專利名稱：編碼番茄紅素環(huán)化酶 /八氫番茄紅素合酶(carRP)和八氫番茄紅素脫氫酶(carB)的三孢 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及命名為carRP和carB的三孢布拉霉(Blakeslea trispora)的2個(gè)新基因。基因carRP編碼雙功能酶番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶，而carB編碼酶八氫番茄紅素脫氫酶。2個(gè)基因都與三孢布拉霉的β-胡蘿卜素生物合成途徑有關(guān)(參見圖解)。
現(xiàn)有技術(shù)類葫蘿卜素是類異戊二烯類型的色素，其由某些細(xì)菌，真菌和光合生物合成。由于它們對健康的有益效果和它們誘人的顏色，類葫蘿卜素作為色素和食品添加劑具有重要的商業(yè)價(jià)值。β-胡蘿卜素是一種類葫蘿卜素，其化學(xué)合成從1956年起已經(jīng)已知。它具有536.9的分子量，和含有11個(gè)共軛雙鍵的分子(C40H56)。它的顏色在晶態(tài)是紅紫色，在油性溶液中是黃橙色，在水性分散體中是橙色。合成的β-胡蘿卜素具有全反式異構(gòu)構(gòu)型，而從各種天然來源獲得的β-胡蘿卜素具有各種形式單-順，雙-順和多-順。
通過微生物合成生產(chǎn)類葫蘿卜素是化學(xué)和生物方法之間競爭的典型實(shí)例。生物技術(shù)方法顯示其中有可能以簡單的方式獲得具有更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的類葫蘿卜素，如僅以天然形式存在的構(gòu)象異構(gòu)體。與化學(xué)合成競爭，用于生產(chǎn)β-胡蘿卜素的工業(yè)生物技術(shù)方法是基于藻鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)和真菌三孢布拉霉的使用。使用三孢布拉霉的生產(chǎn)方法涉及進(jìn)行(+)和(-)菌株的混合發(fā)酵以獲得最大產(chǎn)量的β-胡蘿卜素。這導(dǎo)致三孢酸的生物合成，其誘導(dǎo)β-胡蘿卜素的生產(chǎn)。(+)菌株和(-)菌株都生產(chǎn)β-胡蘿卜素，其被兩者代謝成視黃醛，然后成4-二氫三孢醇。(+)菌株使用4-二氫三孢醇作為形成4-二氫三孢酸和它的甲酯(4-二氫三孢甲酯)的底物。對于它的部分，(-)菌株將4-二氫三孢醇代謝成三孢醇。最后，4-二氫三孢甲酯被(-)菌株轉(zhuǎn)化成三孢酸并且三孢醇被(+)菌株轉(zhuǎn)化成三孢酸。三孢酸生物合成的這種描述是簡化，因?yàn)樵摲椒óa(chǎn)生許多共代謝物，其中有些對于(+)菌株和(-)菌株是共有的，但其它對于它們中之一是特異性的。這些共代謝物的相對量根據(jù)菌株而變化。
盡管真菌三孢布拉霉的巨大的生物技術(shù)重要性，關(guān)于β-胡蘿卜素的生物合成的科學(xué)知識是缺乏的，因?yàn)?i)還未描述關(guān)于它的遺傳操作，即生物合成/調(diào)節(jié)基因的克隆和轉(zhuǎn)化的基本方法和(ii)缺乏和β-胡蘿卜素生物合成有關(guān)的酶的特性信息。然而，已經(jīng)在系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的真菌如布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)和卷枝毛霉(Mucor circinelloides)中描述β-胡蘿卜素的生物合成途徑(參見圖解)(Arrach N.等(2001)Proceedings of the National Academy of Sciences USA 981687-1692；Velayos A.等(2000)European Journal of Biochemistry 2675509-5519)。該生物合成至少需要3種酶(i)八氫番茄紅素合酶，其連接產(chǎn)生八氫番茄紅素的2分子香葉基香葉基焦磷酸，(ii)八氫番茄紅素脫氫酶，其將4個(gè)雙鍵引入八氫番茄紅素分子以合成番茄紅素，和(iii)番茄紅素環(huán)化酶，其使用番茄紅素作為底物，負(fù)責(zé)形成位于β-胡蘿卜素分子兩端的環(huán)。
分析三孢布拉霉的突變體已經(jīng)得出結(jié)論，在該真菌中的β-胡蘿卜素的生物合成途徑類似于關(guān)于布拉克須霉的描述(Metha B.J.和Cerdá-Olmedo E.(1995)Applied Microbiology and Biotechnology 42836-838)。在布拉克須霉的情形中，通過突變可以改變它菌絲體的黃色，產(chǎn)生菌絲體為紅色，白色或各種梯度黃色的菌株。紅色突變體累積番茄紅素，而白色突變體缺乏類胡羅卜素的生產(chǎn)或累積八氫番茄紅素。使用互補(bǔ)分析，已經(jīng)鑒定稱為carB和carRA的2個(gè)基因，其產(chǎn)物可能組織成酶復(fù)合體，其中4個(gè)脫氫作用由4個(gè)相同的八氫番茄紅素脫氫酶單位催化并且2個(gè)環(huán)化由2個(gè)相同的番茄紅素環(huán)化酶單位催化(Candau R.等(1991)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 884936-4940)。已經(jīng)克隆和表征carB基因(Ruiz-Hidalgo M.J.等(1997)Molecular and GeneralGenetics 253734-744)和carRA基因(Arrach N.等(2001)Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 981687-1692)。carRA基因具有2個(gè)不同結(jié)構(gòu)域(i)結(jié)構(gòu)域R，其位于更靠近5’末端并編碼八氫番茄紅素合酶活性和(ii)結(jié)構(gòu)域A，其負(fù)責(zé)八氫番茄紅素合酶活性。此外，已經(jīng)在卷枝毛霉中表達(dá)布拉克須霉的carB基因(Ruiz-Hidalgo M.J.等(1999)Current Microbiolgy 39259-264)。
也已經(jīng)克隆和表征卷枝毛霉的基因carB(Velayos A.等(2000)Planta210938-946)和carRP(Velayos A.等(2000)European Journal ofBiochemistry 2675509-5519)。carRP基因編碼具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的雙功能酶番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶(i)結(jié)構(gòu)域R，其位于更靠近5’末端并編碼番茄紅素環(huán)化酶活性和(ii)結(jié)構(gòu)域P，其位于3’末端并負(fù)責(zé)八氫番茄紅素合酶活性。即使在缺乏結(jié)構(gòu)域P時(shí)結(jié)構(gòu)域R也是有功能的，而結(jié)構(gòu)域P需要結(jié)構(gòu)域R的存在以適當(dāng)?shù)仄鹱饔谩?br> 發(fā)明詳述本發(fā)明首次描述三孢布拉霉的carB和carRP基因。如先前關(guān)于布拉克須霉和卷枝毛霉所述，carB基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶并且carRP基因編碼具有結(jié)構(gòu)域R(更靠近5’末端和編碼番茄紅素環(huán)化酶活性)和結(jié)構(gòu)域P(位于3’末端并負(fù)責(zé)八氫番茄紅素合酶活性)的雙功能酶番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶。具體地，由carB編碼的產(chǎn)物進(jìn)行八氫番茄紅素至番茄紅素的轉(zhuǎn)化，由carRP編碼的雙功能酶催化從香葉基香葉基-PP的八氫番茄紅素的生物合成和番茄紅素至β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化。兩個(gè)基因(i)涉及β-胡蘿卜素的生物合成途徑，(ii)在基因組中是緊接著和(iii)在位于兩者之間的雙向啟動子的控制下表達(dá)。該雙向啟動子允許在一個(gè)方向或在相反方向的基因表達(dá)。缺乏這兩個(gè)基因中任何一個(gè)的突變體不能生產(chǎn)β-胡蘿卜素，而是累積相應(yīng)的生物合成中間體(參見圖解)。
三孢布拉霉是對于生物技術(shù)生產(chǎn)β-胡蘿卜素有重要工業(yè)意義的真菌。實(shí)際上，該方法變得與目前工業(yè)使用的合成方法存在競爭性?？梢允褂们笆龅幕騝arRP和carB，例如用于(i)通過增加它的表達(dá)改善β-胡蘿卜素的產(chǎn)率和(ii)通過產(chǎn)生能夠生物合成其它類胡蘿卜素的菌株修飾β-胡蘿卜素的生物合成途徑。通過將額外拷貝的所述基因以它們天然狀態(tài)或在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)的形式插入于三孢布拉霉中可以增加carRP和carB的基因表達(dá)。例如通過操作carRP基因使番茄紅素環(huán)化酶活性失活可以實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素生物合成途徑的修飾。這樣，將產(chǎn)生能夠生產(chǎn)番茄紅素，有重大工業(yè)和商業(yè)利益的類胡羅卜素的菌株。
下頁的圖解顯示涉及三孢布拉霉的β-胡蘿卜素生物合成途徑的基因和酶。八氫番茄紅素合成酶活性連接2分子香葉基香葉基焦磷酸，產(chǎn)生八氫番茄紅素。八氫番茄紅素脫氫酶活性在八氫番茄紅素分子中引入4個(gè)雙鍵以合成番茄紅素。番茄紅素環(huán)化酶活性，其使用番茄紅素作為底物，形成位于β-胡蘿卜素分子兩端的環(huán)。
圖解將真菌三孢布拉霉的基因組DNA用于構(gòu)建在噬菌體載體λ-GEM12中的基因文庫。為此，用限制酶Sau3AI實(shí)行部分消化并將產(chǎn)生的片段連接到λ-GEM12，如在Sambrook J.等(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA中所述。通過使用對應(yīng)于卷枝毛霉的carRP基因的探針篩選所述三孢布拉霉的基因文庫克隆基因carRP(番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶)和carB(八氫番茄紅素脫氫酶)。使用基于卷枝毛霉的carRP基因(Velayos A.等(2000)European Journal of Biochemistry 2675509-5519)設(shè)計(jì)的引物，通過PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))獲得探針。這樣擴(kuò)增560-bp的DNA片段并用于篩選基因文庫，分離4個(gè)命名為fALBT1，fALBT4，fALBT12和fALBT15的重組噬菌體(

