專利名稱：：用于植物中表達基因的時間特異性種子啟動子的制作方法本申請要求2002年5月3日提交的美國臨時申請60/377247的優(yōu)先權和利益。本發(fā)明涉及植物遺傳工程領域。更具體地說，本發(fā)明涉及胚胎發(fā)生過程中具有特定時間模式的種子特異性基因表達。本發(fā)明提供能夠在種子中轉錄異源核酸序列的啟動子，及其對其進行修飾、制備和應用的方法。種子提供了對人和家畜而言重要的飲食蛋白源。然而，種子的營養(yǎng)含量經(jīng)常不足。例如，許多種子蛋白質(zhì)缺乏一或多種必需氨基酸。通過遺傳修飾天然或非天然蛋白而具有營養(yǎng)更全面的氨基酸組成(或其它一些預期特性)，并在轉基因植物中過量表達該修飾蛋白，可克服上述缺陷?？蛇x地，可將一或多個基因導入作物中以操縱其代謝途徑和改變游離氨基酸含量。這些方法在產(chǎn)生農(nóng)藝性狀(如產(chǎn)量)、營養(yǎng)性能和藥物學特性被改善了的作物中非常有用?；虻膶肟蓪χ参锷L和發(fā)育產(chǎn)生有害的影響。如此，有必要將基因的表達限制在預期的靶組織中。例如，必需將氨基酸去調(diào)節(jié)(deregulation)基因的表達限定為種子特異性或種子增強型以防止非期望表型而影響產(chǎn)量或其它農(nóng)藝性狀。在有些情況中，轉基因的表達必需進一步限制在特異靶組織的生長和發(fā)育過程中確定時期內(nèi)(時間模式(temporalprofile))。例如，需要將脂肪酸代謝基因控制在當種子中的油生物合成最活躍的時期內(nèi)表達。基因的啟動子部分在控制基因表達中起著核心作用。通過啟動子區(qū)域，才能組裝轉錄體并進而起始轉錄。該早期步驟相對于接下來的基因表達步驟而言常常是關鍵的調(diào)控步驟。在啟動子階段調(diào)控轉錄起始有數(shù)種方式。例如，由于特定化合物的存在誘導啟動子、只在特異性組織中表達基因、或組成性表達編碼序列。因此，編碼序列的轉錄可通過將編碼序列可操作性的連接到具有不同調(diào)控特性的啟動子而得以修飾改變，但其中的問題是預期特性的啟動子的可獲得性，而本發(fā)明的著眼點正在于此。發(fā)明概述本發(fā)明包括并提供一種基本純的核酸分子，其編碼的核酸序列具有與SEQIDNO1或其互補序列至少75％的同一性。本發(fā)明包括并提供一種植物，它包含有導入的核酸分子，其中所述核酸分子包含的啟動子含有與SEQIDNO1或其互補序列有至少75％的同一性的核酸序列。本發(fā)明包括并提供一種植物，它包含有導入的核酸分子，其中所述核酸分子包含的啟動子含有選自如下序列SEQIDNO1-4所示序列或其互補序列。本發(fā)明包括并提供一種產(chǎn)生轉化植物的方法，包括提供一種核酸分子，包括含有選自SEQIDNO1-4所示序列及其它們的互補序列的核酸序列的啟動子，與結構性核酸序列可操作性連接；并用所述核酸分子轉化植物。本發(fā)明包括并提供一種在種子中表達結構性核酸分子的方法，包括培育包含有導入的核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補序列的核酸序列的啟動子，其與結構性核酸分子可操作性連接，其中所述植物產(chǎn)生種子，并且所述結構性核酸分子在所述種子中發(fā)生轉錄；和分離所述種子。本發(fā)明包括并提供一種獲得結構性核酸分子的產(chǎn)物被增強的種子的方法，包括培育包含有導入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補序列的核酸序列的啟動子，其與結構性核酸分子可操作性連接，其中所述轉化植物產(chǎn)生種子，并且所述結構性核酸分子在所述種子中發(fā)生轉錄；和從所述植物收獲(isolating)所述種子。本發(fā)明包括并提供一種獲得結構性核酸分子的產(chǎn)物被促進的食物(meal)的方法，包括培育包含有導入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補序列的核酸序列的啟動子，其與所述結構性核酸分子可操作性相連，其中所述植物產(chǎn)生種子，并且所述結構性核酸分子在所述種子中發(fā)生轉錄；和制備包含所述植物或其部分的所述食物(meal)。本發(fā)明包括并提供一種獲得結構性核酸分子的產(chǎn)物被增強的原種(feedstock)的方法，包括培育包含有導入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補體的核酸序列的啟動子，其與所述結構性核酸分子可操作性相連，其中所述植物產(chǎn)生種子，并且所述結構性核酸分子在所述種子中發(fā)生轉錄；和制備包含所述植物或其部分的所述原種(feedstock)。本發(fā)明包括并提供一種獲得結構性核酸分子的產(chǎn)物被增強的油(oil)的方法，包括培育包含有導入核酸分子的植物，所述核酸分子包括含有在嚴謹條件下與選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補序列雜交的核酸序列的啟動子，其與所述結構性核酸分子可操作性相連，其中所述植物產(chǎn)生種子，并且所述結構性核酸分子在所述種子中發(fā)生轉錄；和收獲所述油(oil)。本發(fā)明包括并提供一種細胞，其包括含有選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其互補體的核酸序列的載體。本發(fā)明包括并提供從下述植物的一或多個種子中產(chǎn)生的油(oil)，所述植物包含有導入的核酸分子，其包括含有選自SEQIDNO1-4及其互補核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供從下述植物的一或多個種子中制備的油(oil)，所述植物包含有導入的核酸分子，其包括含有選自SEQIDNO1-4及其互補序列的核酸序列的啟動子，其與結構性核酸序列可操作性連接，其中所述啟動子相對于結構性核酸序列是異源的。本發(fā)明包括并提供由下述植物產(chǎn)生的種子，所述植物包含有被導入的核酸分子，該核酸分子包括含有選自SEQIDNO1-4及其互補體的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供含下述植物或其部分的原種，所述植物或其部分包含有導入的的核酸分子，其包括含有選自SEQIDNO1-4及其互補體的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供含來自下述植物的植物材料的食物(meal)，所述植物包含有導入的核酸分子，其包括含有選自SEQIDNO1-4及其互補序列的核酸序列的啟動子。本發(fā)明包括并提供種子的容器，其中至少25％的所述種子包括含有與結構性核酸序列可操作性連接的選自SEQIDNO1-4及其互補體的核酸序列的啟動子，其中所述啟動子與結構性核酸序列彼此異源。本發(fā)明包括并提供一種在植物中表達結構性核酸序列的方法，包括用包含與所述結構性核酸序列可操作性連接的啟動子的核酸分子轉化所述植物，其中所述啟動子包括選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補序列的序列，并且其中所述啟動子和所述結構性核酸彼此異源；并培育所述植物。本發(fā)明包括并提供一種在植物的種子中積聚游離氨基酸的方法，包括用包含與所述結構性核酸序列可操作性連接的啟動子的核酸分子轉化所述植物，其中所述啟動子包括選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補體的序列，并且其中所述啟動子和所述結構性核酸彼此異源；并培育所述植物。本發(fā)明包括并提供一種調(diào)節(jié)大豆種子萌發(fā)的方法，包括用包含與編碼赤霉素生物合成多肽的結構性核酸序列可操作性連接的啟動子的核酸分子轉化所述植物，其中所述啟動子包括選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補體的序列，并且其中所述啟動子和所述結構性核酸彼此異源；收獲所述植物的種子；種植所述種子。附圖簡述圖1為pMON8677的結構示意圖。圖2為pMON49801的結構示意圖。圖3為pMON42316的結構示意圖。圖4為pMON42320的結構示意圖。圖5為pMON42302的結構示意圖。圖6為pMON69650的結構示意圖。圖7為pMON69651的結構示意圖。圖8為pMON64210的結構示意圖。圖9為pMON64213的結構示意圖。圖10為pMON66893的結構示意圖。圖11為pMON66894的結構示意圖。圖12為pMON63662的結構示意圖。圖13為pMON63682的結構示意圖。序列表簡述SEQIDNO1表示sle2基因啟動子。SEQIDNO2表示lea9啟動子。SEQIDNO3表示AtPerl啟動子。SEQIDNO4表示凝集素啟動子。SEQIDNOs5-25表示引物序列。定義下述提供的定義幫助對本發(fā)明詳細描述的理解。術語“編碼序列”、“結構性序列”和“結構性核酸序列”指包含核苷酸有序排列的物理結構(一級結構)。核苷酸按三聯(lián)體排列，使每個三聯(lián)體形成密碼子。每個密碼編碼特定氨基酸。因此，編碼序列、結構性序列和結構性核酸序列編碼的一系列氨基酸形成蛋白質(zhì)、多肽或肽序列。編碼序列、結構性序列和結構性核酸序列可包含在大核酸分子、載體等之中。此外，這些序列中的核苷酸有序排列可通過序列表、圖、表、電子介質(zhì)等來描述。術語“DNA序列”、“核酸序列”和“核酸分子”指包含核苷酸有序排列的物理結構。DNA序列或核苷酸序列可包含在大核酸分子、載體等之中。此外，這些序列中的核苷酸有序排列可通過序列表、圖、表、電子介質(zhì)等來描述。術語“表達”指基因的轉錄產(chǎn)生相應的mRNA，該mRNA翻譯產(chǎn)生相應的基因產(chǎn)物(即肽、多肽或蛋白質(zhì))。術語“反義RNA的表達”指DNA轉錄產(chǎn)生第一RNA分子，其能夠與第二RNA分子雜交。術語“同源”指兩個或多個核酸或氨基酸序列之間的相似性水平，通過位置相同百分率來計算(即序列相似或同一性)。同源性也用于指不同核酸或蛋白質(zhì)中的相似功能特性。術語“異源”指兩個或多個不同來源的核酸或蛋白質(zhì)序列之間的相互關系。例如，如果啟動子與編碼序列之間的組合在自然界通常不存在，則兩者彼此異源。此外，特定序列可以相對于它所插入的細胞或生物體是異源的(即其在特定細胞或生物體中在自然條件下通常不存在)。術語“雜交”指第一條核酸鏈與第二條鏈在具有足夠序列同一性時通過氫鍵堿基配對的能力。當兩個核酸分子在適當條件下相互退火即可發(fā)生雜交。術語“可操作性連接”指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性空間排列。例如，啟動子區(qū)與核酸序列安排的位置關系以使核酸序列可由該啟動子區(qū)調(diào)控而引導轉錄。此時，啟動子區(qū)與核酸序列屬于“可操作性連接”。術語“啟動子”或“啟動子區(qū)”指經(jīng)常存在于編碼序列的上游(5′)的核酸序列，其能夠調(diào)控核酸序列轉錄成mRNA。啟動子或啟動子區(qū)典型地提供RNA聚合酶或其它為轉錄合適起始的因子的識別位點。