專利名稱：外表面蛋白質(zhì)及其基因和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
該項(xiàng)發(fā)明是關(guān)于外表面蛋白質(zhì)的鑒定及其基因和用途，尤其是涉及在免疫治療和藥物篩選上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
B組鏈球菌(GBS)也被稱為無(wú)乳鏈球菌，是各種病的病原體。特別是，GBS可引起早期發(fā)作新生期感染該感染通常開(kāi)始于子宮，導(dǎo)致新生兒嚴(yán)重的敗血病和肺炎，如果不能及時(shí)治療將其致死，即使得到治療也會(huì)有10-20％的死亡率。
晚期發(fā)作新生期感染該感染多發(fā)于嬰兒剛出生至大約3個(gè)月期間，可致敗血病，90％的病例伴發(fā)腦膜炎。其它病灶性感染包括腦膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、膿腫和眼內(nèi)炎。
成人感染該感染似乎越來(lái)越常見(jiàn)且最頻繁地發(fā)生于剛生育過(guò)嬰兒的、年長(zhǎng)的、無(wú)免疫應(yīng)答的女性身上。其特征為敗血病和病灶性感染，包括腦膜炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、膿腫和眼內(nèi)炎。
尿道感染GBS是尿道感染的成因，在妊娠期的所有感染中約占10％。
家畜感染GBS引起奶牛的慢性乳腺炎。導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，因此具有值得注意的經(jīng)濟(jì)重要性。
雖然GBS感染可用抗生素治療，但免疫學(xué)的方法是優(yōu)選的。因此人們希望找到一種能被用于有治療效果的疫苗中的免疫原。
發(fā)明概要本發(fā)明基于在GBS中的一系列基因的鑒定，以及相關(guān)的生物體，該生物體的產(chǎn)物可能與其外表面相關(guān)聯(lián)且因此可被用作免疫治療的靶。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，肽由包括任意的已被鑒定為MS4、MS10、MS11、MS14和MS16的可得自GBS的基因，或其同源物或功能性片段的操縱子所編碼。此種肽適合用于治療，例如當(dāng)被分離后。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“功能性片段”是指一部分保留整個(gè)基因或肽活性的基因或肽。例如肽的功能性片段可用做抗原決定因子，在疫苗或抗體生產(chǎn)方面頗有用處。
基因片段可用于編碼活性肽。另外，該基因片段在基因療法、體內(nèi)野生型基因定位來(lái)發(fā)揮治療作用方面有實(shí)用。
本發(fā)明的肽可包含確定的任一氨基酸序列，如SEQ ID NOS.2、4、6、8、10和12，或包含上述序列的功能性片段。
因?yàn)槲挥诩?xì)胞外或細(xì)胞表面的位置，本發(fā)明的肽可為生產(chǎn)抗GBS治療上有效的疫苗的候選物?！爸委熒嫌行У摹笔侵赴ㄒ呙绲念A(yù)防作用。例如，疫苗可包含本發(fā)明所述的肽或用于其表達(dá)的工具以治療感染。
這種疫苗可在婦女懷孕前或懷孕期間給藥來(lái)保護(hù)母親和新生兒免受GBS感染。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，此肽或基因可用于篩選潛在的抗微生物藥物或毒性檢測(cè)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是在此處鑒定的任意產(chǎn)物的用途，用于與GBS菌株感染相關(guān)病癥的治療或預(yù)防。
雖然已經(jīng)描述了此蛋白質(zhì)用于病人的治療，但該產(chǎn)物的獸醫(yī)用途也被視為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。尤其是，該肽或疫苗可被用于慢性乳腺炎的治療，特別是對(duì)奶牛的治療。
發(fā)明描述本發(fā)明與B組鏈球菌菌株M732有關(guān)，然而所有的GBS菌株和許多其它的細(xì)菌菌株都可能包含相關(guān)的肽或蛋白質(zhì)，它們都有與M732的肽同源的氨基酸序列?？赡芎写穗牡纳矬w，包括但不僅限于此肺炎鏈球菌，釀膿鏈球菌，豬鏈球菌，米氏鏈球菌，C組和G組鏈球菌，還有腸球菌。按照描述GBS的相同方法，可以開(kāi)發(fā)出這些菌株中的相應(yīng)疫苗。
優(yōu)選地，用于生產(chǎn)疫苗的肽與在此鑒定的肽有超過(guò)40％的序列相似性，優(yōu)選可以超過(guò)60％，最優(yōu)選可多于80％的序列相似性，例如95％相似性。
在鑒定出本發(fā)明的一個(gè)基因后，可以用此基因序列在別的微生物中確定同源性。以此方式還可以確定別的微生物是否有相似的外表面產(chǎn)物。通過(guò)在現(xiàn)存的數(shù)據(jù)庫(kù)例如EMBL或Genbank中搜索，可以確定序列的同源性。
本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法被純化和分離。特別是，確定基因序列后，可以用重組技術(shù)在合適的宿主中表達(dá)基因。活性片段和同源物可以被鑒定出來(lái)，并在治療領(lǐng)域中應(yīng)用。例如，肽或其活性片段可在疫苗中作為抗原決定簇，來(lái)引起免疫答應(yīng)。其也可以被用于抗體的制備，用于被動(dòng)免疫或診斷應(yīng)用。合適的抗體包括單克隆抗體或其片段，包括單鏈fv片段。制備抗體的方法對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