圖1)。用一系列限制酶分析所述克隆，然后將2.4-kb HindIII片段亞克隆至大腸桿菌的質(zhì)粒載體中。前述片段的限制酶圖譜在圖解中顯示。接下來，測定包括在前述HindIII片段中的2430bp的序列，發(fā)現(xiàn)2個(gè)不完整的可讀框(ORF)，其在相反的方向上轉(zhuǎn)錄?；谒鼈兣c存在于數(shù)據(jù)庫中的序列的相似性，將它們命名為carRP(SEQ ID NO1)和carB(SEQ ID NO2)。隨后鄰近于前述2.4kb片段HindIII的末端的DNA區(qū)域的亞克隆和 測序使可以完成兩個(gè)ORF的核苷酸序列。
對應(yīng)于carRP基因的ORF具有1894bp的長度，被位置406和475之間的70-bp內(nèi)含子間斷。所述ORF編碼608個(gè)氨基酸，69,581Da和7.78的等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。將它推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO3)與SwissProt數(shù)據(jù)庫比較顯示與編碼卷枝毛霉(67％)，布拉克須霉(55％)和粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)(29％)的番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶的基因(Velayos A.等(2000)。European Journal ofBiochemistry 2675509-5519；Arrach N等(2000)。Proceedings of the National Academy of Sciences USA981687-1692；Schmidhauser T.J.等(1994)。The Journal of BiologicalChemistry 26912060-12066)的很高相似性。
對應(yīng)于carB基因的ORF具有1955bp的長度并且被分別位于位置594-734和1584-1651的141bp和68bp的2個(gè)內(nèi)含子中斷。該ORF編碼582個(gè)氨基酸，66,426Da和6.9的等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。將它推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO4)與SwissProt數(shù)據(jù)庫比較顯示與編碼卷枝毛霉(80％)，布拉克須霉(72％)和粗糙脈孢菌(48％)的八氫番茄紅素脫氫酶的基因(Velayos A.等(2000)。Planta，210938-946；Ruiz-Hidalgo等(1997)。Molecular and General Genetics 253734-744；Ruiz-Hidalgo等(1999)。Current Microbiology 39259-264；Schmidhauser等(1990)。Molecular and Cellular Biology 105064-5070)的很高相似性。
使用適當(dāng)?shù)南拗颇繕?biāo)將包括兩個(gè)基因(carRP和carB)的6.9-kb DNA片段亞克隆至質(zhì)粒載體，其能夠以一個(gè)或多個(gè)拷貝結(jié)合到三孢布拉霉的基因組中，其允許在宿主真菌中表達(dá)這些基因。類似地，可以獲得carRP和carB基因的啟動子(使用適當(dāng)?shù)南拗颇繕?biāo)或通過PCR)并用于在三孢布拉霉中表達(dá)同源基因和異源基因。下列實(shí)施例描述在carRP和carB基因的啟動子下印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的腐草霉素抗性基因(bleR)表達(dá)(Drocourt D.等(1990)。Nucleic Acids Research184009)。如前所述，可以將carRP和carB基因的啟動子用于在三孢布拉霉中正確表達(dá)異源基因或用于過量表達(dá)弱轉(zhuǎn)錄的同源基因。
在三孢布拉霉中表達(dá)葉黃素的生物合成基因可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體，其能夠生物合成類胡蘿卜素如玉米黃質(zhì)，角黃素，蝦青素或新的類胡蘿卜素。另外，通過基因中斷的方法，將可以阻斷β-胡蘿卜素的生物合成途徑，獲得能夠生產(chǎn)例如作為終產(chǎn)物的番茄紅素的轉(zhuǎn)化體。
根據(jù)布達(dá)佩斯條約的微生物保藏按照布達(dá)佩斯條約的條款，在09.17.01將攜帶質(zhì)粒pALBT9(其包含carRP基因)和pALBT52(其包含carB基因)的2株大腸桿菌菌株保藏在西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(CECT)，巴倫西亞大學(xué)生物學(xué)院微生物系，Campus de Burjasot，46100 Burjasot，巴倫西亞，(西班牙)，保藏號分別為CECT5982和CECT 5981。
下列實(shí)施例詳細(xì)而不限制性地描述本發(fā)明。
實(shí)施例1構(gòu)建三孢布拉霉的(+)和(-)菌株的基因文庫以下列方式構(gòu)建三孢布拉霉的(+)和(-)菌株的基因文庫在600μl的反應(yīng)體積中在37℃下用20單位的Sau3AI部分消化總共300μg的全DNA，并分別在45秒，1分鐘和2分鐘時(shí)收集3個(gè)200μl的等分試樣，用冷EDTA 20mM終止消化。在于0.7％的瓊脂糖凝膠中證實(shí)消化物后，將它們混合，在68℃下加熱10分鐘，讓其緩慢冷卻至室溫并放置在38ml的蔗糖梯度(10-40％)上。將該梯度在26,000rpm下25℃離心24小時(shí)，其后收集0.5-ml等分試樣，在0.4％瓊脂糖凝膠中分析每個(gè)10μl。混合其DNA具有18和22kb之間大小的等分試樣，然后用蒸餾水稀釋至大約10％蔗糖。然后用乙醇沉淀DNA，重懸浮在50μl TE緩沖液中，在0.4％瓊脂糖凝膠中分析3μl最后提到的溶液。在該凝膠中證實(shí)DNA片段的大小正確并且它們的濃度大約為50ng/μl。
平行地，通過先前所述方法(Sambrook J.等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)制備噬菌體λ-GEM12(Promega)的DNA。在37℃下用內(nèi)切核酸酶BamHI和EcoRI將來自噬菌體的50μg DNA消化2小時(shí)。用苯酚/CIA和CIA萃取雙消化物，用乙醇沉淀并重懸浮在50μl TE緩沖液中。在收集2-μl等分試樣后，向剩余中加入MgCl2至10mM，然后在42℃下將它溫育1小時(shí)以促進(jìn)載體的臂在它的粘性末端環(huán)化。再收集2-μl級分并且與前述級分一起在0.5％瓊脂糖凝膠中分析以證實(shí)在粘性末端的正確環(huán)化和測定它的近似濃度(大約100ng/μl)。
接下來，改變插入片段/載體比率，使用0.25μg插入片段和0.25-0.75μg數(shù)量的載體進(jìn)行一系列的連接。將反應(yīng)物在12-14℃下溫育16小時(shí)。使用‘Packagene’(Promega)體外包裝提取物進(jìn)行在連接后產(chǎn)生的重組噬菌體DNA的包殼。將來源于包殼反應(yīng)的產(chǎn)物重懸浮在500μl SM中，進(jìn)行大腸桿菌NM538(Promega)的感染以測定存在的噬菌體和大腸桿菌NM539(Promega)的數(shù)量，旨在測定重組噬菌體的百分比。大腸桿菌NM539是P2噬菌體的溶原性菌株，當(dāng)感染它的噬菌體缺乏非必需中央?yún)^(qū)域時(shí)只生產(chǎn)溶菌噬菌斑。
構(gòu)建的基因文庫的效價(jià)證明如下對于三孢布拉霉(+)125,000pfu，對于三孢布拉霉(-)50,000pfu。在兩種情形中大約80％的噬菌體是外源DNA片段的載體。
實(shí)施例2克隆和表征三孢布拉霉的carB和carRP基因?qū)煞N基因文庫轉(zhuǎn)移至硝化纖維濾器并用對應(yīng)于卷枝毛霉的carRP基因的560-bp探針掃描。該探針是通過PCR擴(kuò)增獲得的，所述PCR使用引物#61(SEQ ID NO5)和#62(SEQ ID NO6)，其被設(shè)計(jì)成卷枝毛霉的carRP基因DNA序列的功能(Velayos A.等(2000)European Journal ofBiochemistry 2675509-5519)。按照先前所述的雜交方法(Sambrook J.等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)進(jìn)行選擇陽性噬菌體的方法。一旦完成預(yù)雜交，雜交，洗滌和放射自顯影，選擇4個(gè)克隆，其命名為fALBT1，fALBT4，fALBT12和fALBT15，其與探針DNA產(chǎn)生陽性信號。通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook J.等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)用適當(dāng)?shù)南拗泼赶删wfALBT4或fALBT15(圖1)可以獲得本發(fā)明要求的、包括carRP和carB基因的DNA。用1種或多種限制酶(圖1)可以獲得包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的DNA片段，并亞克隆至適當(dāng)?shù)妮d體(例如pBluescript)中。
將從fALBT1噬菌體獲得的2.4-kb HindIII DNA片段(圖1)以兩個(gè)可能的方向亞克隆至質(zhì)粒pBluescript I KS(+)的HindIII限制位點(diǎn)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pALBT3和pALBT11。按照廠商的說明書使用‘Erase-a-base’試劑盒將這些質(zhì)粒進(jìn)行序列缺失。使用‘Dye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Kit’進(jìn)行缺失克隆的序列反應(yīng)，并按照廠商的說明書在ABI PRISM自動測序儀(Perkin Elmer)中分離DNA片段。這樣我們在兩條鏈上獲得總共2430bp的核苷酸序列。使用Geneplot程序(DNASTAR)，鑒定兩個(gè)不完整的ORF，其對應(yīng)于carRP和carB基因。為了完成兩個(gè)基因的核苷酸序列，我們進(jìn)行鄰近于前述HindIII片段的DNA區(qū)域的亞克隆和隨后測序。從fALBT1噬菌體開始，將1.0-kb XhoI片段亞克隆至pBluescript I KS(+)(圖1)中，其包括carRP基因的3’末端，產(chǎn)生pALBT12質(zhì)粒。包括在所述質(zhì)粒中片段的兩條鏈的測序使可以完成carRP基因的核苷酸序列。
另外，為了測定carB基因3’區(qū)域的序列，在pBluescript I KS(+)中進(jìn)行從fALBT15獲得的5.1-kb ClaI-NotI片段的亞克隆。按照廠商的說明書使用‘Erase-a-base’試劑盒(Promega)將命名為pALBT59和pALBT82的獲得的質(zhì)粒(雙向)進(jìn)行序列缺失。使用‘Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit’進(jìn)行缺失克隆的序列反應(yīng)，并按照廠商的說明書在ABI PRISM自動測序儀(Perkin Elmer)中分離DNA片段。