在此處，啟動子或啟動子區(qū)包括通過插入或缺失調(diào)節(jié)區(qū)，或對啟動子進行隨機或定點突變等而衍生的啟動子變體。啟動子的強度或活性可通過它能夠產(chǎn)生RNA的量來衡量，或通過蛋白在細胞或組織中的積聚量來衡量，而是相對于與其比較的啟動子的轉錄活性事先進行確定進行。術語“5′UTR”指被DNA上游或基因編碼區(qū)的5′轉錄而不被翻譯區(qū)。在實際中，啟動子經(jīng)常與天然的5′UTR組合使用。某些情況下，啟動子與異源的5′UTR組合可獲得最佳的表達。術語“3′UTR”指DNA下游或基因編碼區(qū)的3′的非翻譯區(qū)。3′UTR包含錄終止和RNA多腺苷酸化信號。術語“重組載體”指諸如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自我復制序列、噬菌體或線性單鏈、環(huán)狀單鏈、線性雙鏈或環(huán)狀雙鏈DNA或RNA核苷酸序列。重組載體可是任何來源的，并能夠發(fā)生基因組整合或自我復制。術語“調(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列的上游(5′)、內(nèi)部、或下游(3′)的核苷酸序列。典型地，所述編碼序列的轉錄和表達因調(diào)節(jié)序列的存在或不存在而受到影響。術語“基本上同源”指兩條序列至少有約90％的序列相同，其中用BestFit程序(Version10；GeneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI))于默認參數(shù)下的計算作為結果。術語“轉化”指將核酸導入到受體宿主中。術語“宿主”指細菌細胞、真菌、動物或動物細胞、植物或種子、或任何植物部分或組織，包括植物細胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、苗、胚和花粉。在此處，術語“轉基因植物”指導入的核酸穩(wěn)定地整合到其基因組的植物，例如整合到核基因組或質(zhì)體基因組中。此處，術語“基本上純的”指將分子從基本上所有其它的天然狀態(tài)與它通常在一起的分子分離開來。更具體地說，基本純的分子是所述制品中的占優(yōu)勢地位的種類。一種基本純的分子可以是高于60％、優(yōu)選75％、更優(yōu)選90％、最優(yōu)選95％去除了天然混合物中存在的其它分子(溶劑除外)。術語“基本純的”不意欲包括存在于天然狀態(tài)下的分子。在一個優(yōu)選方面，相似遺傳背景是指核遺傳材料相比共同背景有50％或更高的生物體。在一個更優(yōu)選方面，相似遺傳背景是指核遺傳材料相比共同背景有75％或更高，甚至更優(yōu)選為90％或更高的生物體的背景。在另一更優(yōu)選方面，相似遺傳背景是指被比較的是植物，除由于用植物轉化技術而原先導入的遺傳材料之外，植物是同基因的。優(yōu)選實施方式的詳細描述本發(fā)明提供能夠在種子中轉錄異源結構性核酸序列的啟動子，及其對所述啟動子的修飾、制備和應用方法。本發(fā)明也提供含有種子特異性啟動子的組合物、轉化的宿主細胞和植物，以及它們的制備和應用方法。核酸分子本發(fā)明提供包含選自SEQIDNO1-4所示序列及其互補體序列的核酸分子。SEQIDNO1表示sle2基因啟動了。SEQIDNO2表示lea9啟動了。SEQIDNO3表示AtPerl啟動子。SEQIDNO4表示凝集素啟動子。核酸雜交技術是DNA操作領域中的技術人員熟知的技術。給定的核酸對的雜交特性反映了它們之間的相似性或同一性。低嚴謹條件可用于選擇與靶核酸序列有較低序列同一性的核酸序列?？刹捎玫臈l件例如約0.15M至約0.9M氯化鈉，溫度為約20至約55℃。高嚴謹條件可用于選擇與公開的核酸序列有較高程度的序列同一性的核酸序列(Sambrooketal.，1989)。高嚴謹條件典型涉及在約2X至約10XSSC(由20XSSC母液中釋稀得到，該母液包含3M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉的蒸餾水溶液，pH7.0)、約2.5X至約5XDenhardt’s溶液(由50X母液釋稀得到，該母液包含1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll及1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮于蒸餾水中)、約10mg/mL至約100mg/mL魚精子DNA及約0.02％(w/v)至約0.1％(w/v)SDS中于約50℃至約70℃溫育數(shù)小時至過夜以完成核酸雜交。高嚴謹條件優(yōu)選為6XSSC、5XDenhardt’s溶液、100mg/mL魚精子DNA及0.1％(w/v)SDS中于55℃溫育數(shù)小時。上述雜交后通常接著進行數(shù)次洗滌步驟。洗滌液組合物通常包含0.5X至約10XSSC和0.01％(w/v)至約0.5％(w/v)SDS，并于約20℃至約70℃溫育15分鐘。優(yōu)選地，在65℃，用0.1XSSC洗至少1次之后，核酸片段仍然保持雜交。本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選為在高嚴謹條件下能與具有選自SEQIDNO1-4所示序列及其互補序列的核酸分子發(fā)生雜交。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴謹條件下能與含有SEQIDNO1所示序列的核酸分子發(fā)生雜交。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴謹條件下能與含有SEQIDNO2所示序列的核酸分子發(fā)生雜交。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴謹條件下能與含有SEQIDNO3所示序列的核酸分子發(fā)生雜交。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的核酸分子在高嚴謹條件下能與含有SEQIDNO4所示序列的核酸分子發(fā)生雜交。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的核酸分子包含與SEQIDNO1、2、3或4所示序列具有高于約75、約80、約85、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98或約99％的序列同一性的核酸序列。序列同一性百分率優(yōu)選通過SequenceAnalysisSoftwarePackageTM(Version10；GeneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)的“BestFit”或“Gap”程序來計算?！癎ap”利用Needleman和Wunsch的運算法則(Needleman和Wunsch，1970)以找到配對數(shù)目最大化和缺口(gap)數(shù)目最小化的兩條序列對比。“BestFit”是按照兩條序列之間相似性的最佳部分的優(yōu)化對比，并插入缺口以將配對數(shù)目最大化，其利用Smith和Waterman的局部同源運算法則(Smith和Waterman，1981；Smithetal.，1983)。同一性百分比最優(yōu)選通過“BestFit”程序以默認參數(shù)進行計算而獲得。本發(fā)明也提供與SEQIDNO1-4及其互補序列中任一序列有同一性百分比的核酸分子片段。在一個實施方式中，所述片段是本發(fā)明核酸分子中50和600之間的連續(xù)核苷酸、50和550之間的連續(xù)核苷酸、50和500之間的連續(xù)核苷酸、50和450之間的連續(xù)核苷酸、50和400之間的連續(xù)核苷酸、50和350之間的連續(xù)核苷酸、50和300之間的連續(xù)核苷酸、50和250之間的連續(xù)核苷酸、50和200之間的連續(xù)核苷酸、50和150之間的連續(xù)核苷酸、50和100、15至100、15至50、或15至25之間的連續(xù)核苷酸。在另一實施方式中，所述片段包括本發(fā)明核酸序列中的至少約15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或約650個連續(xù)核苷酸。本發(fā)明包括編碼具有酶活性的多肽的核酸序列，該酶活性為類固醇途徑酶鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶和固醇甲基轉移酶II。鯊烯環(huán)氧酶(也稱作鯊烯單加氧酶)催化鯊烯轉化為環(huán)氧化鯊烯(2，3-氧化鯊烯)，環(huán)氧化鯊烯是植物甾醇類合成路徑中的起始固醇分子的前體，環(huán)阿屯醇。這是該路徑中首次報道的步驟，該路徑是需氧的。環(huán)氧化鯊烯的形成也是最近經(jīng)常報道的動物、真菌和植物的固醇生物合成中步驟。近來報道一些擬南芥屬(Arabidopsis)和蕓苔屬(Brassica)環(huán)氧化鯊烯基因的同系物(Schafer，U.A.，Reed，D.W.，Hunter，D.G.，Yao，K.，Weninger，A.M.，Tsang，E.W.，Reaney，M.J.，MacKenzie，S.L.，和Covello，P.S.(1999)，PlantMol.Biol.，39(4)721-728)。這些作者還進行PCT申請，其中公開了使用環(huán)氧化鯊烯的反義技術來評價植物中的鯊烯水平的用途(WO97/34003)。鯊烯環(huán)氧化酶，也稱作鯊烯單加氧酶，是參考號為1.14.99.7的酶，EnzymeNomenclature，1992，146。一些鯊烯環(huán)氧化酶是本領域已知的。它們包括擬南芥鯊烯環(huán)氧化酶蛋白質(zhì)序列登錄號AC004786擬南芥屬(Arabidopsis)鯊烯環(huán)氧化酶登錄號N64916，和擬南芥鯊烯環(huán)氧化酶登錄號T44667。日本專利申請07194381A公開了編碼哺乳動物的鯊烯環(huán)氧化酶的DNA。本發(fā)明的另一個方面是包含編碼鯊烯環(huán)氧化酶的核酸序列的重組構建體和載體，以及制備新的鯊烯環(huán)氧化酶方法，包括在使生成鯊烯環(huán)氧化酶的條件下培養(yǎng)用新的構建體或載體轉化的宿主細胞一段時間，和回收由此生成的鯊烯環(huán)氧化酶。S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基轉移酶(SMT1和SMT2)催化將甲基從輔助因子S-腺苷L-甲硫氨酸上轉移到固醇側鏈的C24中心(Bach，T.J.和Benveniste，P.(1997)，Prog.LipidRes.，36197-226)。在高等植物細胞中，SMT表示產(chǎn)生24-甲基和24-乙基固醇的能力(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35263-269)。采用酵母erg6表達系統(tǒng)的SMT功能性特征清楚地證明，在特定植物種類中，SMT1序列編碼環(huán)阿屯醇-C24-甲基轉移酶和SMT2序列編碼24-亞甲基烯膽烷醇(methylenelophenol)-C24-甲基轉移酶(Bouvier-Nave，P.