基于減毒微生物的疫苗的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。如需要或希望的話，疫苗組合物可與合適的載體或佐劑如明礬一起配制，并用于治療，來(lái)提供抗B組鏈球菌或其它相關(guān)微生物的有效免疫作用。疫苗配劑的制備對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
通常，本發(fā)明用于治療的活性成分的合適的量以及合適載體或賦形劑以及給藥途徑的選擇對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。這些因素可根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)選擇或確定，諸如所治療病癥的性質(zhì)/嚴(yán)重性、受治療者的類型或健康狀況等。
本發(fā)明的產(chǎn)品可按如下方法鑒定將GBS接種于Todd-Hewitt氏鏈球菌肉湯培養(yǎng)基中，允許在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。細(xì)胞被離心收集和用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌。將細(xì)胞重新懸浮在滲透性緩沖液(20％(W/V)蔗糖，20Mm Tris-HCl pH7.0，10mM MgCl2)中，該滲透性緩沖液含有蛋白酶抑制劑(1mM PMSF，10μM碘乙酸，10mM1，10-二氮雜菲，1μM胃酶抑素A)和終濃度為4單位/微升變?nèi)芫?，?7℃培養(yǎng)(振蕩)2小時(shí)。
先用高速離心機(jī)除去細(xì)胞和碎屑，再用超高速離心1小時(shí)。所得到的含有細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的上清液用超濾設(shè)備加壓濃縮(分子量截?cái)嘀禐?0,000)。
樣品對(duì)超高水透析后凍干。經(jīng)過(guò)在填充緩沖液中再懸浮，用制備性兩向凝膠電泳分離出蛋白質(zhì)。電泳后，選一個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)用于研究。對(duì)該點(diǎn)進(jìn)行凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化。從膠狀中提取產(chǎn)生的肽，用微內(nèi)徑RP-HPLC純化。每隔45秒收集一次級(jí)分，與紫外吸收區(qū)相應(yīng)的部分用延時(shí)提取-基體輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜、(DE-MALDI-TOF-MS)分析。然后用Nanospray-MS/MS對(duì)在空白制劑中未觀察到的肽進(jìn)行測(cè)序。
使用此肽序列的信息，設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并低聚核苷酸，將其用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)擴(kuò)增位于所鑒定的肽序列之間的DNA片段。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果是產(chǎn)生幾個(gè)多聚核苷酸片段，其中每一片段按照制造商的說(shuō)明書(shū)被克隆到pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen BV，荷蘭)中。
每一質(zhì)粒中的DNA片段通過(guò)測(cè)序被鑒定，然后如下所述被用于獲得全長(zhǎng)基因序列。
用已鑒定的DNA片段，低聚核苷酸引物被設(shè)計(jì)用于基因組DNA測(cè)序。這些引物被設(shè)計(jì)以便從得到的序列“向外的”方向排序。一旦閱讀，即可檢查獲得的序列是否已經(jīng)到達(dá)基因的5’端和3’端。通過(guò)檢查同源序列鑒定了這些特征的存在，對(duì)于5’末端來(lái)說(shuō)，在Shine-Dalgarno共有序列之前存在AUG起始密碼子(或公認(rèn)的替換物)而對(duì)于3’末端來(lái)說(shuō)，存在翻譯終止密碼子。
根據(jù)全長(zhǎng)基因的鑒定，引物被設(shè)計(jì)用于從GBS基因組DNA擴(kuò)增全長(zhǎng)產(chǎn)物。所用的引物包括限制酶識(shí)別位點(diǎn)(在5’末端的NcoI和在3’末端的Eco0109I)，允許產(chǎn)物隨后克隆到所用的乳球菌表達(dá)體系中。
用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并把產(chǎn)物克隆到pCR2.1克隆載體(Invitrogen)中。在確認(rèn)克隆片段存在后，用限制酶NcoI和Eco0109I切除該DNA。
插入此片段的載體是pNZ8048的修飾變體(Kuipers，O.P.等人(1998)J.Biotech 6415-21)。這種含有乳球菌復(fù)制起點(diǎn)、氯霉素抗性標(biāo)記、可誘導(dǎo)的乳鏈菌肽啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)的載體通過(guò)用2個(gè)10X組氨酸標(biāo)記取代位點(diǎn)得以改變多克隆，側(cè)接于帶有NcoI位點(diǎn)的5’末端，在含有多克隆位點(diǎn)(包括Eco0109I位點(diǎn))和His標(biāo)記的3’末端的終止密碼子的中間分開(kāi)。