完整的carRP基因的核苷酸序列顯示1894bp的ORF，其被70bp的內(nèi)含子間斷，所述內(nèi)含子位于位置406-475之間，兩側(cè)是下列內(nèi)含子/外顯子剪接序列5’(g/GTATGCA)和3’(TTAG/c)。當(dāng)將它們與關(guān)于真菌所述的共有序列5’(g/GTAHGTYW)和3’(MYAG/g)比較時(shí)，它是個(gè)保守序列的問題。該基因編碼608個(gè)氨基酸的多肽，推斷的分子量為69,581Da，等電點(diǎn)為7.78。從該序列(SEQ ID NO3)推斷的蛋白質(zhì)與在數(shù)據(jù)庫中所述的卷枝毛霉(67％)，布拉克須霉(55％)和粗糙脈孢菌(29％)的具有番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶活性的酶(Velayos A.等(2000)。European Journal of Biochemistry 2675509-5519；Arrach N等(2000)。Proceedings of the National Academy of Sciences USA 981687-1692；Schmidhauser T.J.等(1994)。The Journal of Biological Chemistry 26912060-12066)顯示很高的相似性。
carB基因，長度為1955bp，被141和68bp的兩個(gè)內(nèi)含子間斷，所述內(nèi)含子分別位于位置594-734bp和1584-1651bp處，兩側(cè)是與關(guān)于carRP基因所述的那些類似的保守真菌內(nèi)含子/外顯子剪接序列[對于141-bp內(nèi)含子5’(g/GTAAGTA)和3’(ATAG/t)，對于68-bp內(nèi)含子5’(g/GTAATAC)和3’(GTAG/t)]。carB基因編碼582個(gè)氨基酸的多肽，推斷的分子量為66,426Da，等電點(diǎn)為6.9。從該序列(SEQ ID NO4)推斷的蛋白質(zhì)與在數(shù)據(jù)庫中所述的卷枝毛霉(80％)，布拉克須霉(72％)和粗糙脈孢菌(48％)的具有八氫番茄紅素脫氫酶活性的酶(Velayos A.等(2000)。Planta，210938-946；Ruiz-Hidalgo等(1997)。Molecular and General Genetics253734-744；Ruiz-Hidalgo等(1999)。Current Microbiology 39259-264；Schmidhauser等(1990)。Molecular and Cellular Biology 105064-5070)顯示很高的相似性。
實(shí)施例3構(gòu)建用于在三孢布拉霉中異源表達(dá)的質(zhì)粒將pALFleo7質(zhì)粒(Díez B.等(1999)Applied Microbiology andBiotechnology 52196-207)用作構(gòu)建在三孢布拉霉中異源表達(dá)質(zhì)粒的起點(diǎn)。所述質(zhì)粒包含印度斯坦鏈異壁菌的腐草霉素抗性基因(bleR)(DrocourtD.等(1990)。Nucleic Acids Research 184009)，NcoI限制位點(diǎn)位于ATG翻譯起始密碼子處，BamHI限制位點(diǎn)在NcoI之前。pALFleo7還具有構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC基因終止子(TtrpC)。通過用BamHI加上BglII雙消化pALFleo7純化由bleR基因和TtrpC形成的聚簇并亞克隆至pBluescript I KS(+)的BamHI位點(diǎn)。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pALfleo8。接下來，通過定向誘變使用‘QuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit’(Stratagene)將兩個(gè)NcoI位點(diǎn)插入carB和carRP基因的ATG翻譯起始密碼子中。為了將NcoI切割位點(diǎn)插入carB基因，設(shè)計(jì)下列寡核苷酸，其由SEQ ID NO7和SEQ ID NO8表示。為了將NcoI切割位點(diǎn)插入carRP基因，設(shè)計(jì)由SEQ ID NO9和SEQ ID NO10表示的寡核苷酸。在兩種情形中將pALBT3用作PCR擴(kuò)增的模板。一旦插入相應(yīng)的突變，獲得pALBT56質(zhì)粒。
從pALBT56質(zhì)粒開始，使用‘Quiaex II’試劑盒(Quiagen)，對應(yīng)于carB和carRP基因的雙向啟動子(PcarB-PcarRP)純化0.6-kb NcoI片段。將該片段連接至預(yù)先用內(nèi)切核酸酶NcoI消化的pALfleo8質(zhì)粒，獲得兩個(gè)不同質(zhì)粒pALBT57(其在PcarRP啟動子下表達(dá)bleR基因)和pALBT58(其在PcarB啟動子下表達(dá)bleR基因)。質(zhì)粒pALBT57和pALBT58(圖2)允許在三孢布拉霉中異源表達(dá)印度斯坦鏈異壁菌的bleR基因。
實(shí)施例4
構(gòu)建用于將附加拷貝的carRP和carB基因插入三孢布拉霉中的質(zhì)粒。
為了將附加拷貝的carRP和carB基因插入三孢布拉霉，構(gòu)建質(zhì)粒pALBT83，pALBT84和pALBT85(圖2)。在所有3種情形中，將先前所述的pALBT57質(zhì)粒用作起點(diǎn)。以下列方法進(jìn)行pALBT83的構(gòu)建用內(nèi)切核酸酶SphI消化fALBT4，然后用來源于大腸桿菌的DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平它的末端(為了促進(jìn)它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)并最后用內(nèi)切核酸酶NotI消化。接下來，用‘Quiaex II’試劑盒(Quiagen)純化6.9-kb片段，其包含carB和carRP基因。另外，用內(nèi)切核酸酶SacI消化pALBT57質(zhì)粒，然后與DNA聚合酶I的Klenow片段溫育以獲得平端(為了促進(jìn)它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)并最后用NotI消化。連接質(zhì)粒和插入片段的可匹配末端，并通過電穿孔將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。在LB培養(yǎng)基(Sambrook J.等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)中選擇氨芐青霉素抗性(存在于pALBT57載體中)轉(zhuǎn)化體。通過限制酶切分析選擇所需構(gòu)建體，獲得pALBT83質(zhì)粒(圖2)。
以下列方法進(jìn)行pALBT84的構(gòu)建用內(nèi)切核酸酶NdeI消化pALBT9，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平它的末端。接下來，使用‘Quiaex II’試劑盒(Quiagen)純化包含carRP基因的3.5kb片段。另外，用內(nèi)切核酸酶SacI消化pALBT57質(zhì)粒，然后與DNA聚合酶I的Klenow片段溫育以補(bǔ)平末端(為了促進(jìn)它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)。連接質(zhì)粒和插入片段的平端，并通過電穿孔將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。在LB培養(yǎng)基(Sambrook J.等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA)中選擇氨芐青霉素抗性(存在于pALBT57載體中)轉(zhuǎn)化體。通過限制酶切分析選擇所需構(gòu)建體，獲得pALBT84質(zhì)粒(圖2)。
以下列方法進(jìn)行pALBT85的構(gòu)建用內(nèi)切核酸酶XhoI-XbaI消化pALBT52，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段補(bǔ)平它的末端。接下來，使用‘Quiaex II’試劑盒(Quiagen)純化包含carB基因的2.6-kb片段。另外，用內(nèi)切核酸酶SacI消化pALBT57質(zhì)粒，然后與DNA聚合酶I的Klenow片段溫育以補(bǔ)平末端(為了促進(jìn)它外切核酸酶活性的作用未加入dNTP)。連接質(zhì)粒和插入片段的平端，并通過電穿孔將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。在LB培養(yǎng)基(Sambrook J.等(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，USA)中選擇氨芐青霉素抗性(存在于pALBT57載體中)轉(zhuǎn)化體。通過限制酶切分析選擇所需構(gòu)建體，獲得pALBT85質(zhì)粒(圖2)。
為了明確地闡述本發(fā)明，提供總共2副圖?？s寫B(tài)amHI，HindIII等是對限制酶的常規(guī)縮寫。按照通過瓊脂糖凝膠電泳測定的大小以千堿基(kb)顯示DNA片段的近似長度。圖未顯示所有存在的限制位點(diǎn)。本發(fā)明的DNA可以通過各種方法插入到任何適當(dāng)?shù)妮d體中粘性末端的直接連接，利用同聚物附著，通過銜接或連接分子等。
附圖詳述圖1.包含carB和carRP基因的三孢布拉霉基因組區(qū)域的限制酶圖譜。箭頭表示它們中每個(gè)的轉(zhuǎn)錄方向，矩形表示內(nèi)含子的存在。圖下部的線表示克隆到噬菌體載體λ-GEM12(fALBT)中或質(zhì)粒(pALBT)中的DNA片段。該DNA片段的核苷酸序列在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2中描述。
圖2.質(zhì)粒pALBT57，pALBT58，pALBT83，pALBT84和pALBT85的物理圖譜。pALBT57由具有包括腐草霉素-抗性構(gòu)建體PcarRP-bleR-TtrpC的1.7-kbHindIII-BamHI插入片段的pBluescript KS(+)組成。pALBT58由具有包括腐草霉素-抗性構(gòu)建體PcarB-bleR-TtrpC的1.7-kbHindIII-BamHI插入片段的pBluescript KS(+)組成。pALBT83是由具有包括carB和carRP基因的6.9-kb SphI-NotI插入片段的pALBT57形成的。pALBT84由具有包括carRP基因的3.5-kb NdeI插入片段的pALBT57組成。pALBT85是具有包括carB基因的2.6-kb XhoI-XbaI插入片段的pALBT57。
序列表<110>抗生素，S.A.U.