，Husselstein，T.，和Benveniste，P.(1998)，Eur.J.Biochem.，246518-529)。一些編碼SMT1和SMT2的基因已經(jīng)被報道和評論(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35263-269)。表達SMT1或SMT2的同系物的轉基因植物已經(jīng)被試驗(Schaffer，A.，Bouvier-Nave，Benveniste，P.，Schaller，H.(2000)Lipids，35263-269)。這些基因用于改進植物固醇組成的用途也被兩個專利申請覆蓋(WO98/45457和WO00/61771)。本領域已知的固醇甲基轉移酶I可被用于本發(fā)明。示例性的序列包括已知的擬南芥固醇甲基轉移酶I蛋白序列登錄號U71400，已知的煙草固醇甲基轉移酶I蛋白序列登錄號U81312和蓖麻(RicinusCommunis)固醇C甲基轉移酶，Eur.J.Biochem.，246(2)518-529(1997)(Completecds，登錄號g2246457)。S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基轉移酶-一種編碼擬南芥S-腺苷L-甲硫氨酸固醇C24甲基轉移酶的核酸序列已經(jīng)被Husselstein等，(1996)FEBSLetters38187-92發(fā)表。Δ24固醇甲基轉移酶是編號為2.1.1.41的酶，EnzymeNomenclature，1992，160。固醇C4脫甲基酶催化個別脫甲基反應的前面反應，導致C4上的兩個甲基基團去除。雖然在動物和真菌中，連續(xù)發(fā)生兩個C4甲基基團的去除，但是已經(jīng)報道在植物中，在第一次和第二次C4脫甲基之間還有其他步驟(Bach，T.J.和Benveniste，P.(1997)，Prog.LipidRes.，36197-226)。C4脫甲基是由單加氧酶、NAD+依賴的固醇4-脫羧酶和NADPH依賴的3-類固酮還原酶組成的微粒體酶復合物催化的。固醇C14脫甲基酶催化C14處的脫甲基，去除C14的甲基基團并且在該位置上產(chǎn)生雙鍵。在真菌和動物中，這是固醇合成路徑的第一步。但是，在高等植物中，14α-甲基在一個C4甲基缺失后被去除。因此，雖然羊毛固醇是動物和真菌細胞中的C14脫甲基酶的底物，植物酶利用鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)作為底物。固醇C14脫甲基化通過細胞色素P-450復合物調(diào)節(jié)。去除14甲基的機制包括兩個氧化步驟，在C29生成乙醇，然后轉化為乙醛，以及另一個氧化步驟，涉及產(chǎn)生甲酸和典型的8，14-雙烯固醇的去甲?；?Aoyama，Y.，Yoshida，Y.，Sonoda，Y.，和Sato，Y.(1989)J；Biol.Chem.，26418502-18505)。來自Sorghumbicolor(L)Moench的鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α-脫甲基酶已經(jīng)采用由從內(nèi)在14氨基酸序列設計的PCR引物生成的基因特異性探針克隆，并且在大腸桿菌中被功能性地表達(Bak，S.，Kahn，R.A.，Olsen，C.E.，和Halkier，B.A.(1997)ThePlantJournal，11(2)191-201)。此外，編碼羊毛甾醇C14-脫甲基酶的釀酒酵母CYP51A1在煙草中被功能性地表達(Grausem，B.，Chaubet，N.，Gigot，C.，Loper，J.C.，和Benveniste，P.(1995)ThePlantJournal，7(5)761-770)。固醇C14脫甲基酶和序列是本領域已知的。例如，Sorghumbicolor鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶CYP51mRNA在PlantJ.，11(2)191-201(1997)中被描述(全編碼序列(cds)登錄號U74319)。本發(fā)明的另一個方面在于包含編碼鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脫甲基酶的核酸序列的重組構建體和載體，以及制備鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶的方法，包括在使生成鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶的條件下培養(yǎng)用新的構建體或載體轉化的宿主細胞一段時間，和回收由此生成的鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶。固醇C5去飽和酶催化Δ5雙鍵的插入，這通常在Δ7-固醇水平上發(fā)生，從而形成Δ5，7固醇(Parks等，Lipids，30227-230(1995))。該反應被報道包括立體特異地去除5α和6α氫原子，這兩個氫原子分別由(+)和(-)R-甲羥戊酸4pro-R和5pro-S氫生物合成地產(chǎn)生(Goodwin，T.W.(1979)Annu.Rev.PlantPhysio.，30369-404)。該反應顯然是需要氧和NADPH或NADH的。去飽和酶已經(jīng)被報道是一種存在于微粒體中的多酶復合物。由去飽和酶本身、細胞色素b5和吡啶核苷酸依賴的黃素蛋白組成。Δ5-去飽和酶被報道是單加氧酶，其通過細胞色素b利用來自被還原的吡啶核苷酸的電子(Taton，M.，和Rahier，A.(1996)Arch.Biochem.Biophys.，325279-288)。編碼固醇-C5去飽和酶的擬南芥cDNA通過ERG3中缺乏erg3的酵母突變體的功能性互補物被克隆，ERG3是編碼麥角固醇生物合成必需的固醇C5去飽和酶的基因(GachotteD.，Husselstein，T.，Bard，M.，LacrouteF.，和Benveniste，P.(1996)ThePlantJournal，9(3)391-398)。已知的固醇C5去飽和酶可用于本發(fā)明，包括擬南芥固醇C5去飽和酶蛋白質(zhì)序列登錄號X90454，和在ThePlantJ.9(3)391-398(1996)中描述的固醇C5去飽和酶的擬南芥mRNA(全編碼序列登錄號g1061037)。NCBI(國家生物技術信息中心)數(shù)據(jù)庫顯示了37條固醇去飽和酶的序列，它們可以被用于本發(fā)明。如下是這種序列的示例。來自酵母C5固醇去飽和酶NP_013157(釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae))；推定的C5固醇去飽和酶裂殖體(fission)T40027(粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe))；C5固醇去飽和酶裂殖體T37759(粟酒裂殖酵母)；C5固醇去飽和酶JQ1146(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶BAA21457(粟酒裂殖酵母)；C5固醇去飽和酶CAA22610(粟酒裂殖酵母)；推定的C5固醇去飽和酶CAA16898(粟酒裂殖酵母)；可能的C5固醇去飽和酶O13666(erg3_schpo)；C5固醇去飽和酶P50860(Erg3_canga)；C5固醇去飽和酶P32353(erg3_yeast)；C5，6去飽和酶AAC99343(白色假絲酵母(candidaalbicans))；C5固醇去飽和酶BAA20292(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAB39844(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAB29844(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶CAA64303(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAA34595(釀酒酵母)；C5固醇去飽和酶AAA34594(釀酒酵母)。來自植物的C5固醇去飽和酶S71251(擬南芥)；推定的固醇C5去飽和酶AAF32466(擬南芥)；固醇C5去飽和酶AAF32465(擬南芥)；推定的固醇去飽和酶AAF22921(擬南芥(Arabidopsisthaliana))；Δ7-固醇C5去飽和酶(擬南芥)；固醇C5(6)去飽和酶同系物AAD20458(煙草)；固醇C5去飽和酶AAD12944(擬南芥)；固醇C5，6去飽和酶AAD04034(煙草)；固醇C5去飽和酶CAA62079(擬南芥)。來自哺乳動物的固醇C5去飽和酶(Musmusculus)BAA33730；固醇C5去飽和酶BAA33729(Homosapiens)；7-烯膽(甾)烷醇氧化酶CAB65928(Leishmaniamajor)；7-烯膽(甾)烷醇氧化酶(7-烯膽(甾)烷醇C5去飽和酶)088822(家鼠)；7-烯膽(甾)烷醇5去飽和酶075845(Homosapiens)；Δ7-固醇C5去飽和酶AAF00544(Homosapiens)。其他真菌固醇C5去飽和酶同系物BAA18970(Homosapiens)。對于可用于本發(fā)明的編碼固醇C5去飽和酶的DNA序列，NCBI核苷酸檢索“固醇去飽和酶”獲得110條序列。如下是這些序列的示例。NC_001139(釀酒酵母)；NC_001145(釀酒酵母)；NC_001144(釀酒酵母)；AW700015(physcomitrellapatens)；AB004539(粟酒裂殖酵母)；和AW596303(大豆(Glycinemax)；AC012188(擬南芥)。結合導入HMG-CoA還原酶基因以及固醇甲基轉移酶II基因到細胞中，來除了減少24-甲基固醇如菜油甾醇的沉積外，還減少固醇路徑中間的化合物沉積。已知的固醇甲基轉移酶II可以被用于本發(fā)明，包括擬南芥固醇甲基轉移酶II蛋白質(zhì)序列(來自FEBSLett.381(12)87-92(1996)登錄號X89867的完整mRNA編碼序列)。編碼任何一種前述的影響固醇生物合成路徑的酶的重組構建體可以被結合到包含重組構建體的重組載體中，該重組構建體包含分離的DNA分子。這種載體可以是細菌的或植物的表達載體。在優(yōu)選實施方案中，任何一種本發(fā)明的植物或生物體用本發(fā)明的核酸和編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇(obtusifoliol)C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶和固醇甲基轉移酶II的一種成員的基因轉化。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的植物或生物體用SEQIDNO1-4的一種或多種和編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶和固醇甲基轉移酶II的一種成員的基因轉化。