插入目的基因，這樣一個(gè)10X組氨酸標(biāo)記處在相對(duì)于密碼區(qū)的3’位置。把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌(L.lactis)(菌株NZ9000-Kuipers，O.p.等人(1998)見(jiàn)上文)中，形成一種400m1的液體培養(yǎng)物，通過(guò)將乳鏈菌肽加到培養(yǎng)物中來(lái)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的翻譯。培養(yǎng)2小時(shí)后，收獲細(xì)胞并用玻珠攪打溶胞，將生成的溶胞產(chǎn)物離心分離，然后通過(guò)金屬親合性(Talon，clonetech)柱。在用咪唑洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)前反復(fù)洗柱。
為了鑒定含有組氨酸標(biāo)記的重組蛋白質(zhì)的級(jí)分，每個(gè)級(jí)分的等分試樣都用SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡法分析，并用抗-His抗體探測(cè)。
然后用得到的重組蛋白質(zhì)免疫新西蘭白兔，在免疫前收集免疫前血清。在加強(qiáng)免疫之后，處死白兔，收集血清，用于蛋白質(zhì)印跡法、ELISA和動(dòng)物保護(hù)模型。
使用獲自動(dòng)物研究的血清，進(jìn)行免疫吸附研究。
B組鏈球菌在20ml Todd-Hewitt氏鏈球菌肉湯(THB)中培養(yǎng)8小時(shí)，收集后再懸浮于5ml PBS中。在96孔平板(Nunc免疫-吸附)中，用50μl等分試樣覆蓋加樣孔，在4℃放置過(guò)夜以吸收細(xì)菌到平板上。用GBS洗平板兩次，然后在37℃下用加入3％BAS的PBS封閉1小時(shí)。再次洗滌平板。在PBS中制得連續(xù)10倍的血清稀釋液且50μl稀釋液被加到平板的孔中，一式兩份。蓋上平板并在37℃培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌平板，然后在每個(gè)孔中加入濃度為1∶5000的50μl抗兔堿性磷酸酶綴合的第二抗體。在37℃培養(yǎng)1小時(shí)后，再次洗滌平板。把50μl底物(PNPP)加入每個(gè)孔，在405nm處讀取吸收度前反應(yīng)30min。
進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)研究，檢驗(yàn)保護(hù)作用對(duì)免疫接種兔的有效性。
GBS M732在THB中培養(yǎng)，直至對(duì)數(shù)中期，約需5小時(shí)。在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，在免疫前或試驗(yàn)血清中稀釋細(xì)菌濃度至2×107/ml。取50μl通過(guò)腹膜內(nèi)途徑注射入出生0-1天的小鼠。在48小時(shí)內(nèi)觀察小鼠的存活狀況。
下面的實(shí)施例闡述了本發(fā)明。
實(shí)施例1第一個(gè)質(zhì)粒被稱為MS4。克隆的DNA片段被測(cè)序，核苷酸和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO.1和2)被用于檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
可在產(chǎn)氣莢膜梭菌、流感嗜血菌、淡黃奈瑟氏球菌和Thermatogamaritima中鑒定GBS MS4基因產(chǎn)物的同源物。在所有的情況下同源物都是鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OCT)的基因。在真核體系中這種酶催化尿素循環(huán)的第二步反應(yīng)-鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，該反應(yīng)需氨甲酰磷酸。在原核生物中，ODC是與精氨酸脫氨酶活性有關(guān)的三種酶之一-保護(hù)細(xì)菌不受酸侵蝕。尤其，ODC有助于瓜氨酸轉(zhuǎn)為鳥(niǎo)氨酸和氨甲酰磷酸(與真核生物中的相反的作用)(Casiano-colon，A and Marquis，R.E.1998.Ap pl.Environ.Microbiol.541318-1324，Cunin，R.等人1986.Microbiol.Rev.50314-352)。
如上所述進(jìn)行了動(dòng)物保護(hù)研究。結(jié)果如下處理 幼犬?dāng)?shù) 在時(shí)間點(diǎn)(hrs)存活的幼犬?dāng)?shù)24 48PBS 15 6 0免疫前41 18 1試驗(yàn) 41 33 14實(shí)施例2
第二個(gè)質(zhì)粒被稱為MS11。核苷酸和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NOS.3和4)被用于檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
GBS MS11基因產(chǎn)物的同源物可在德氏乳桿菌，海棲熱袍菌，丙酮丁醇梭菌，巨大芽孢桿菌，Triticum aestivium和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803中被鑒定。