<120>“編碼番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶(carRP)和八氫番茄紅素脫氫酶(carB)的三孢布拉霉β-胡蘿卜素的生物合成基因”<130>P-99669<160>10<210>SEQ ID NO1<211>8786<212>DNA<213>三孢布拉霉(Blakeslea trispora)<220>CDS<221>carRP<222>5688...7581<220>外顯子<222>5688...6092<220>外顯子<222>6163...7581<223>直接來源質(zhì)粒pALBT9(CECT 5982)和pALBT52(CECT 5981).
<223>β-胡蘿卜素生物合成基因。
<400>
GGGCTCACTT GTATCATCAC TGTTGTTAAT AAATTGTTGA GAATAAAGCT TGGATTGTAT60ACGACTGAGC CAGTTGGAGC CACTTGTAGG CCTTGTGGGT GATACAACAG CAGGCTTTGA 120TACAGTGGTA TTTATTTCTG GCCTAAACTT CAATATACTT TTTGGACTGT TCATGCCTTG 180ATATAACAAA ATAAAATAAA AAGGGACCTT GTACACTGAA AGCCAAATGA ATAAAATAAA 240AAATAAAAAA TAAAAAGTTA TTTGCAGAAA CCCAAAAAGC CCGAAATTTC TTCTAAAAGA 300AAGAAAATAA AAAAAAAGAG AGACTTACTT TTAGGCGATC AACAGTCTTT TTTTTTTGCT 360TGAGCTTCTT TTAAGCTTTA CATTTAGGCA CTTTTATAAT TGCTGTATTG AATATGACAT 420CTATCTTTTT TAACTTGAAC GATTTGTAGC TGTTTTCTCT TGACAATGTT AATTTTAAAG 480CATGATTTTT TTTCTGAAAA AATAAAGACC GCTTACATAA TACAAAAGTC AGAATTGTAT 540GGCTATTTTA TCCTGTCTCT TCTTTTCAGG AACTCAACCA TCTCCTTGTC TTTATTGTCT 600GAGAATGCTT TATCTGACTC TTATTAATCC TTTGAGAAAC CAAAAATGGG GTGGATTGAG 660ACTTGGACTC GCTTTGTGCA TTTGCTCCTT CTGTTCGATC ATTATTGAGC AATGTCATAC 720AAACATTCAA TGACAAGCAA CATCAAACTA GGAGACAGAT TAAGCAAGCA GATGATTTAT 780AAAGGGCTAC TCTGCTCATT GATTTACATG CTTTAGCATC ATGAATTGTG TTGCTTCCAT 840TCCAAAATAG ATGTCTTTTT CTCTTTCCAC TTGCCTCTTT CTTTTTTTGG CTATTCAGCA 900TAATGCAAGA GTAGCTATTC CTCAACCCAT CAGTAATAAG TGAATGGCAC GGTAGCATTG 960TGTTTGTATG TTTTCTATCT GCGTTTTGAT TTTCGAATCT CATCTTTAGG ATAGTATCTT 1020GAGATTGTAT TGATTTTGCC TGATACACTT TTGTTTTTGT GAATATGAGC TTCAGGGAAG 1080TGATCTGTTT AAGTACAATT GAAATAAAGT GATAGTCTTT GAGGTTTGGT ATATGGCTTT 1140CTAAAGCATG GACAGAGCCA TGACAAAAAA AAGGGCGGTA TAAAGCCTCA GATAACTCCC 1200TCTCTTGCAC TCTGACAAAT GTAGTACAGG CTTATTGCCA ATGGAATGAC TCAATAGATG 1260GCTAAATGTG AAGAAAAACG TATTGGAAAA GCCTACAAAA CTTTCCTTAA TAAACATCAT 1320GGCCATCTTT TTTGAAAGAT TTCAAAGACT AGGTTAAAAA TACCATTACT ATCATCTTGC 1380TTCTAGTCCT CTGACTATTT CTTTGTTTTC AACAACACGT GTAGGAAGGA CAAGAAAGAT 1440GTAAGCGACA GAATAGCTTA GTTTTACTAT ACTCTACTTC TTTTTTTTTT GTAGTTTTCC 1500ATCTTCCTTG CTTTGAAGAT AGACAATTTT ACTCACACAA TTTCTTTTTC GTTAAAGCTG 1560ATAGCTTGAA TATCATCATA TCAAACAGAA GACATATATC GCTAAATAGT ACTTGCTATA 1620
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CTTACCAAAC AAGTGCAAGC GAAAGATTTC AGGCACATAC TGAAGACGAA TCAAATCCCA 4620AATGGTTTCA AAGTTGCGCT TGATAGCAAT AAATGTACCT TGTTCATAAT GGACATGTGT 4680TTCCTTCATG AAATCCAAGA ATCTACCAAA TCCAAGGGGA CCCTCAATAC GGTCCAATTC 4740GCCCTTCATC TTGGTTAAAT CGGAAGAGAG TTGTACGGCA TCACCGTCGT CAAAATGAAC 4800CTTATAGTTA TTGTCACAGC GAAGCAAATC CAAATGATCA CCAATACGTT CATCCAAATC 4860AGCAAATGCA TCTTCAAAAA GCTTAGGCAT CAAATAGAGT GAGGGACCCT GATCAAAGCG 4920ATGACCATCG TGATGAATGA ATGAACAACG GCCACCGGAA AAGTCGTTCT TTTCAACAAC 4980AGTAACTCGA AAACCTTCAC GAGCAAGACG AGCAGCAGTA GCAGTTCCGC CAATACCGGC 5040ACCAATGACA ACAATATGCT TCTTTTGATC AGACATGAGA TTAAAATAGA TAAGGAAAAG 5100AAAGTGAAAA GAAATTCGGA AGCATGGCAC ATTCTTCTTT TTATAAATAC ATGCCTGACT 5160TTCTTTTTCC ATCGATATGA TATATGCATA TGATAGATAT ACAAGCAATC TTCTTCAAGG 5220AGTTTGAAAT TTTGTCCTCC AGGAGCAAAA AAAAGTTTTT TTTTATACAT GTTTGTACAC 5280AAGAATAGTT ACCAATTTGC TTTGGTCTTA CGTGCTGCAA GTTTATATCG TTTTCAATTT 5340CTTTGTCTTT ACATTTTCTT TGTCCTTTAT CTTTCCTCAT TTAGTCTTTG GGAGAATTAG 5400GAAAAGGGAG CGGAAAGGTA AGAAATGCTT GCGTATTTTA CTAATTCGGC AAACATCCAA 5460TTTGGCAAAC AGCAGCCTGT GCAACGCTCT CGAGATGACA GTATCTTTGA TTACACTCTA 5520AATCTCGATG ACCCGACCAA AAAGAGCGAA CAAAGAAATA ATCTTGTGCA TTCGAATATG 5580ATGGAAGATT TTTTCCCCCT TATTCTAAAT GTTGACATAG CGTGTATGTT ATATAAACAA 5640AAAGAAATTG TACAAACTTT CTTTTCTTCT CTTTTTATTT TATCTCT ATG TCA ATA5696Met Ser Ile1CTC ACT TAT CTG GAA TTT CAT CTC TAC TAT ACA CTA CCT GTC CTT GCG5744Leu Thr Tyr Leu Glu Phe His Leu Tyr Tyr Thr Leu Pro Val Leu Ala5 10 15GCA TTG TGT TGG CTG CTA AAG CCG TTT CAC TCA CAG CAA GAC AAT CTC5792Ala Leu Cys Trp Leu Leu Lys Pro Phe His Ser Gln Gln Asp Asn Leu20 25 30 35AAG TAT AAA TTT TTA ATG TTG ATG GCC GCC TCT ACC GCA TCG ATT TGG5840Lys Tyr Lys Phe Leu Met Leu Met Ala Ala Ser Thr Ala Ser Ile Trp40 45 50GAC AAT TAT ATC GTT TAT CAT CGC GCT TGG TGG TAC TGT CCT ACT TGT5888Asp Asn Tyr Ile Val Tyr His Arg Ala Trp Trp Tyr Cys Pro Thr Cys55 60 65GTT GTG GCT GTC ATT GGC TAT GTA CCT CTA GAA GAA TAC ATG TTC TTT5936Val Val Ala Val Ile Gly Tyr Val Pro Leu Glu Glu Tyr Met Phe Phe70 75 80ATC ATC ATG ACT TTA ATG ACT GTC GCG TTC TCA AAC TTT GTT ATG CGT5984Ile Ile Met Thr Leu Met Thr Val Ala Phe Ser Asn Phe Val Met Arg85 90 95TGG CAC TTG CAT ACT TTC TTT ATT AGA CCC AAC ACT TCT TGG AAG CAA6032Trp His Leu His Thr Phe Phe Ile Arg Pro Asn Thr Ser Trp Lys Gln100 105 110 115ACA CTA TTA GTA CGC CTT GTG CCT GTT TCA GCT TTA TTG GCA ATC ACT6080Thr Leu Leu Val Arg Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Leu Ala Ile Thr120 125 130TAT CAT GCT TGG GTATGCAAAA TAAACAAACA CTAAAAAAAA ATAATAGCGA6132Tyr His Ala Trp135TAATTATTTT ACTCATTTTT CTTTTTTTAG CAC TTG ACA CTG CCA AAT AAA TCT 6186