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的植物或生物體用SEQIDNO1-4的一種或多種，編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶或固醇甲基轉移酶II的一種成員的基因，和在本文別處公開的編碼生育酚途徑酶的基因的一種或多種轉化。在還有一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的植物或生物體用SEQIDNO1-4的一種或多種和編碼選自鯊烯環(huán)氧酶、固醇甲基轉移酶I、固醇C4脫甲基酶、鈍葉鼠曲草醇C14α脫甲基酶、固醇C5去飽和酶或固醇甲基轉移酶II的一種成員的兩種基因和在本文別處公開的編碼生育酚途徑酶的兩種基因轉化。任何上述的生育酚和固醇生物合成基因的結合可以在一種或多種本領域已知和在本文描述的構建體或載體中被導入到植物。啟動子在一個實施方案中，任何被公開的核酸分子可以是啟動子。在一個優(yōu)選實施方案中，該啟動子是組織或器官特異性的，并且優(yōu)選是種子特異性的。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，啟動子優(yōu)先在胚乳或胚中表達相關的結構基因。在優(yōu)選實施方案中，啟動子優(yōu)選在種子胚胎發(fā)生過程中的確定時期啟動相關結構性基因的表達。在一個方面，如果在該組織或器官中mRNA以比在其他組織或器官中至少高10倍，優(yōu)選至少高100倍或至少高1000倍水平被表達，則該啟動子被認為是組織或器官特異性的?？梢栽趩蝹€時間點上或多個時間點上測定mRNA水平，同樣倍數(shù)增加可以是平均倍數(shù)增加或來自試驗測定值的推定值。由于是進行水平的比較，可以采用任何測定mRNA水平的方法。在優(yōu)選方面，被比較的組織或器官是種子或種子組織和葉片或葉片組織。在另一個優(yōu)選方面，比較多個組織或器官。優(yōu)選的多種比較是種子或種子組織與2，3，4，或多種組織或器官之間比較，這些組織或器官選自花組織、花原端、花粉、葉片、胚、苗、葉原基、苗端、根、根尖、維管組織和子葉。如在此所用，植物器官的例子是種子、葉片、根等。組織的例子是葉原基、根尖、維管組織等?？赏ㄟ^在生長和發(fā)育過程中的某一時間點或多個時間點，在特定組織中啟動子所特異產(chǎn)生的mRNA或蛋白質(zhì)積累量相對于總mRNA量來測定出啟動了活性或強度?？赏ㄟ^比較在生長和發(fā)育過程中的多個時間測得的組織中啟動子相對強度得出啟動子的時間譜(temporalprofile)?？蛇x地，啟動子的時間譜(temporalprofile)可以指相對于特性非常清楚的啟動子(即其表達譜以前已研究清楚)而言的。例如，目的啟動子可與報告序列(如GUS)可操作性連接并導入到特定細胞類型中。已知的啟動子可按相似方法制備并導入到相同背景的細胞中。目的啟動子的轉錄活性即可相對于已知啟動子，比較報告基因的表達時間來確定。所用細胞優(yōu)選為大豆。結構性核酸序列本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到結構性核酸序列上，該核酸序列相對于啟動子是異源的。結構性核酸序列一般可以是任何核酸序列，其轉錄水平有望被提高。結構性核酸序列優(yōu)選編碼適合于被結合到人類或動物的食物(diet)中的多肽，或該多肽產(chǎn)生某些其他農(nóng)業(yè)上的重要特性。合適的結構性核酸序列包括但是不限于編碼種子貯存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、固醇途徑酶和淀粉分支酶的核酸序列。優(yōu)選的種子儲存蛋白包括玉米蛋白(美國專利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；專利申請WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO97/28247，WO98/26064，和WO99/40209)，7S蛋白(美國專利5,003,045和5,576,203)，巴西堅果(brazilnut)蛋白(美國專利5,850,024)，不含苯丙氨酸的蛋白質(zhì)(專利申請WO96/17064)，白蛋白(專利申請WO97/35023)，β-伴球蛋白(conglycinin)(專利申請WO00/19839)，11S(美國專利6,107,051)，α-hordothionin(美國專利5,885,802和5885801)，arcelin種子儲存蛋白(美國專利5,270,200)，凝集素(美國專利6,110,891)，和麥谷蛋白(美國專利5,990,389和5,914,450)。優(yōu)選脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(美國專利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)，和去飽和酶(美國專利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)。優(yōu)選生育酚生物合成途徑酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dxr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr1737，和尿黑酸的雙加氧酶的反義構建體(Kridl等，SeedSci.Res.，1209219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)247-53(1989)；Nawrath，等.，Proc，Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9112760-12264(1994)；Xia等J.Gen.Microbiol.，1381309-1316(1992)；cyanobasehttp://www.kazusa.or.jp/cyanobase；Loisetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)，9879-9884(1998)；Norris等，PlantPhysiol.，1171317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，PlantPhysiol.，1041469-1470(1994)；Smith等，PlantJ.，1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily，等，PlantPhysiol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等，J.DNARes.，7(1)31-63(2000))。各種基因及其編碼的參與生育酚生物合成的蛋白質(zhì)被列舉在下表中。上表給出的“基因ID”確定與所列酶相關的基因。任何列于表中的出現(xiàn)在本公開中的基因ID是指編碼在表中與基因ID相關的酶的基因。優(yōu)選的氨基酸生物合成酶包括鄰氨基苯甲酸合成酶(美國專利5,965,727；專利申請WO97/26366，WO99/11800，和WO99/49058)，色氨酸脫羧酶(專利申請WO99/06581)，蘇氨酸脫羧酶(美國專利5,534,421和5,942,660,專利申請WO95/19442)，蘇氨酸脫氨酶(專利申請WO99/02656，和WO98/55601)，和天門冬氨酸激酶(美國專利5,367,110；5,858,749；和6,040,160)。優(yōu)選的淀粉分支酶包括那些列舉在美國專利6,232,122和6,147,279；和專利申請WO97/22703中的酶。此外，啟動子和結構性核酸序列可以設計成下調(diào)(downregulate)特定核酸序列。這一般是通過將啟動子連接到結構性核酸序列上來實現(xiàn)，該序列以反義方向被引導。本領域的普通技術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列可以以這種方式被反面調(diào)節(jié)。這種調(diào)控的靶點可能包括具有低必需氨基酸含量的多肽，但是這種多肽在特定組織中以相對較高水平被表達。例如，β-伴球蛋白和大豆球蛋白在種子被豐富地表達，但是從必需氨基酸角度考慮是缺乏營養(yǎng)的。這種反義方法還可以被用于有效地從植物來源的飼料中去除不期望的蛋白質(zhì)，如拒食素(如凝集素)、白蛋白和過敏原，或者下調(diào)參與降解期望的化合物如必需氨基酸的分解代謝酶。改進的結構性核酸序列本發(fā)明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的結構性核酸序列上，該核酸序列相對于啟動子是異源的。這種結構性核酸序列可以被改進來產(chǎn)生各種期望的特性。例如，結構性核酸序列可以被改進來增加必需氨基酸的含量、提高氨基酸序列的翻譯、改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點)、將翻譯產(chǎn)物轉運到細胞內(nèi)外的腔室、改善蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、插入或刪除細胞信號基序，增加植物細胞或器官的大小等等。在優(yōu)選實施方案中，結構性核酸序列被增強來編碼至少一種和更加優(yōu)選2，3，或4種必需氨基酸含量升高的多肽，這些必需氨基酸選自組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸。如果需要，還可以添加非必需氨基酸，從結構和營養(yǎng)上提高該多肽。特別適合于這種升高的結構性核酸序列包括那些編碼天然多肽的序列，這些多肽以相對高的水平被表達，具有特別低的必需氨基酸含量或包含這兩種情況。這種多肽的例子是種子貯存蛋白，如大豆球蛋白和β-伴球蛋白。其他合適的靶包括arcelin、菜豆蛋白、凝集素、玉米蛋白和白蛋白。結構性核酸序列中的密碼子使用由于遺傳密碼的簡并性，不同核苷酸密碼子可以被用于編碼特定氨基酸。宿主細胞通常具有密碼子使用的選擇模式。結構性核酸序列優(yōu)選被構建來利用特定宿主細胞的密碼子選擇模式。這通常在被轉化的宿主細胞中增強結構性核酸序列的表達。任何上述核酸和氨基酸序列可以被改進來體現(xiàn)含有它們的宿主細胞或生物體的優(yōu)選密碼子選擇。在植物中進行最佳密碼子使用的對結構性核酸序列的修飾在美國專利5,689,052中被描述。結構性核酸序列的其他修飾上述結構性核酸序列中的其他變體可以編碼當與用于加工得到它們的蛋白質(zhì)比較時具有相當或更好特性的蛋白質(zhì)。突變包括刪除、插入、截斷、取代、融合、基序序列改組等。對結構性核酸序列的突變可以以特定或隨機的方式被導入，這兩種方法是分子生物學領域的技術人員熟知的。還有許多定點突變技術，一般采用寡核苷酸來在結構性核酸序列的特定位點上導入突變。例子包括單鏈拯救(Kunkel等，1985)，特定位點消除(Deng和Nickloff，1992)，缺口保護(Vandeyar等，1988)，和PCR(Costa等，1996)。