編碼逆轉(zhuǎn)錄酶。
37.權(quán)利要求32的方法，其中第二細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
38.權(quán)利要求32的方法，其中第二細(xì)胞為鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞。
39.權(quán)利要求32的方法，其中鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞為鳥(niǎo)肝細(xì)胞。
40.權(quán)利要求37的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類(lèi)細(xì)胞。
41.權(quán)利要求40的方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞。
42.權(quán)利要求37的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293細(xì)胞。
43.權(quán)利要求40的方法，其中人類(lèi)細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞。
44.權(quán)利要求43的方法，其中人肝癌細(xì)胞為HepG2或Huh7細(xì)胞。
45.權(quán)利要求32的方法，其中泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒選自下列病毒猿猴泡沫病毒(SFV)、貓泡沫病毒(FFV)、牛泡沫病毒(BFV)、海獅泡沫病毒(SLFV)、倉(cāng)鼠泡沫病毒(HaFV)和人泡沫病毒(HFV)。
46.權(quán)利要求32的方法，其中步驟(a)(i)的核酸編碼gp130env包膜蛋白。
47.權(quán)利要求32的方法，其中步驟(a)(i)的核酸編碼嵌合包膜蛋白，該嵌合包膜蛋白主要由(i)乙型肝炎病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域和(ii)泡沫病毒包膜蛋白結(jié)構(gòu)域組成。
48.權(quán)利要求32的方法，其中第二細(xì)胞在其表面表達(dá)一種蛋白，該蛋白與人泡沫病毒包膜蛋白結(jié)合。
49.一種測(cè)定來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的病毒復(fù)制能力的方法，該方法包括(a)向第一細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，(ii)編碼泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸，和(iii)指示性核酸；(b)培養(yǎng)步驟(a)得到的細(xì)胞以產(chǎn)生嗜肝DNA病毒毒粒；(c)將步驟(b)得到的嗜肝DNA病毒毒粒與第二細(xì)胞混合；(d)測(cè)定第二細(xì)胞中指示性核酸產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)的量，其中可檢測(cè)信號(hào)的量取決于嗜肝DNA病毒毒粒對(duì)第二細(xì)胞的感染；(e)將步驟(d)的測(cè)量值標(biāo)準(zhǔn)化；和(f)將步驟(e)標(biāo)準(zhǔn)化后的測(cè)量值與采用對(duì)照參比嗜肝DNA病毒經(jīng)步驟(a)至(d)而測(cè)得的信號(hào)量相比較，其中與對(duì)照組相比信號(hào)量上升意味著復(fù)制能力提高，信號(hào)量降低意味著來(lái)源于受感染病人的嗜肝DNA病毒的復(fù)制能力下降。
50.一種測(cè)定抗嗜肝DNA病毒藥物敏感性的方法，該方法包括(a)向細(xì)胞中導(dǎo)入(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體，(ii)編碼泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸，和(iii)指示性核酸；(b)培養(yǎng)步驟(a)得到的細(xì)胞；(c)將細(xì)胞與抗嗜肝DNA病毒藥物接觸；(d)測(cè)定細(xì)胞中指示性核酸產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)的量；和(e)將步驟(d)所測(cè)得的信號(hào)量與不存在藥物的條件下測(cè)得的信號(hào)量相比較，其中藥物存在時(shí)信號(hào)量降低說(shuō)明對(duì)藥物敏感，信號(hào)量無(wú)變化或升高則說(shuō)明對(duì)藥物有抗性
51.權(quán)利要求50的方法，其中步驟(a)中的嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體還包括來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸。
52.權(quán)利要求51的方法，其中來(lái)源于嗜肝DNA病毒感染病人的核酸包含人乙型肝炎病毒(HBV)基因的至少一個(gè)片段。
53.權(quán)利要求52的方法，其中基因?yàn)镠BV P基因或HBV C基因。
54.一種鑒定嗜肝DNA病毒核酸中與抗嗜肝DNA病毒藥物抗性相關(guān)的突變的方法，該方法包括(a)在應(yīng)用抗嗜肝DNA病毒藥物前對(duì)嗜肝DNA病毒核酸進(jìn)行測(cè)序；(b)依據(jù)權(quán)利要求50的方法測(cè)定步驟(a)中測(cè)序的嗜肝DNA病毒對(duì)藥物的敏感性；(c)將嗜肝DNA病毒與藥物相接觸，使步驟(b)中測(cè)得的嗜肝DNA病毒對(duì)藥物的敏感性降低；(d)將步驟(a)測(cè)定的序列與步驟(c)中嗜肝DNA病毒接觸藥物后所測(cè)定的序列相比較，以鑒定嗜肝DNA病毒核酸中與抗嗜肝DNA病毒藥物抗性相關(guān)的突變。
55.權(quán)利要求54的方法，其中測(cè)量步驟(b)包含依據(jù)權(quán)利要求32的方法，測(cè)定經(jīng)步驟(a)測(cè)序的嗜肝DNA病毒對(duì)抗嗜肝DNA病毒藥的敏感性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生在體外具有感染性的嗜肝DNA病毒毒粒的方法，此方法包括(a)將(i)嗜肝DNA病毒基因組表達(dá)載體和(ii)包含編碼泡沫病毒包膜蛋白至少一個(gè)片段的核酸的泡沫逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞；(b)培養(yǎng)該細(xì)胞從而產(chǎn)生含有泡沫病毒包膜至少一個(gè)片段的嗜肝DNA病毒毒粒，其中所述嗜肝DNA病毒毒粒在體外具有感染性。本發(fā)明還提供了測(cè)定抗嗜肝DNA病毒藥物敏感性的方法，測(cè)定來(lái)源于被感染病人的嗜肝DNA病毒復(fù)制能力的方法，及鑒定嗜肝DNA病毒核酸中與抗嗜肝DNA病毒藥物抗性相關(guān)的突變的方法。
文檔編號(hào)C12N15/86GK1545550SQ02816440
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月21日
發(fā)明者C·J·佩特羅普洛斯, C J 佩特羅普洛斯 申請(qǐng)人:瓦羅洛吉克公司