His Leu Thr Leu Pro Asn Lys Ser140TCA TTT TAT GGT TCA TGC ATC CTT TGG TAT GCT TGT CCT GTG TTG GCT 6234Ser Phe Tyr Gly Ser Cys Ile Leu Trp Tyr Ala Cys Pro Val Leu Ala145 150 155ATT CTT TGG CTG GGT GCT GGT GAA TAT ATC TTG CGT CGA CCT GTG GCT 6282Ile Leu Trp Leu Gly Ala Gly Glu Tyr Ile Leu Arg Arg Pro Val Ala160 165 170 175GTC CTT TTG TCT ATT GTT ATC CCT AGT GTA TAC CTA TGT TGG GCT GAT 6330Val Leu Leu Ser Ile Val Ile Pro Ser Val Tyr Leu Cys Trp Ala Asp180 185 190ATC GTC GCT ATT AGT GCT GGC ACA TGG CAT ATT TCT CTT AGA ACA AGC 6378Ile Val Ala Ile Ser Ala Gly Thr Trp His Ile Ser Leu Arg Thr Ser195 200 205ACT GGC AAA ATG GTA GTA CCC GAT TTA CCT GTA GAA GAA TGC CTG TTT 6426Thr Gly Lys Met Val Val Pro Asp Leu Pro Val Glu Glu Cys Leu Phe210 215 220TTT ACT TTG ATC AAC ACA GTC TTG GTT TTT GCT ACC TGT GCT ATA GAC 6474Phe Thr Leu Ile Asn Thr Val Leu Val Phe Ala Thr Cys Ala Ile Asp225 230 235CGC GCT CAG GCC ATC CTC CAT CTG TAC AAA TCA TCT GTT CAA AAT CAA 6522Arg Ala Gln Ala Ile Leu His Leu Tyr Lys Ser Ser Val Gln Asn Gln240 245 250 255AAC CCT AAA CAA GCC ATT TCC CTT TTC CAG CAT GTC AAA GAG CTA GCA 6570Asn Pro Lys Gln Ala Ile Ser Leu Phe Gln His Val Lys Glu Leu Ala260 265 270TGG GCC TTC TGT CTT CCT GAC CAA ATG CTC AAC AAT GAA TTG TTT GAT 6618Trp Ala Phe Cys Leu Pro Asp Gln Met Leu Asn Asn Glu Leu Phe Asp275 280 285GAT CTT ACT ATC AGC TGG GAT ATT TTA CGT AAA GCC TCA AAG TCA TTC 6666Asp Leu Thr Ile Ser Trp Asp Ile Leu Arg Lys Ala Ser Lys Ser Phe290 295 300TAT ACT GCA TCT GCC GTT TTT CCA AGT TAT GTA CGT CAA GAC TTG GGT 6714Tyr Thr Ala Ser Ala Val Phe Pro Ser Tyr Val Arg Gln Asp Leu Gly305 310 315GTT CTC TAT GCT TTC TGC AGA GCT ACC GAT GAC CTG TGC GAT GAT GAA 6762Val Leu Tyr Ala Phe Cys Arg Ala Thr Asp Asp Leu Cys Asp Asp Glu320 325 330 335TCC AAA TCT GTT CAA GAA AGA AGA GAC CAA TTA GAT CTT ACT CGA CAA 6810Ser Lys Ser Val Gln Glu Arg Arg Asp Gln Leu Asp Leu Thr Arg Gln340 345 350TTT GTT CGT GAT CTC TTT AGC CAA AAG ACC AGT GCG CCT ATT GTG ATT 6858Phe Val Arg Asp Leu Phe Ser Gln Lys Thr Ser Ala Pro Ile Val Ile355 360 365GAT TGG GAA TTG TAT CAA AAC CAA CTT CCT GCT TCT TGT ATA TCA GCC 6906Asp Trp Glu Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Pro Ala Ser Cys Ile Ser Ala370 375 380
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TCTTCAGATT GATAGAGGTT GTATACACTC AACAGAGCAA TCTTGGCACG TTCGCTTCCT 7874TTTAGATGAG CTCTTGTAGG ATATGTTGTC TTCTGCTGCT TGAGTACAGA TCCAATTGCA 7934GCATATACTT GGCAAGCAGC TCGTACACCG CCTTGACAGT TTGCCGGCAA CTTGTCAATG 7994CCCTTCTTAG CTCTCACCAT GATAGCGTCT GCCTTTCCTA CAAGCTTCAG AGACAAGCCC 8054AACAGTCTTT GATCACCTAG GCTACGGGCG TTGCCTTGCT GTATTTGTTC TGTTTCTTCT 8114TTTCTAAGCC ATTGTTGAGG CAGATAACAT CGACCCAACA TCCTCGAGCC ATACTACAGC 8174ATAAAAGGAT ACGTTTTCTT TAACAGAAAT TTACCCTTTT GTTATCAGCA CATACAAAAA 8234AAAAGAAATT TAAGATGAGT AGGACTTCCA TTCTCTCAAA AATTTTATTC AATCCATAAA 8294TGAATTATTT TTGGACAAAA AAGAAAGATT ATGCCTGATT TTCTCTATTT TTTTTTTTTT 8354TACAACTCCA CCAATACTTT CTAGAGACAC ATTTGAGCGA TGTGACAGTC GGACTCGAGA 8414AGTACAAGAA GGTACAGAAA TAGCAGCTGA GCGTATGATT GGGTCCCAAG GTTCTTCTCG 8474ACTTTCTCTC TTACCCTGGA ACAGAGAGAA AAAAAAAATA TTTCGTCTTT TTTGGATAAT 8434ATTATAAAAA AGGGAATTTA GTAAAGAAAA CGGTTGTTTC CTTTTCTTTT TTTTTTTCCT 8494TCTCCACTAC ATGAATAAAC ATCGCCACCC AAATTTACCT TCCATATCTA CTCTACTTAC 8554TGGACCACCT TCTCCGCCAC CTCCCATTAT TGTGATAGAT GAGGAACATT CTCCCAGTTG 8614TTCACCTAAC AAATACCACT TGTCTCCTGT CTTATCACCT ATTGATTCAT ATGCTTCATC 8674ACCAAACTCG AG 8786<210>SEQ ID NO2<211>8786<212>DNA<213>三孢布拉霉<220>CDS<221>carB 3711...5665<220>外顯子3711...4303<220>外顯子4445...5293<220>外顯子5362...5665<223>直接來源質(zhì)粒pALBT9(CECT 5982)和pALBT52(CECT 5981)。
<223>β-胡蘿卜素生物合成基因。
<400>
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GCTCCTGGAG GACAAAATTT CAAACTCCTT GAAGAAGATT GCTTGTATAT CTATCATATG 3600CATATATCAT ATCGATGGAA AAAGAAAGTC AGGCATGTAT TTATAAAAAG AAGAATGTGC 3660CATGCTTCCG AATTTCTTTT CACTTTCTTT TCCTTATCTA TTTTAATCTC ATG TCT 3716Met Ser1GAT CAA AAG AAG CAT ATT GTT GTC ATT GGT GCC GGT ATT GGC GGA ACT 3764Asp Gln Lys Lys His Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Ile Gly Gly Thr5 10 15GCT ACT GCT GCT CGT CTT GCT CGT GAA GGT TTT CGA GTT ACT GTT GTT 3812Ala Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg Glu Gly Phe Arg Val Thr Val Val20 25 30GAA AAG AAC GAC TTT TCC GGT GGC CGT TGT TCA TTC ATT CAT CAC GAT 3860Glu Lys Asn Asp Phe Ser Gly Gly Arg Cys Ser Phe Ile His His Asp35 40 45 50GGT CAT CGC TTT GAT CAG GGT CCC TCA CTC TAT TTG ATG CCT AAG CTT 3908Gly His Arg Phe Asp Gln Gly Pro Ser Leu Tyr Leu Met Pro Lys Leu55 60 65TTT GAA GAT GCA TTT GCT GAT TTG GAT GAA CGT ATT GGT GAT CAT TTG 3956Phe Glu Asp Ala Phe Ala Asp Leu Asp Glu Arg Ile Gly Asp His Leu70 75 80GAT TTG CTT CGC TGT GAC AAT AAC TAT AAG GTT CAT TTT GAC GAC GGT 4004Asp Leu Leu Arg Cys Asp Asn Asn Tyr Lys Val His Phe Asp Asp Gly85 90 95GAT GCC GTA CAA CTC TCT TCC GAT TTA ACC AAG ATG AAG GGC GAA TTG 4052Asp Ala Val Gln Leu Ser Ser Asp Leu Thr Lys Met Lys Gly Glu Leu100 105 110GAC CGT ATT GAG GGT CCC CTT GGA TTT GGT AGA TTC TTG GAT TTC ATG 4100Asp Arg Ile Glu Gly Pro Leu Gly Phe Gly Arg Phe Leu Asp Phe Met115 120 125 130AAG GAA ACA CAT GTC CAT TAT GAA CAA GGT ACA TTT ATT GCT ATC AAG 4148Lys Glu Thr His Val His Tyr Glu Gln Gly Thr Phe Ile Ala Ile Lys135 140 145CGC AAC TTT GAA ACC ATT TGG GAT TTG ATT CGT CTT CAG TAT GTG CCT 4196Arg Asn Phe Glu Thr Ile Trp Asp Leu Ile Arg Leu Gln Tyr Val Pro150 155 160GAA ATC TTT CGC TTG CAC TTG TTT GGT AAG ATC TAT GAC CGA GCC AGT 4244Glu Ile Phe Arg Leu His Leu Phe Gly Lys Ile Tyr Asp Arg Ala Ser165 170 175AAA TAT TTC CAA ACC AAG AAA ATG CGT ATG GCT TTT ACT TTT CAA ACA 4292Lys Tyr Phe Gln Thr Lys Lys Met Arg Met Ala Phe Thr Phe Gln Thr180 185 190ATG TAT ATG GG GTAAGTACAC ATACAACGCG TGGTGTGGGA TGAAAAAAAA4343Met Tyr Met Gly195ATGAGTGAGA CCGGTCGGGG GTGGGAAAAG AGAAATGTGA AAAAGGGCAA GTGAAAGGAA 4403TTTTGATATT CATTGTTCTA TTTTCTATTT TTGGAATATA G T ATG TCG CCT TAT 4457Met Ser Pro Tyr200GAT GCT CCA GCA GTT TAC AGT TTG TTA CAA TAC ACC GAG TTT GCT GAA 4505