隨機或非特異性突變可以化學試劑產(chǎn)生(綜述，參見Singer和Kusmierek，1982)如亞硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)，和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通過生物學方法如通過增變株傳代(Greener等，1997)。用于制備上面描述的改變的其他方法被描述在Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；FritsEckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；和Osuna等(1994)。這種修飾可能在氨基酸序列上產(chǎn)生保守或非保守的變化。保守變化是不改變最終的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變化。在優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)具有約5個和約500個之間的保守變化，更加優(yōu)選約10個和約300個之間的保守變化，甚至更加優(yōu)選約25個和約150個之間的保守變化和最優(yōu)選在約5個和約25個之間的保守變化或在約1個和約5個之間的保守變化。非保守變化包括添加、刪除和取代，這產(chǎn)生被改變的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，蛋白質(zhì)具有約5個和約500個之間的非保守變化，更加優(yōu)選約10個和約300個之間的非保守變化，甚至更加優(yōu)選約25個和約150個之間的非保守變化和最優(yōu)選在約5個和約25個之間的非保守變化或在約1個和約5個之間的非保守變化?？梢詫Ρ疚墓_的蛋白質(zhì)序列和編碼它們的核酸序列進行修飾，保留這些分子的期望特性。如下是基于改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列來產(chǎn)生相當?shù)幕蚩赡苁歉倪M的第二代分子的討論。氨基酸變化可以根據(jù)表2中給出的密碼子來改變結構性核酸序列的密碼子來實現(xiàn)。氨基酸的密碼子簡并性一些氨基酸可以被用于取代蛋白質(zhì)序列中的其他氨基酸，而不使期望活性產(chǎn)生可評估的損失。因此，可預期地在肽序列或蛋白質(zhì)序列或者它們的相應核酸序列中進行各種改變，而不使生物活性產(chǎn)生可檢測的損失。在進行這種改變時，考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水氨基酸指標在賦予一種蛋白質(zhì)交互式生物學功能中的重要性是本領域認可的(Kyte和Doolittle，1982)。一般認為，氨基酸的相對親水性特性產(chǎn)生生成的蛋白質(zhì)的二級結構，該二級結構隨后限定該蛋白質(zhì)與其他分子的互作，例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等?？梢愿鶕?jù)每種氨基酸的疏水性和電荷特征賦予其親水指數(shù)。即異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本領域已知，一些氨基酸可以被其他具有相似親水指數(shù)或值的氨基酸取代，并且仍然能夠生成具有相似生物學活性的蛋白質(zhì)，即仍然獲得具有生物學功能的蛋白質(zhì)。在進行這種改變中，親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸取代是更加優(yōu)選的，親水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸取代是最優(yōu)選的。本領域還理解，類似氨基酸的取代可以根據(jù)親水性有效地進行。美國專利4,554,101指出蛋白質(zhì)的最大局部平均親水性受其鄰近的氨基酸的控制，與蛋白質(zhì)的生物學性質(zhì)相關。如下親水性值被賦予氨基酸精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。一般認為，一些氨基酸可以被其他具有相似親水性值的氨基酸取代，并且仍然能夠生成具有相似生物學活性的蛋白質(zhì)，即仍然獲得具有生物學功能的蛋白質(zhì)。在進行這種改變中，親水指數(shù)在±2內(nèi)的氨基酸取代是優(yōu)選的，親水指數(shù)在±1內(nèi)的氨基酸取代是更加優(yōu)選的，親水指數(shù)在±0.5內(nèi)的氨基酸取代是最優(yōu)選的。如上簡要描述，氨基酸取代是基于氨基酸側鏈取代的相對相似性，如，其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]各種前述特性的示例性取代是本領域技術人員已知的，包括精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。如果相對于加工獲得它們的未改進的多肽，生成的蛋白質(zhì)具有改進的對瘤胃的抗性，增強對蛋白質(zhì)水解降解的抵抗，或者同時具有改進的對瘤胃的抗性并增強對蛋白質(zhì)水解降解的抵抗，被認為是不期望的改變也可以被使用?；蛘?，進行改變以改善代謝酶的動力學。在一個優(yōu)選方面，被改進的蛋白質(zhì)選自種子貯存蛋白質(zhì)、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶或淀粉分支酶。重組載體任何一種上面描述的啟動子和結構性核酸序列可以在重組載體中被提供。重組載體一般包括，從5′到3′方向引導結構性核酸序列轉錄的啟動子和結構性核酸序列。合適的啟動子和結構性核酸序列包括本文描述的那些。如果需要，重組載體還可以包括3′轉錄終止子、3′多聚腺苷酸化信號、其他非翻譯核酸序列、轉運和靶向核酸序列、可選擇標記、增強子和操作子。用于制備重組載體的方法是本領域熟知的。用于制備特別適合于植物轉化的重組載體的方法被描述在美國專利4,971,908；4,940,835；4,769,061；和4,757,011中。這些類型的載體也已經(jīng)被評述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。用于在高等植物中表達核酸的典型載體是本領域熟知的，包括來自根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。其他可以用于植物轉化的重組多肽包括pCaMVCN轉化控制載體，也已經(jīng)被描述(Fromm等，1985)。在一個實施方案中，多個啟動子在單構建體中被可操作地連接到任何結構基因的組合上。在優(yōu)選實施方案中，任何1，2，3，4，5，或6或多種包含SEQIDNO1-4的核酸分子的組合在單個構建體中被可操作地連接到任何結構基因的組合上。在優(yōu)選實施方案的另一個方面，核酸分子被修飾。這種修飾包括例如去除或添加一種或多種結構性或功能性的元件。重組載體中的其他啟動子還可以在重組載體中提供一種或多種其他啟動子。這些啟動子可以被可操作地連接到，例如但不限于，任何上述的結構性核酸序列上?？蛇x擇地，啟動子可以被可操作地連接到其他核酸序列上，如那些編碼轉運肽、可選擇的標記蛋白的序列或反義序列。這些其他的啟動子可以根據(jù)將插入載體的細胞的類型來選擇。此外，在細菌、酵母和植物中起作用的啟動子都在本領域中被充分地教導。其他啟動子還可以根據(jù)其調(diào)控特性來選擇。這種特性的例子包括增強轉錄活性、可誘導性、組織特異性和發(fā)育階段特異性。在植物中，可誘導的、病毒的或合成來源的、組成型活性的、時間調(diào)控的和空間調(diào)控的啟動子都已經(jīng)被描述(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。常用的組成型啟動子包括CaMV35S啟動子(Odell等，1985)、增強的CaMV35S啟動子、玄參(Figwort)花葉病毒(FMV)啟動子(Richins等，1987)、甘露堿合成酶(mas)啟動子，胭脂堿合成酶(nos)啟動子和章魚堿合成酶(ocs)啟動子。有用的可誘導的啟動子包括被水楊酸或聚丙烯酸誘導的啟動子(PR-1；Williams等，1992)，由應用安全劑誘導的啟動子(替代苯磺酰胺除草劑；Hershey和Stoner，1991)、熱休克啟動子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)、來自菠菜亞硝酸鹽還原酶結構性核酸序列的硝酸鹽誘導的啟動子(Back等，1991)、激素誘導的啟動子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)、和與RuBP羧化酶小亞基和LHCP家族相關的光誘導的啟動子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，1991；Lam和Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。有用的組織或器官特異性啟動子的例子包括β-伴球蛋白，(Doyle等，1986；Slighton和Beachy，1987)和其他種子特異性啟動子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam和Chua，1991)。用于在種子中優(yōu)先表達的植物功能性啟動子包括來自植物儲存蛋白和來自參與油料種子中的脂肪酸生物合成的啟動子。這種啟動子的例子包括來自這種的結構性核酸序列的5′調(diào)控區(qū)，如napin(Kridl等，1991)、菜豆蛋白、玉米蛋白、大豆胰島素抑制劑、ACP、硬酯酰-ACP去飽和酶和oleosin。種子特異性調(diào)控還在EP0255378中被討論。另一種示例性的種子特異性啟動子是凝集素啟動子。大豆種子中的凝集素啟動子由單一的結構性核酸序列(Lel)編碼，該序列僅在種子發(fā)育過程中被表達。凝集素結構性核酸序列和種子特異性啟動子已經(jīng)被表征，并被用于在轉基因煙草植物中引導種子特異性表達(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。重組載體中的其他特別優(yōu)選的啟動子包括胭脂堿合成酶(nos)、甘露堿合成酶(mas)和章魚堿合成酶(ocs)啟動子，在根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導質(zhì)粒中攜帶這些啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子；增強的CaMV35S啟動子；玄參花葉表達病毒(FMV)35S啟動子；來自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞基的光誘導啟動子(ssRUBISCO)；煙草EIF-4A啟動子(Mandel等，1995)；玉米蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；玉米乙醇脫氫酶1(Vogel等，1989)；玉米集光(lightharvesting)復合物(Simpson，1986)；玉米熱休克蛋白(Odell等，1985)；來自擬南芥的幾丁質(zhì)酶啟動子(Samac等，1991)；來自椰菜的LTP(脂肪轉運蛋白)啟動子(Pyee等，1995)；矮牽牛查耳酮異構酶(VanTunen等，1988)；豆富含甘氨酸的蛋白1(Keller等，1989)；馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)；來自玉米的泛素啟動子(Christensen等，1992)；和來自稻的肌動蛋白啟動子(McElroy等，1990)。