在所有的情況下同源物都是磷酸甘油激活酶(PGK)蛋白質(zhì)的基因。PGK是糖酵解途徑中的主要酶，與甘油醛3-磷酸-轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐急岬姆磻?yīng)有關(guān)。尤其，與甘油酸-1，3-二磷酸與3-磷酸-甘油酸之間反應(yīng)的催化作用有關(guān)，在向前的反應(yīng)中釋放一個(gè)磷酸。
實(shí)施例3第三個(gè)質(zhì)粒被稱為pMS16。5’和3’末端克隆DNA片段被測(cè)序且5’端片段的核苷酸和推斷的氨基酸序列被顯示于SEQ ID NOS.5和6，3’端片段的核苷酸和推斷的氨基酸序列被顯示于SEQ ID NOS.7和8。
GBS MS16基因產(chǎn)物的同源物可以在嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和生殖道枝原體中被鑒定。
在所有的情況下同源物都是編碼葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)蛋白質(zhì)的基因。
葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶催化糖酵解(G6P到F6P)和糖異生(F6P到G6P)過(guò)程中的葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之間的反應(yīng)。已證明gpi基因中的突變賦予生物體嘌呤類似物敏感性。
實(shí)施例4第四個(gè)質(zhì)粒被稱為pMS14?？寺〉腄NA片段被測(cè)序，核苷酸和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO.9和10)被用于檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
GBS MS14基因產(chǎn)物的同源物可在嗜熱脂肪芽孢桿菌，Mus musculus，Bos taurus和玉米中被鑒定。在所有的情況下同源物均為嘌呤核苷磷酸酶(PNP)蛋白質(zhì)的基因。此酶的作用是在正磷酸存在時(shí)切割鳥(niǎo)嘌呤核苷或肌苷成為其各自的堿基和糖-1-磷酸分子。
實(shí)施例5
第五個(gè)質(zhì)粒被稱為pMS10?？寺〉腄NA片段被測(cè)序，核苷酸和推斷的氨基酸序列(SEQ ID NO.11和12)被用于檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
GBS MS10基因產(chǎn)物的同源物可在變異鏈球菌，Nicotiana Plumb，Pisum sati vum和玉米中被鑒定。在所有的情況下同源物都是非磷酸化，NADP-依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(NPGAP-3-DH)蛋白質(zhì)的基因。NPGAP-3-DH已被報(bào)道作為在變異鏈球菌中產(chǎn)生NADPH用于生物合成反應(yīng)的重要工具(與符合糖酵解途徑要求的NAD-特異性GAP-3-DH相反)(Boyd，D.A.，Cvitkovitch，D.G.和Hamilton，I.R 1995細(xì)菌學(xué)雜志.1772622-2727)。
序列表<110>Mlcroscience Limited<120>外表面蛋白質(zhì)及其基因和用途<130>REP05969WO<140>
<141>
<160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1014<212>DNA<213>B組鏈球菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1014)<400>1atg aca caa gta ttt caa gga cgt agt ttc tta gca gaa aaa gat ttt48Met Thr Gln Val Phe Gln Gly Arg Ser Phe Leu Ala Glu Lys Asp Phe1 5 10 15tct cgt gag gaa ttt gaa tat ctt att gat ttt tca gct cat tta aaa96Ser Arg Glu Glu Phe Glu Tyr Leu Ile Asp Phe Ser Ala His Leu Lys20 25 30gac ctt aaa aaa cgt ggt gtt cct cat cat tat ctt gaa ggt aaa aat144Asp Leu Lys Lys Arg Gly Val Pro His His Tyr Leu Glu Gly Lys Asn35 40 45att gct ctc tta ttt gaa aaa aca tct act cgt act cgc gca gcc ttt192Ile Ala Leu Leu Phe Glu Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Ala Ala Phe50 55 60aca act gca gca att gac cta ggc gct cat ccg gaa tac ctt ggt gca240Thr Thr Ala Ala Ile Asp Leu Gly Ala His Pro Glu Tyr Leu Gly Ala65 70 75 80aat gat att caa ctt ggt aaa aaa gaa tca aca gaa gat act gct aag288Asn Asp Ile Gln Leu Gly Lys Lys Glu Ser Thr Glu Asp Thr Ala Lys85 90 95