Asp Ala Pro Ala Val Tyr Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Glu Phe Ala Glu205 210 215GGT ATC TGG TAT CCT CGT GGT GGT TTC AAC ATG GTT GTT CAG AAG CTT 4553Gly Ile Trp Tyr Pro Arg Gly Gly Phe Asn Met Val Val Gln Lys Leu220 225 230GAG TCT ATC GCC TCC AAA AAG TAC GGT GCT GAA TTC AGA TAT CAA TCG 4601Glu Ser Ile Ala Ser Lys Lys Tyr Gly Ala Glu Phe Arg Tyr Gln Ser235 240 245 250CCT GTT GCT AAA ATT AAC ACT GTC GAT AAA GAC AAG CGT GTA ACC GGT 4649Pro Val Ala Lys Ile Asn Thr Val Asp Lys Asp Lys Arg Val Thr Gly255 260 265GTC ACT TTG GAA AGC GGA GAA GTC ATT GAA GCC GAT GCA GTC GTA TGT 4697Val Thr Leu Glu Ser Gly Glu Val Ile Glu Ala Asp Ala Val Val Cys270 275 280AAT GCG GAT CTT GTT TAT GCT TAT CAC CAT CTG TTA CCT CCT TGC AAT 4745Asn Ala Asp Leu Val Tyr Ala Tyr His His Leu Leu Pro Pro Cys Asn285 290 295TGG ACA AAG AAG ACA TTA GCC TCA AAG AAA CTC ACT TCA TCA TCT ATT 4793Trp Thr Lys Lys Thr Leu Ala Ser Lys Lys Leu Thr Ser Ser Ser Ile300 305 310TCG TTT TAT TGG TCC ATG TCA ACA AAG GTG CCT CAA TTA GAC GTA CAC 4841Ser Phe Tyr Trp Ser Met Ser Thr Lys Val Pro Gln Leu Asp Val His315 320 325 330AAT ATC TTC TTG GCT GAA GCC TAC AAG GAA AGT TTT GAT GAG ATT TTC 4889Asn Ile Phe Leu Ala Glu Ala Tyr Lys Glu Ser Phe Asp Glu Ile Phe335 340 345AAC GAC TTC GGT TTG CCC TCT GAA GCT TCA TTC TAT GTC AAC GTT CCA 4937Asn Asp Phe Gly Leu Pro Ser Glu Ala Ser Phe Tyr Val Asn Val Pro350 355 360TCT CGA ATT GAT GAA TCT GCC GCA CCT CCC AAC AAG GAC TCC ATT ATT 4985Ser Arg Ile Asp Glu Ser Ala Ala Pro Pro Asn Lys Asp Ser Ile Ile365 370 375GTG TTG GTT CCA ATT GGC CAT ATG AAG AGT AAG ACA GGA AAC AGT GCT 5033Val Leu Val Pro Ile Gly His Met Lys Ser Lys Thr Gly Asn Ser Ala380 385 390GAA GAA AAT TAT CCT GAG TTG GTA AAC CGT GCA CGC AAG ATG GTT CTG 5081Glu Glu Asn Tyr Pro Glu Leu Val Asn Arg Ala Arg Lys Met Val Leu395 400 405 410GAA GTT ATC GAA CGT CGT TTG GGA GTA AAC AAC TTT GCT AAT TTG ATT 5129Glu Val Ile Glu Arg Arg Leu Gly Val Asn Asn Phe Ala Asn Leu Ile415 420 425GAA CAT GAA GAA GTG AAT GAT CCT AGT GTT TGG CAA AGC AAG TTT AAC 5177Glu His Glu Glu Val Asn Asp Pro Ser Val Trp Gln Ser Lys Phe Asn430 435 440CTT TGG AGA GGT TCT ATT CTT GGT CTT TCT CAT GAT GTG TTC CAA GTT 5225Leu Trp Arg Gly Ser Ile Leu Gly Leu Ser His Asp Val Phe Gln Val445 450 455CTC TGG TTC AGA CCT AGT ACC AAG GAT TCC ACA AAC CGT TAT GAT AAT 5273
Leu Trp Phe Arg Pro Ser Thr Lys Asp Ser Thr Asn Arg Tyr Asp Asn460 465 470CTT TTC TTT GTC GGA GCT AG GTAATACTTT TGCCCTCTTT TTTTCTTTTT 5323Leu Phe Phe Val Gly Ala Ser475 480TTTAATAACG CACGTACTCA TTTCTCTTTT CTTTGTAG T ACA CAT CCA GGT ACT 5377Thr His Pro Gly Thr485GGT GTT CCT ATC GTT CTT GCT GGA AGT AAG CTT ACT TCC GAC CAA GTC 5425Gly Val Pro Ile Val Leu Ala Gly Ser Lys Leu Thr Ser Asp Gln Val490 495 500TGT AAA AGC TTT GGC CAG AAT CCC TTA CCA AGA AAG TTA CAA GAT AGC 5473Cys Lys Ser Phe Gly Gln Asn Pro Leu Pro Arg Lys Leu Gln Asp Ser505 510 515CAA AAG AAG TAT GCT CCT GAA CAA ACT CGT AAG ACC GAA AGC CAT TGG 5521Gln Lys Lys Tyr Ala Pro Glu Gln Thr Arg Lys Thr Glu Ser His Trp520 525 530ATC TAT TAT TGT CTT GCT TGT TAC TTT GTT ACT TTC CTC TTT TTC TAT 5569Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Cys Tyr Phe Val Thr Phe Leu Phe Phe Tyr535 540 545 550TTC TTC CCA AGA GAT GAT ACT ACA ACT CCT GCT TCT TTC ATT AAC CAA 5617Phe Phe Pro Arg Asp Asp Thr Thr Thr Pro Ala Ser Phe Ile Asn Gln555 560 565CTT TTA CCT AAC GTT TTC CAA GGA CAA AAC AGC AAC GAT ATT CGC ATT 5665Leu Leu Pro Asn Val Phe Gln Gly Gln Asn Ser Asn Asp Ile Arg Ile570 575 580TAGT TCAATAATAA AGCTACCATT TTAACATCAT ATGAACTTAA CCATTTAAAT5719GTATCACTCT GTGTCTGCGT TCTCTTTGAT CATAGAATTC TTTCTTTTTT TGTGCGTATA 5779TTTGTATCCA TTATCTAGCA CGTCATTAAA TTGGTGTATG TTGATCCTTT CGAATGGAAT 5839GAATTCTAGA ATAGTGTCTA AAAAGACAAT TCACATGTGT ATCAGAATCA GCTCAAACAA 5899AGAAACCCAA AATAAATGAC TCGACGCAAA TAGAAAACTG AATTGTTTGG TAGGACAGAC 5959AATTCTACAA ACAAATATTG GAAAAACAAA TTATCCTGAT TTTAGAAAAA ATAATCGAAT 6019TTAGTTTTAT TATGATATGC ACAAATTTTG TTTCTACTAA ATGTGGTATT TGATTGAGAG 6079TAACCATTAA AAATCAATCC TAGCAAACAT TTCTTTTTAA AAATAAGGCA AAGGAGCCAT 6139ACATAGATCA AGCACAGCAT TATCCAAAAA AGCAAAACAC GTCTGTAAGG TAGGTGAGTG 6199ATACGAGTCT TGCGTAAAAA AAGAAAATAA TCATTAGCTT GGGAGGGTTT TCAAGACAAT 6259GAAATGGTAA AAAAAAAAAC GGTATTCTAA AAGGACTAAC CTTAAAACGA AAATAGAGAT 6319TTTTCGTTTG AAACGTCATA ATCATAACAT TCACCGGAGT TGCTGGTGTG TTTCTTTTAC 6379TAAACCAAAG AGTAAAGCAT CCTCACTTGA TCTGATTAAA CATGTCAAAC AAAACATTTC 6439AACAGACACA ATGTCTCTTT GTTGATATTG CAAAGAAGCA TAAACAGTGG CTTTGTGTAG 6499TACCTAAATT ACTATTCTCT TGAAAGCCAT AGCTTTGATA AGCTTTTTTC TCCCTTTGGC 6559TTGATTGCTT ATTGCCACAT CTAGAAAAGT GGTTTTACTT TGCCTGATAG AAAATAAAAA 6619CGTTCTTTTC ATTGTGCTTA TCTTAACTTT AGACTTATTT TTAACCCATC TCAATTGCAA 6679CAAGCGATCT ACAAGACCTT TTTGGTAAAG GTTCAGTCTT CAAATAACAT GATTACTCAG 6739TGTTTATAAC ACCAAATTAA TGCGGATGCT TCCTCAAAAA TACATTCAAG TGTAACATAC 6799TCCTCTTCCT CTCCCTTTTT ATTCGGGCAT GCAGTAAAAG AATCTCGGTG GATTTGCCCT 6859TTGTCAAGCA ATATAGCTTT TCTTTGTAAG ATTGTTTCAA GAAAAACAGA GATTTAGCTC 6919ATGATAGCTA GCAAATTCTT TTTCTTTTCT TTGAGCTTTG AATTAAGACT GCACCACATC 6979GTTAAAGCAA AATTGTTATC ATTCTAGACT GCAATATATT TTCATTGTAC TTTAACTATT 7039