其他啟動子優(yōu)選是種子選擇性的、組織選擇性的、組成型的或可誘導的。啟動子最優(yōu)選為胭脂堿合成酶(nos)、章魚堿合成酶的(ocs)、甘露氨酸合成酶(mas)的花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)、增強的CaMV(eCaMV)、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)、玄參花葉病毒(FMV)、CaMV來源的AS4、煙草RB7、小麥POX1、煙草EIF-4、凝集素蛋白(Lel)或稻RC2啟動子。具有其他結構性核酸序列的重組載體重組載體可能還含有一種或多種其他結構性核酸序列。這些其他結構性核酸序列一般是適合于用在重組載體中的任何序列。這種結構性核酸序列包括但是不限于上述序列。其他結構性核酸序列還可以被可操作地連接到任何上述啟動子上。一種或多種結構性核酸序列可以各自地被連接到各個啟動子上?？蛇x擇地，結構性核酸序列可以被可操作地連接到單一啟動子上(即單一操縱子)。其他結構性核酸序列包括但是不限于那些編碼種子儲存蛋白、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和淀粉分支酶的核酸。優(yōu)選的種子儲存蛋白質(zhì)包括玉米蛋白(美國專利4,886,878；4,885,357；5,215,912；5,589,616；5,508,468；5,939,599；5,633,436；和5,990,384；專利申請WO90/01869，WO91/13993，WO92/14822，WO93/08682，WO94/20628，WO97/28247，WO98/26064，和WO99/40209)，7S蛋白質(zhì)(美國專利5,003,045和5,576,203)，巴西堅果蛋白(美國專利5,850,024)，無苯丙氨酸蛋白(專利申請WO96/17064)，白蛋白(專利申請WO97/35023)，β-伴球蛋白(專利申請WO00/19839)，11S(美國專利6,107,051)，α-hordothionin(美國專利5,885,802和5,88,5801)arcelin種子儲存蛋白(美國專利5,270,200)凝集素(美國專利6,110,891)和麥谷蛋白(美國專利5,990,389和5,914,450)。優(yōu)選的脂肪酸途徑酶包括硫酯酶(美國專利5,512,482；5,530,186；5,945,585；5,639,790；5,807,893；5,955,650；5,955,329；5,759,829；5,147,792；5,304,481；5,298,421；5,344,771；和5,760,206)和去飽和酶(美國專利5,689,050；5,663,068；5,614,393；5,856,157；6,117,677；6,043,411；6,194,167；5,705,391；5,663,068；5,552,306；6,075,183；6,051,754；5,689,050；5,789,220；5,057,419；5,654,402；5,659,645；6,100,091；5,760,206；6,172,106；5,952,544；5,866,789；5,443,974；和5,093,249)。優(yōu)選的生育酚生物合成酶包括tyrA，slr1736，ATPT2，dxs，dwr，GGPPS，HPPD，GMT，MT1，tMT2，AANT1，slr1737和尿黑酸雙加氧酶的反義構建體(Kridl等，SeedSci.Res.，1209219(1991)；Keegstra，Cell，56(2)247-53(1989)；Nawrath，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9112760-12764(1994)；Xia等，J.Gen.Microbiol.，1381309-1316(1992)；Cyanobasehttp://www.kazusa.or.jp/cyanobase；Lois等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)2105-2110(1998)；Takahashi等Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(17)9879-9884(1998)；Norris等，PlantPhysiol.，1171317-1323(1998)；Bartley和Scolnik，PlantPhysiol，1041469-1470(1994)；Smith等，PlantJ.，1183-92(1997)；WO00/32757；WO00/10380；SaintGuily等，PlantPhysiol.，100(2)1069-1071(1992)；Sato等.，J.DNARes.，7(1)31-63(2000))。優(yōu)選的氨基酸生物合成酶包括鄰氨基苯甲酸合成酶(美國專利5,965,727，專利申請WO97/26366，WO99/11800和WO99/49058)，色氨酸脫羧酶(專利申請WO99/06581)，蘇氨酸脫羧酶(美國專利5,534,421和5,942,660；專利申請WO95/19442)，蘇氨酸脫氨酶(專利申請WO99/02656和WO98/55601)，和天冬氨酸激酶(美國專利5,367,110；5,858,749和6,040,160)。優(yōu)選的淀粉分支酶包括在美國專利6,232,122和6,147,279以及專利申請WO97/22703中列舉的那些?？蛇x擇地，第二條結構性核酸序列可能被設計來下調(diào)特定核酸序列。這一般通過將該第二條結構性氨基酸以反義方向可操作地與啟動子連接來實現(xiàn)。本領域技術人員熟悉這種反義技術。任何核酸序列以這種方式被負調(diào)控。優(yōu)選的靶核酸序列含有低含量的必需氨基酸，但是在特定組織中以較高水平被表達。例如，β-伴球蛋白和大豆球蛋白在種子中被豐富地表達，但是從必需氨基酸來考慮是缺乏營養(yǎng)的。這種反義方法也可以被用于有效地從植物來源的foodstuff去除其他不期望的蛋白質(zhì)，如拒食素(如凝集素)、白蛋白和過敏原，或者下調(diào)參與降解期望的化合物如必需氨基酸的分解代謝酶?？蛇x擇的標記載體或構建體還可以包括可選擇的標記?？蛇x擇的標記還可以被用于選擇含有外源遺傳物質(zhì)的植物或植物細胞。這種例子包括但是不限于neo基因(Potrykus等，1985)，其編碼卡那霉素抗性，可以用卡那霉素、RptII、G418、hpt等選擇；bar基因，其編碼bialaphos抗性；突變EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988；Reynaerts等，1988)；aadA(Jones等，1987)，其編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予對bromoxynil的抗性(Stalker等，1988)；突變的乙酰乙酸合成酶基因(ALS)，其賦予咪唑酮和磺脲抗性(歐洲專利申請154,204(1985))，ALS(D′Halluin等，1992)，和甲氨蝶呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)?？蛇x擇的標記優(yōu)選是抗生素抗性編碼序列或除草劑(例如，草甘膦)抗性編碼序列?？蛇x擇的標記最優(yōu)選為卡那霉素、潮霉素或除草劑抗性標記。載體或構建體還可以包括篩選標記。篩選標記可以被用以監(jiān)控表達。示例性的篩選標記包括β-葡萄糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，其編碼其各種發(fā)光底物已知的酶(Jefferson，1987)；R-基因座基因，其編碼在植物組織中調(diào)節(jié)花色苷色素(紅色)生成的產(chǎn)物(Dellaporta等，1988)；β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，編碼一種各種發(fā)光底物已知的酶的基因(例如PADAC，發(fā)光頭孢菌素(cephalosporin))；熒光素酶基因(Ow等，1986)；xylE基因(Zukowsky等，1983)，其編碼能夠轉化發(fā)光的兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，其編碼能夠將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌的酶，隨后多巴醌濃縮為黑色素；α-半乳糖苷酶，其轉化發(fā)光的α半乳糖底物。術語或短語“可選擇的或篩選的標記基因”中包括的還有編碼可選擇標記的基因，這些可選擇標記的分泌可以被檢測來作為鑒定或選擇被轉化的細胞的手段。例子包括編碼可以被抗體作用確定的可分泌抗原標記，或者甚至是可以酶促地檢測的可分泌酶?？煞置诘鞍追譃樵S多種類，包括可檢測的小的擴散性蛋白(如通過ELISA)，在細胞外溶液中可檢測的小的活性酶(如α-淀粉酶，β-內(nèi)酰胺酶，膦絲菌素轉移酶)或者被插入或捕獲在細胞壁上的蛋白質(zhì)(例如包括先導序列的蛋白質(zhì)如存在于延展的表達單位中的蛋白或煙草PR-S)。其他可能的可選擇的和/或可篩選的標記基因對于本領域技術人員來說是顯而易見的。重組載體中的其他元件各種順式作用非翻譯的5′和3′調(diào)控序列可以被包括在重組核酸載體中。任何一種這樣調(diào)控序列可以與其他調(diào)控序列一起被提供在重組載體中。這種組合可以被設計和改進來產(chǎn)生期望的調(diào)控特性。3′非翻譯區(qū)通常具有轉錄終止信號和聚腺苷酸化信號，聚腺苷酸化信號在植物中起作用來將腺苷酸添加到mRNA的3′端。這些元件可以從胭脂堿合成酶(nos)編碼序列、大豆7Sα′儲存蛋白編碼序列、arcelin-5編碼序列、白蛋白編碼序列和豌豆ssRUBlSCOE9編碼序列的3′區(qū)獲得。一般地，位于多聚腺苷酸化位點下游的數(shù)百個堿基對的核酸序列起終止轉錄的作用。這些區(qū)域是被轉錄mRNA有效多聚腺苷酸化所必需的。轉錄增強子也可以被結合作為重組載體的一部分。因此，重組載體優(yōu)選地含有一個或多個5′非翻譯前導序列，其起增強核酸序列表達的作用。這種增強子序列可能有望增加或改變生成的mRNA的轉錄效率。優(yōu)選的5′核酸序列包括dSSU5′、PetHSP705′和GmHSP17.95′(美國專利5,362,865)。重組載體可能還包含編碼轉運肽的核酸序列。