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<213>B組鏈球菌<400>12Leu Thr Lys Glu Tyr Gln Asn Tyr Val Asn Gly Glu Trp Lys Ser Ser1 5 10 15Val Asn Gln Ile Glu Ile Leu Ser Pro Ile Asp Asp Ser Ser Leu Gly20 25 30Phe Val Pro Ala Met Thr Arg Glu Glu Val Asp His Ala Met Lys Ala35 40 45Gly Arg Glu Ala Leu Pro Ala Trp Ala Ala Leu Thr Val Tyr Glu Arg50 55 60Ala Gln Tyr Leu His Lys Ala Ala Asp Ile Ile Glu Arg Asp Lys Glu65 70 75 80Glu Ile Ala Thr Val Leu Ala Lys Glu Ile Ser Lys Ala Tyr Asn Ala85 90 95Ser Val Thr Glu Val Val Arg Thr Ala Asp Leu Ile Arg Tyr Ala Ala100 105 110Glu Glu Gly Ile Arg Leu Ser Thr Ser Ala Asp Glu Gly Gly Lys Met115 120 125Asp Ala Ser Thr Gly His Lys Leu Ala Val Ile Arg Arg Gln Pro Val130 135 140Gly Ile Val Leu Ala Ile Ala Pro Tyr Asn Tyr Pro Val Asn Leu Ser145 150 155 160Gly Ser Lys Ile Ala Pro Ala Leu Ile Gly Gly Asn Val Val Met Phe165 170 175Lys Pro Pro Thr Gln Gly Ser Val Ser Gly Leu Val Leu Ala Lys Ala180 185 190Phe Ala Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Phe Asn Thr Ile Thr Gly195 200 205Arg Gly Ser Glu IIe Gly Asp Tyr Ile Val Glu His Glu Glu Val Asn210 215 220Phe Ile Asn Phe Thr Gly Ser Thr Pro Val Gly Gln Arg Ile Gly Lys225 230 235 240
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1.一種由任一已被鑒定為MS4、MS11、MS14和MS16的可獲自B組鏈球菌的基因所編碼的肽，或與其具有至少60％序列相似性的同源物，或其保持了引發(fā)免疫應(yīng)答的能力的功能性片段。
2.權(quán)利要求1的肽，其中所述同源物與由鑒定為MS4、MS11、MS14或MS16的可獲自B組鏈球菌的基因所編碼的肽具有至少80％的序列相似性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其任一氨基酸序列為已確定的SEQ ID NOS.2，4，6，8和10。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽，其用于醫(yī)療用途。
5.編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽的多核苷酸，其用于醫(yī)療用途。
6.一種被轉(zhuǎn)化以表達(dá)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽的宿主。
7.包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽的疫苗，或用于其表達(dá)的工具。
8.權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求的產(chǎn)物的用途，用于與細(xì)菌感染相關(guān)的疾病治療或預(yù)防的藥物的制造。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中的感染是B組鏈球菌感染。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的用途，其中的感染是病灶性感染。
11.根據(jù)權(quán)利要求8或9的用途，其中的感染是尿道感染。
12.一種抗權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的肽的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及外表面蛋白質(zhì)及其基因和用途。根據(jù)本發(fā)明，在B組鏈球菌中鑒定了一系列基因，其產(chǎn)物可能位于生物體的外表面上。該基因或其功能性片段可用于治療物質(zhì)，例如使患者免受微生物感染的疫苗的制備。
文檔編號(hào)C12N9/22GK1733800SQ20051000471
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者M·J·G·休斯, J·D·桑坦格羅, J·D·萊恩, R·菲爾德曼, J·C·穆?tīng)? P·埃弗里斯特, R·J·多布森, C·J·亨伍德, G·杜根, R·K·威爾遜 申請(qǐng)人:微科學(xué)有限公司