AGTTAAAGTT TTGAGCAACA GTATTGTTGT GTGTATGTGT CACATTCTAC GGTGTTTGTC 7099AGTTTTTTTT AAGGAAAGTC GTCTACGGCG ATAAGCATCA GAGTTGCACA TGGATCGCTT 7159TCTCTGTTAT AGCAAGTACT ATTTAGCGAT ATATGTCTTC TGTTTGATAT GATGATATTC 7219AAGCTATCAG CTTTAACGAA AAAGAAATTG TGTGAGTAAA ATTGTCTATC TTCAAAGCAA 7279GGAAGATGGA AAACTACAAA AAAAAAAGAA GTAGAGTATA GTAAAACTAA GCTATTCTGT 7339CGCTTACATC TTTCTTGTCC TTCCTACACG TGTTGTTGAA AACAAAGAAA TAGTCAGAGG 7399ACTAGAAGCA AGATGATAGT AATGGTATTT TTAACCTAGT CTTTGAAATC TTTCAAAAAA 7459GATGGCCATG ATGTTTATTA AGGAAAGTTT TGTAGGCTTT TCCAATACGT TTTTCTTCAC 7519ATTTAGCCAT CTATTGAGTC ATTCCATTGG CAATAAGCCT GTACTACATT TGTCAGAGTG 7579CAAGAGAGGG AGTTATCTGA GGCTTTATAC CGCCCTTTTT TTTGTCATGG CTCTGTCCAT 7639GCTTTAGAAA GCCATATACC AAACCTCAAA GACTATCACT TTATTTCAAT TGTACTTAAA 7699CAGATCACTT CCCTGAAGCT CATATTCACA AAAACAAAAG TGTATCAGGC AAAATCAATA 7759CAATCTCAAG ATACTATCCT AAAGATGAGA TTCGAAAATC AAAACGCAGA TAGAAAACAT 7819ACAAACACAA TGCTACCGTG CCATTCACTT ATTACTGATG GGTTGAGGAA TAGCTACTCT 7879TGCATTATGC TGAATAGCCA AAAAAAGAAA GAGGCAAGTG GAAAGAGAAA AAGACATCTA 7939TTTTGGAATG GAAGCAACAC AATTCATGAT GCTAAAGCAT GTAAATCAAT GAGCAGAGTA 7999GCCCTTTATA AATCATCTGC TTGCTTAATC TGTCTCCTAG TTTGATGTTG CTTGTCATTG 8059AATGTTTGTA TGACATTGCT CAATAATGAT CGAACAGAAG GAGCAAATGC ACAAAGCGAG 8119TCCAAGTCTC AATCCACCCC ATTTTTGGTT TCTCAAAGGA TTAATAAGAG TCAGATAAAG 8179CATTCTCAGA CAATAAAGAC AAGGAGATGG TTGAGTTCCT GAAAAGAAGA GACAGGATAA 8239AATAGCCATA CAATTCTGAC TTTTGTATTA TGTAAGCGGT CTTTATTTTT TCAGAAAAAA 8299AATCATGCTT TAAAATTAAC ATTGTCAAGA GAAAACAGCT ACAAATCGTT CAAGTTAAAA 8359AAGATAGATG TCATATTCAA TACAGCAATT ATAAAAGTGC CTAAATGTAA AGCTTAAAAG 8419AAGCTCAAGC AAAAAAAAAA GACTGTTGAT CGCCTAAAAG TAAGTCTCTC TTTTTTTTTA 8479TTTTCTTTCT TTTAGAAGAA ATTTCGGGCT TTTTGGGTTT CTGCAAATAA CTTTTTATTT 8539TTTATTTTTT ATTTTATTCA TTTGGCTTTC AGTGTACAAG GTCCCTTTTT ATTTTATTTT 8599GTTATATCAA GGCATGAACA GTCCAAAAAG TATATTGAAG TTTAGGCCAG AAATAAATAC 8659CACTGTATCA AAGCCTGCTG TTGTATCACC CACAAGGCCT ACAAGTGGCT CCAACTGGCT 8719CAGTCGTATA CAATCCAAGC TTTATTCTCA ACAATTTATT AACAACAGTG ATGATACAAG 8779TGAGCCC8786<210>SEQ ID NO3<211>608<212>多肽<213>推斷的<223>Pm 69581Da<223>序列類型由三孢布拉霉的carRP基因編碼的推斷的氨基酸序列。
<400>
Met Ser Ile Leu Thr Tyr Leu Glu Phe His Leu Tyr Tyr Thr1 5 10Leu Pro Val Leu Ala Ala Leu Cys Trp Leu Leu Lys Pro Phe His Ser15 20 25 30Gln Gln Asp Asn Leu Lys Tyr Lys Phe Leu Met Leu Met Ala Ala Ser35 40 45Thr Ala Ser Ile Trp Asp Asn Tyr Ile Val Tyr His Arg Ala Trp Trp50 55 60
Tyr Cys Pro Thr Cys Val Val Ala Val Ile Gly Tyr Val Pro Leu Glu65 70 75Glu Tyr Met Phe Phe Ile Ile Met Thr Leu Met Thr Val Ala Phe Ser80 85 90Asn Phe Val Met Arg Trp His Leu His Thr Phe Phe Ile Arg Pro Asn95 100 105 110Thr Ser Trp Lys Gln Thr Leu Leu Val Arg Leu Val Pro Val Ser Ala115 120 125Leu Leu Ala Ile Thr Tyr His Ala Trp His Leu Thr Leu Pro Asn Lys130 135 140Ser Ser Phe Tyr Gly Ser Cys Ile Leu Trp Tyr Ala Cys Pro Val Leu145 150 155Ala Ile Leu Trp Leu Gly Ala Gly Glu Tyr Ile Leu Arg Arg Pro Val160 165 170Ala Val Leu Leu Ser Ile Val Ile Pro Ser Val Tyr Leu Cys Trp Ala175 180 185 190Asp Ile Val Ala Ile Ser Ala Gly Thr Trp His Ile Ser Leu Arg Thr195 200 205Ser Thr Gly Lys Met Val Val Pro Asp Leu Pro Val Glu Glu Cys Leu210 215 220Phe Phe Thr Leu Ile Asn Thr Val Leu Val Phe Ala Thr Cys Ala Ile225 230 235Asp Arg Ala Gln Ala Ile Leu His Leu Tyr Lys Ser Ser Val Gln Asn240 245 250Gln Asn Pro Lys Gln Ala Ile Ser Leu Phe Gln His Val Lys Glu Leu255 260 265 270Ala Trp Ala Phe Cys Leu Pro Asp Gln Met Leu Asn Asn Glu Leu Phe275 280 285Asp Asp Leu Thr Ile Ser Trp Asp Ile Leu Arg Lys Ala Ser Lys Ser290 295 300Phe Tyr Thr Ala Ser Ala Val Phe Pro Ser Tyr Val Arg Gln Asp Leu305 310 315Gly Val Leu Tyr Ala Phe Cys Arg Ala Thr Asp Asp Leu Cys Asp Asp320 325 330Glu Ser Lys Ser Val Gln Glu Arg Arg Asp Gln Leu Asp Leu Thr Arg335 340 345 350Gln Phe Val Arg Asp Leu Phe Ser Gln Lys Thr Ser Ala Pro Ile Val355 360 365Ile Asp Trp Glu Leu Tyr Gln Asn Gln Leu Pro Ala Ser Cys Ile Ser370 375 380Ala Phe Arg Ala Phe Thr Arg Leu Arg His Val Leu Glu Val Asp Pro385 390 395Val Glu Glu Leu Leu Asp Gly Tyr Lys Trp Asp Leu Glu Arg Arg Pro400 405 410Ile Leu Asp Glu Gln Asp Leu Glu Ala Tyr Ser Ala Cys Val Ala Ser415 420 425 430Ser Val Gly Glu Met Cys Thr Arg Val Ile Leu Ala Gln Asp Gln Lys435 440 445
Glu Asn Asp Ala Trp Ile Ile Asp Arg Ala Arg Glu Met Gly Leu Val450 455 460Leu Gln Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asp Ile Val Thr Asp Ser Glu Thr465 470 475Leu Gly Arg Cys Tyr Leu Pro Gln Gln Trp Leu Arg Lys Glu Glu Thr480 485 490Glu Gln Ile Gln Gln Gly Asn Ala Arg Ser Leu Gly Asp Gln Arg Leu495 500 505 510Leu Gly Leu Ser Leu Lys Leu Val Gly Lys Ala Asp Ala Ile Met Val515 520 525Arg Ala Lys Lys Gly Ile Asp Lys Leu Pro Ala Asn Cys Gln Gly Gly530 535 540Val Arg Ala Ala Cys Gln Val Tyr Ala Ala Ile Gly Ser Val Leu Lys545 550 555Gln Gln Lys Thr Thr Tyr Pro Thr Arg Ala His Leu Lys Gly Ser Glu560 565 570Arg Ala Lys Ile Ala Leu Leu Ser Val Tyr Asn Leu Tyr Gln Ser Glu575 580 585 590Asp Lys Pro Val Ala Leu Arg Gln Ala Arg Lys Ile Lys Ser Phe Phe595 600 605Val Asp<210>SEQ ID NO4<211>582<212>3<213>3<223>Pm 66426DA<223>序列類型由三孢布拉霉的carB基因編碼的推斷的氨基酸序列。
<400>