這種肽可以被用于引導蛋白質(zhì)到細胞外區(qū)域、質(zhì)體或到細胞內(nèi)外的一些其他腔室(參見，如EP0218571、美國專利4,940,835；5,88,624；5,610,041；5,618,988和6,107,060)。重組載體中的結構核酸序列可能包含內(nèi)含子。該內(nèi)含子對于結合性核酸序列來說可能是異源的。優(yōu)選的內(nèi)含子對于單子葉植物包括水稻肌動蛋白內(nèi)含子和玉米HSP70內(nèi)含子，對于雙子葉植物包括豌豆rbcS3A內(nèi)含子和矮牽?；⊿SU301內(nèi)含子。融合蛋白任何上述的結構性核酸序列及其改進形式可以與其他核酸序列連接來編碼融合蛋白。其他核酸序列優(yōu)選編碼至少1種氨基酸、肽或蛋白質(zhì)。存在許多可能的融合組合。例如，融合蛋白可能提供一種“標記”的表位來方便融合蛋白的檢測，例如，GST，GFP，F(xiàn)LAG，或多聚HIS。這種融合優(yōu)選編碼1-50個氨基酸，更加優(yōu)選5-30個其他的氨基酸，甚至最優(yōu)選在5-20個氨基酸。可選擇地，融合可能具有調(diào)控、酶促、細胞信號或細胞內(nèi)轉運的功能。例如，編碼質(zhì)粒轉運肽的序列可以被添加來引導融合蛋白到種子中的葉綠體中。這種融合配偶體優(yōu)選編碼1-1000個其他氨基酸，更加優(yōu)選5-500個其他氨基酸，和甚至更加優(yōu)選10-250個氨基酸。序列分析在本發(fā)明中，序列相似性或同一性優(yōu)選采用序列分析軟件包TM的“BestFit”或“Gap”程序來確定(版本10；GeneticsComputerGroup，Inc.，UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter，Madison，WI)。“Gap”采用Needleman和Wunsch(Needleman和Wunsch，1970)的算法來尋找兩條序列的排列，這種排列使匹配數(shù)量最大化和缺口數(shù)量最小化?！癇estFit”進行兩條序列之間的相似性的最好片段的最佳排列。最佳排列采用Smith和Waterman(SmithandWaterman，1981；Smith等，1983)的局部同源性算法通過插入缺口來最小化匹配數(shù)量來發(fā)現(xiàn)。上面描述的序列分析軟件包含有大量其他有用的序列分析工具來確定本公開的核苷酸和氨基酸序列的同系物。例如，“BLAST”程序在特定數(shù)據(jù)庫(例如由Bethesda，MD的國家生物信息中心(NCBI)維護的序列數(shù)據(jù)庫)中檢索與被檢索的序列(肽或核酸)相似的序列；“FastA”(Lipman和Pearson，1985；參見還有Pearson和Lipman，1988；Pearson，1990)進行Pearson和Lipman檢索來確定被檢索序列與一組相同類型(核酸或蛋白質(zhì))的序列之間的相似性?！癟fastA”進行Pearson和Lipman檢索來確定一種蛋白質(zhì)的被查詢序列與任何一組核苷酸序列(在進行比較之前，以所有6種閱讀框翻譯核苷酸序列)之間的相似性；“FastX”進行Pearson和Lipman檢索來確定被檢索的核酸序列與一組蛋白質(zhì)序列之間的相似性，考慮移碼?！癟fastX”進行Pearson和Lipman檢索來確定被檢索的蛋白質(zhì)序列與任何一種核苷酸序列之間的相似性，考慮移碼(在進行比較之前，翻譯核酸序列的兩條鏈)。探針和引物能夠特異性地雜交到互補性核酸序列上的短核酸序列可以被制備，并被用于本發(fā)明。這種短的核酸分子可以被用作探針來鑒定在特定樣本中是否存在互補的核酸序列。因此，通過構建與特定核酸序列的小部分互補的核酸探針，核酸序列的存在可以被檢測和評價?？蛇x擇地，短的核酸序列可以被用作寡核苷酸引物，采用PCR技術來擴增或突變互補的核酸序列。這些引物可能還方便擴增相關互補的核酸序列(例如，來自其他物種的相關核酸序列)。短的核酸序列可以被用作引物和特異地作為PCR引物。PCR探針是能夠在雙鏈結構中與其他核酸一起起始聚合酶活性的核酸分子。本領域存在各種用于確定PCR引物結構的方法和PCR技術。采用程序如Primer3問(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STSPipeline)或者GeneUp(Pesole等，1998)在計算機中進行的檢索可以被用于確定潛在的PCR引物。任何本文公開的核酸序列可以被用作引物或探針。這些探針或引物的使用極大地方便確定轉基因植物，該轉基因植物含有本發(fā)明公開的啟動子和結構性核酸序列。這種探針或引物還可以被用于篩選與本申請公開的啟動子和結構性核酸序列相關或具有同源性的其他核酸序列的cDNA或基因組文庫。引物或探針通常與被鑒定、擴增或突變的核酸序列的一部分互補，該序列足夠長以與其互補體形成穩(wěn)定的和序列特異性的雙鏈核酸分子。引物或探針優(yōu)選為長約10到約200個核苷酸，更加優(yōu)選為長約10到約100個核苷酸，甚至更加優(yōu)選為長約10到約50個核苷酸，和最優(yōu)選為長約14到約30個核苷酸。引物或探針例如但是不限于通過直接化學合成、通過PCR(美國專利4,683,195和4,683,202)或通過從較大的核酸分子上切除核酸特異性片段來制備。轉基因植物和轉化的植物宿主細胞本發(fā)明還涉及轉基因植物和轉化的宿主細胞，其包含被可操作地連接到異源的結構性核酸序列的啟動子。其他核酸序列也可能與啟動子和結構性核酸序列一起被導入到植物或宿主細胞中。這些其他序列可能包括3′轉錄終止子、3′多聚腺苷酸信號、其他的非翻譯核酸序列、轉運或靶向序列、可選擇標記、增強子和操縱子。上面描述了本發(fā)明的優(yōu)選核酸序列，包括重組載體、結構性核酸序列、啟動子和其他調(diào)控元件。在本發(fā)明的進一步實施方式中，此處描述的任何啟動子序列均可用于表達改善植物總的幼苗活力的基因。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的具有改善的幼苗活力的植物包含SEQIDNO1或2所示的序列。在此處，幼苗所具有的“改善的幼苗活力”是指相對于具有類似遺傳背景但缺乏本發(fā)明啟動子序列的植物而言，所述幼苗的活力被改善。在本發(fā)明的進一步實施方式中，此處描述的任何啟動子序列均可用于表達改善幼苗植株的生長率的基因。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的具有改善的幼苗生長率的植物包含SEQIDNO1或2所示的序列。在此處，幼苗所具有的“改善的生長率”是指相對于具有類似遺傳背景但缺乏本發(fā)明啟動子序列的植物而言在相同生長階段，所述幼苗的生長速度更快。在本發(fā)明的進一步實施方式中，此處描述的任何啟動子序列均可用于表達能夠延長植物在種子飽滿充實(fillitsseed)階段的時間的基因。在優(yōu)選實施方式中，對種子的飽滿包括大豆植物中對豆莢的飽滿和玉米中對玉米籽的飽滿。在本發(fā)明的另一實施方式中，此處描述的任何啟動子序列均可用于表達改變植物的庫容強度調(diào)節(jié)(sinkstrengthregulation)以增強種子中谷粒的飽滿率。在此處，“改變”植物的庫容強度調(diào)節(jié)指相對于類似遺傳背景但缺乏本發(fā)明啟動子序列的植物而言，增加或降低植物的庫容強度調(diào)節(jié)。在本發(fā)明另一實施方式，此處描述的任何啟動子序列均可用于表達調(diào)節(jié)或增強種子活力或種子貯藏性能，以改善出苗率(standcount)和/或產(chǎn)量。在優(yōu)選實施方式中，轉基因植物或轉化宿主細胞中包含種子啟動子。在最優(yōu)選實施方式中，轉基因植物和轉化宿主細胞包含本發(fā)明此處描述的任何核酸分子，包括選自SEQIDNOs1-4所示序列及其互補序列的核酸分子。在特別優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明轉基因植物是大豆植物。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的大豆包含植株被導入一或多個本發(fā)明的核酸分子。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的轉化的大豆植株包含選自SEQIDNOs1-4所示序列的核酸分子。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明轉化的大豆植株包括含SEQIDNOs1所示序列的核酸分子。用于制備這種重組載體的方法在本領域是熟知的。例如，用于制備突變特別適合于植物轉化的重組載體的方法被描述在美國專利4,971,908；4,940,835；4,769,061；和4,757,011中。這些載體也被評述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。用于在細胞和高等植物中表達核酸的典型載體在本領域是熟知的，包括來自根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(Ti)質(zhì)粒的載體(Rogers等，1987)。可用于植物轉化的其他重組載體也已經(jīng)被描述(Fromm等，1985)。這種重組載體的元件包括但是不限于上面討論的那些。轉化的宿主細胞通常是任何與本發(fā)明相容的細胞。轉化的宿主植物或細胞可以是或來源于單子葉植物或雙子葉植物，包括但是不限于，canola、海甘藍(crambe)、玉米、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、大豆、Arabidopsisphaseolus、花生、紫花苜蓿、小麥、稻、燕麥、高梁、油菜籽、黑麥、tritordeum、粟類(millet)、酥油草(fescue)、多年生黑麥草(perennialryefrass)、甘蔗、酸果(cranberry)、番木瓜(papaya)、香蕉、紅花、油椰櫚(oilpalms)、亞麻(flax)、香瓜(muskmelon)、蘋果、黃瓜、石斛蘭(dendrobium)、唐菖蒲(gladiolus)、菊花(chrysanthemum)、百合(liliacea)、棉花、桉樹(eucalyptus)、向日葵、蕓苔(Brassicacampestris)、歐洲油菜(Brassicanapus)、草坪草(turfgrass)、甜菜(sugarbeet)、咖啡(coffee)和薯蕷屬(dioscorea)(Christou，ParticleBombardnzentforGeneticEngineeringofPlants，BiotechnologyIntelligenceUnit，學院出版社，圣地亞哥，加利福尼亞(1996))，canola、玉米、蕓苔、歐洲油菜、油菜籽、大豆、紅花、小麥，水稻和向日葵是優(yōu)選的，而canola、油菜籽、玉米、蕓苔，歐洲油菜、大豆、向日葵、紅花、油椰子和花生是更加優(yōu)選的。在特別優(yōu)選的實施方案中，植物或細胞是或者來源于canola。在另一個特別優(yōu)選實施方案中，植物或細胞是或來源于歐洲油菜。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，植物或細胞是或者來源于大豆。