Met Ser Asp Gln Lys Lys His Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Ile Gly1 5 10 15Gly Thr Ala Thr Ala Ala Arg Leu Ala Arg Glu Gly Phe Arg Val Thr20 25 30Val Val Glu Lys Asn Asp Phe Ser Gly Gly Arg Cys Ser Phe Ile His35 40 45His Asp Gly His Arg Phe Asp Gln Gly Pro Ser Leu Tyr Leu Met Pro50 55 60Lys Leu Phe Glu Asp Ala Phe Ala Asp Leu Asp Glu Arg Ile Gly Asp65 70 75 80His Leu Asp Leu Leu Arg Cys Asp Asn Asn Tyr Lys Val His Phe Asp85 90 95Asp Gly Asp Ala Val Gln Leu Ser Ser Asp Leu Thr Lys Met Lys Gly100 105 110Glu Leu Asp Arg Ile Glu Gly Pro Leu Gly Phe Gly Arg Phe Leu Asp115 120 125
Phe Met Lys Glu Thr His Val His Tyr Glu Gln Gly Thr Phe Ile Ala130 135 140Ile Lys Arg Asn Phe Glu Thr Ile Trp Asp Leu Ile Arg Leu Gln Tyr145 150 155 160Val Pro Glu Ile Phe Arg Leu His Leu Phe Gly Lys Ile Tyr Asp Arg165 170 175Ala Ser Lys Tyr Phe Gln Thr Lys Lys Met Arg Met Ala Phe Thr Phe180 185 190Gln Thr Met Tyr Met Gly Met Ser Pro Tyr Asp Ala Pro Ala Val Tyr195 200 205Ser Leu Leu Gln Tyr Thr Glu Phe Ala Glu Gly Ile Trp Tyr Pro Arg210 215 220Gly Gly Phe Asn Met Val Val Gln Lys Leu Glu Ser Ile Ala Ser Lys225 230 235 240Lys Tyr Gly Ala Glu Phe Arg Tyr Gln Ser Pro Val Ala Lys Ile Asn245 250 255Thr Val Asp Lys Asp Lys Arg Val Thr Gly Val Thr Leu Glu Ser Gly260 265 270Glu Val Ile Glu Ala Asp Ala Val Val Cys Asn Ala Asp Leu Val Tyr275 280 285Ala Tyr His His Leu Leu Pro Pro Cys Asn Trp Thr Lys Lys Thr Leu290 295 300Ala Ser Lys Lys Leu Thr Ser Ser Ser Ile Ser Phe Tyr Trp Ser Met305 310 315 320Ser Thr Lys Val Pro Gln Leu Asp Val His Asn Ile Phe Leu Ala Glu325 330 335Ala Tyr Lys Glu Ser Phe Asp Glu Ile Phe Asn Asp Phe Gly Leu Pro340 345 350Ser Glu Ala Ser Phe Tyr Val Asn Val Pro Ser Arg Ile Asp Glu Ser355 360 365Ala Ala Pro Pro Asn Lys Asp Ser Ile Ile Val Leu Val Pro Ile Gly370 375 380His Met Lys Ser Lys Thr Gly Asn Ser Ala Glu Glu Asn Tyr Pro Glu385 390 395 400Leu Val Asn Arg Ala Arg Lys Met Val Leu Glu Val Ile Glu Arg Arg405 410 415Leu Gly Val Asn Asn Phe Ala Asn Leu Ile Glu His Glu Glu Val Asn420 425 430Asp Pro Ser Val Trp Gln Ser Lys Phe Asn Leu Trp Arg Gly Ser Ile435 440 445Leu Gly Leu Ser His Asp Val Phe Gln Val Leu Trp Phe Arg Pro Ser450 455 460Thr Lys Asp Ser Thr Asn Arg Tyr Asp Asn Leu Phe Phe Val Gly Ala465 470 475 480Ser Thr His Pro Gly Thr Gly Val Pro Ile Val Leu Ala Gly Ser Lys485 490 495Leu Thr Ser Asp Gln Val Cys Lys Ser Phe Gly Gln Asn Pro Leu Pro500 505 510
Arg Lys Leu Gln Asp Ser Gln Lys Lys Tyr Ala Pro Glu Gln Thr Arg515 520 525Lys Thr Glu Ser His Trp Ile Tyr Tyr Cys Leu Ala Cys Tyr Phe Val530 535 540Thr Phe Leu Phe Phe Tyr Phe Phe Pro Arg Asp Asp Thr Thr Thr Pro545 550 555 560Ala Ser Phe Ile Asn Gln Leu Leu Pro Asn Val Phe Gln Gly Gln Asn565 570 575Ser Asn Asp Ile Arg Ile580<210>SEQ ID NO5<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>PCR引物<400>
CGCGCCGACT GCCATTGACT 20<210>SEQ ID NO.6<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>PCR引物<400>
CACGCACGCC GCCTTGACA 19<210>SEQ ID NO7<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>在carB基因中插入切割位點(diǎn)NcoI的寡核苷酸<400>
CTATTTTAAT CCCATGGCTG ATCAAAAG28<210>SEQ ID NO8<211>28<212>DNA
<213>人工序列<223>在carB基因中插入切割位點(diǎn)NcoI的寡核苷酸<400>
CTTTTGATCA GCCATGGGAT TAAAATAG28<210>SEQ ID NO9<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>在carRP基因中插入切割位點(diǎn)NcoI的寡核苷酸<400>
CTTTTTATTT TATCTCCATG GCAATACTCA C31<210>SEQ ID NO10<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>在carRP基因中插入切割位點(diǎn)NcoI的寡核苷酸<400>
GTGAGTATTG CCATGGAGAT AAAATAAAAA G31-1-
權(quán)利要求
1.一種從三孢布拉霉中分離的、包含carRP和carB基因的DNA化合物，其由圖1所示的限制酶圖譜定義，并編碼與β-胡蘿卜素生物合成途徑有關(guān)的酶。
2.確定為SEQ ID NO1的DNA序列，其包括三孢布拉霉的carRP基因，編碼酶番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶。
3.確定為SEQ ID NO2的DNA序列，其包括三孢布拉霉的carB基因，編碼酶八氫番茄紅素脫氫酶。
4.核苷酸序列，其特征在于它們能夠在限制條件下與權(quán)利要求1至3的DNA化合物雜交，并表達(dá)由carRP和carB基因編碼的酶中的一種，除布拉克須霉，卷枝毛霉和粗糙脈孢霉的序列以外。
5.確定為SEQ ID NO3的氨基酸序列，其對應(yīng)于由三孢布拉霉的carRP基因編碼的雙功能酶番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶。
6.確定為SEQ ID NO4的氨基酸序列，其對應(yīng)于由三孢布拉霉的carB基因編碼的酶八氫番茄紅素脫氫酶。
7.載體，其攜帶在權(quán)利要求1至4中所述的DNA化合物或其片段，所述片段編碼由各個(gè)全序列編碼的酶中一種。
8.權(quán)利要求7中要求的載體，其在不同于基因本身的那些的表達(dá)信號的控制下表達(dá)所述carRP基因。
9.權(quán)利要求7中要求的載體，其在不同于基因本身的那些的表達(dá)信號的控制下表達(dá)所述carB基因。
10.權(quán)利要求8和9中要求的載體，其特征在于表達(dá)信號是從三孢布拉霉中獲得的。
11.權(quán)利要求7至10中任何一項(xiàng)要求的載體，其特征在于它們由質(zhì)粒組成。
12.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括carRP基因的pALBT9組成。
13.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括carB基因的pALBT52組成。
14.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括carRP和carB基因的pALBT83組成。
15.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括carRP基因的pALBT84組成。
16.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括carB基因的pALBT85組成。
17.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括bleR基因的pALBT57組成，所述bleR基因在carRP基因的啟動子的控制下表達(dá)。
18.權(quán)利要求11中要求的質(zhì)粒，其特征在于它由包括bleR基因的pALBT58組成，所述bleR基因在carB基因的啟動子的控制下表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及三孢布拉霉的β－胡蘿卜素的生物合成基因，其編碼番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶(carRP)和八氫番茄紅素脫氫酶(carB)。carRP基因，其特征在于DNA序列SEQ ID NO1，編碼氨基酸序列SEQ IDNO3，其具有番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQ ID NO2，編碼氨基酸序列SEQ ID NO4，其具有八氫番茄紅素脫氫酶活性。本發(fā)明還涉及(i)構(gòu)建表達(dá)附加拷貝的所述基因的質(zhì)粒的方法和(ii)在所述基因的啟動子控制下表達(dá)異源基因的方法。
文檔編號C12P23/00GK1558953SQ02818977
公開日2004年12月29日 申請日期2002年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月26日
發(fā)明者瑪爾塔·羅德里格斯·塞斯, 瑪爾塔 羅德里格斯 塞斯, 安娜·特雷莎·馬科斯·羅德里格斯, 特雷莎 馬科斯 羅德里格斯, 迭斯 加西亞, 布魯諾·迭斯·加西亞, 胡安·路易斯·德拉·富恩特·莫雷諾, 路易斯 德拉 富恩特 莫雷諾, 何塞·路易斯·巴雷多·富恩特, 路易斯 巴雷多 富恩特 申請人:維塔特內(nèi)有限公司