大豆細胞或植物優(yōu)選是原種(elite)大豆品系?！霸N品系”是任何從繁育和從優(yōu)良的農(nóng)學操作選擇中可商業(yè)獲得的品系。原種品系的例子包括并不限于下述的，如HARTZTM品種H4994，HARTZTM品種H5218，HARTZTM品種H5350，HARTZTM品種H5545，HARTZTM品種H5050，HARTZTM品種H5454，HARTZTM品種H5233，HARTZTM品種H5488，HARTZTM品種HLA572，HARTZTM品種H6200，HARTZTM品種H6104，HARTZTM品種H6255，HARTZTM品種H6586，HARTZTM品種H6191，HARTZTM品種H7440，HARTZTM品種H4452RoundupReadyTM，HARTZTM品種H4994RoundupReadyTM，HARTZTM品種H4988RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5000RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5147RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5247RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5350RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5545RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5855RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5088RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5164RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5361RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5566RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5181RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5889RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5999RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6013RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6255RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6454RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6686RoundupReadyTM，HARTZTM品種H7152RoundupReadyTM，HARTZTM品種H7550RoundupReadyTM，HARTZTM品種H8001RoundupReadyTM(HARTZSEED，Stuttgart，AR)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459，andQP4544(AsgrowSeeds，DesMoines，IA)；DeKalb品種CX445(DeKalb，IL)。本發(fā)明還涉及一種制備轉化植物的方法，該植物從5′到3′方向包括被可操作地連接到異源結構性核酸序列的啟動子。其他序列也可以與啟動子和結構性核酸來一起被導入到植物中。這些其他可能包括3′轉錄終止子、3′多聚腺苷酸化信號、其他非翻譯序列、轉運或靶向序列、可選擇標記、增強子和操作子。優(yōu)選的重組載體、結構性核酸序列、啟動子和其他調(diào)控序列包括但是不限于本文描述的那些。這種方法通常包括選擇合適的植物、用重組載體轉化植物，獲得轉化的宿主細胞的步驟。有許多用于將核酸導入植物的方法。合適方法包括細菌感染(如農(nóng)桿菌)、雙元人工染色體載體、直接呈遞核酸(如通過PEG介導的轉化、干燥/抑制介導的核酸攝取、電穿孔、用碳化硅纖維激發(fā)，和加速核酸包被的粒子等(在Potrykus等，1991中被評述))。用于將核酸導入細胞中的技術是本領域技術人員熟知的。一般可以將方法分為四類(1)化學方法(Graham和vanderEb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如微注射(Capecchi，1980)、電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美國專利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；和(4)受體介導的機制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)?？蛇x擇地，可以通過直接注射植物生殖器官將核酸直接導入到花粉中(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。在另一個方面，核酸還可以被注射到未成熟的胚中(Neuhaus等，1987)。本領域已經(jīng)教導了從被轉化的植物原生質(zhì)體或外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植物(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)。轉化株通常在存在選擇性培養(yǎng)液時被培養(yǎng)，該培養(yǎng)液選擇被成功轉化的細胞，并且包括再生植物幼苗(Fraley等，1983)。這種幼苗通常在2-4個月之內(nèi)獲得。然后幼苗被轉移到合適的誘導根的培養(yǎng)液中，該培養(yǎng)液含有選擇試劑和防止細菌生長的抗生素。許多幼苗將會生長出根來。然后這些幼苗被轉移到土壤或者其他介質(zhì)中，使根繼續(xù)發(fā)育。所概述的方法通常根據(jù)所選用的特定植物而改變。優(yōu)選地，再生的轉基因植物是自花授粉的，產(chǎn)生純合的轉基因植物?？蛇x擇地，從再生轉基因植物中獲得的花粉可以與非轉基因植物雜交，優(yōu)選與農(nóng)業(yè)上重要的品種的近交系雜交。相反，來自非轉基因植物的花粉可以被用于對再生的轉基因植物授粉。轉基因植物可以將編碼增強基因表達的核酸序列傳遞給其后代。轉基因植物優(yōu)選是編碼增強基因表達的核酸純合的，并且通過有性繁殖將該序列傳遞給所有其后代。后代可能從由轉基因植物生成的種子中生長得到。然后，這些額外的植物被自花授粉來產(chǎn)生該植物的真正繁殖品系。評價來自這些植物的后代的基因表達?；虮磉_可以通過許多常規(guī)方法如western印跡、northern印跡、免疫沉淀和ELISA來檢測。本發(fā)明的植物或試劑可以被用于方法中，例如但是不限于，來獲得在其中表達結合核酸分子的種子，獲得結構基因產(chǎn)生升高的種子，獲得結構基因產(chǎn)生升高的食物，獲得結構基因產(chǎn)生升高的原種和獲得結構基因產(chǎn)生升高的油。被用于這種方法中的植物可以被加工。植物或植物部分可以被與其他植物部分分開或分離。用于該目的的優(yōu)選植物部分是種子。一般認為，甚至在與其他植物部分分開或分離后，被分離或分開的植物部分可能被其他植物部分污染。在優(yōu)選方面，被分開的植物部分超過被分開的物質(zhì)的約50％(w/w)，更加優(yōu)選地，超過被分開的物質(zhì)的約75％(w/w)，和甚至更加優(yōu)選超過被分開的物質(zhì)的約90％(w/w)。通過這種方法生成的本發(fā)明的植物或植物部分可以用已知技術加工成產(chǎn)品。優(yōu)選的產(chǎn)品是食物、原種(feedstock)和油。飼料、食物、蛋白質(zhì)和油的制備物任何本發(fā)明的植物或其部分可以被加工來制備飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物。用于該目的的特別優(yōu)選的植物部分是種子。在優(yōu)選實施方案中，飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物是給反芻動物設計的。制備飼料、食物、蛋白質(zhì)或油制備物的方法在本領域是熟知的。參見，如美國專利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。在優(yōu)選實施方案中，蛋白質(zhì)制備物是高蛋白制備物。這種高蛋白制備物優(yōu)選具有超過約5％w/v的蛋白質(zhì)含量，更加優(yōu)選超過約10％w/v，和甚至更加優(yōu)選超過約15％w/v。在優(yōu)選的油制備物中，油制備物是高油含量的制備物，具有來自本發(fā)明的植物或其部分的油成分，超過約5％w/v，更加優(yōu)選超過約10％w/v，和甚至更加優(yōu)選超過約15％w/v。在一個優(yōu)選實施方案中，油制備物是液體，體積超過約1，約5，約10，或約50L。本發(fā)明提供從本發(fā)明的植物制備或通過本發(fā)明的方法生成的油。這種油可以是任何生成的產(chǎn)物的次要或主要成分。而且，這種油可以與其他油混合。在更加優(yōu)選的實施方案中，從本發(fā)明的植物制備或由本發(fā)明的方法生成的油在體積或重量上組成任何產(chǎn)物的油成分的約0.5％，約1％，約5％，約10％，約25％，約50％，約75％，或約90％以上。在另一個優(yōu)選實施方案中，油制備物被混合，在體積上占該混合物的約10％，約25％，約35％，約50％，或約75％以上。從本發(fā)明的植物中制備的油可以與一種或多種有機溶劑或石油餾出物混合。在另一個實施方案中，本發(fā)明的食物與其他食物混合。在優(yōu)選實施方案中，從本發(fā)明的植物中制備的或通過本發(fā)明方法生成的食物在體積或重量上占任何產(chǎn)物的食物成分的約0.5％，約1％，約5％，約10％，約25％，約50％，約75％，或約90％以上。在另一個實施方案中，食物制備物可以被混合，并且在體積上占該混合物的約約10％，約25％，約35％，約50％，或約75％以上。種子容器植物的種子被放置在容器中。如在此所用，容器是任何能夠裝載這種種子的物體。容器優(yōu)選含有超過約500，約1000，約5000，或約25000粒種子，其中至少約10％，約25％，約50％，約75％，或約100％的種子是來自本發(fā)明的植物。育種程序本發(fā)明的植物可以是育種程序的一部分或者來自育種程序。育種方法的選擇取決于植物繁殖模式、被改進的特性的遺傳性和商業(yè)上所用的栽培種的類型(如F1雜合栽培種、純系栽培種等)。被選擇的非限制性的用繁殖本發(fā)明的植物的方法被列舉在下文中。育種程序可以采用標記輔助性選擇任何雜交后代來加強。還應當理解，任何商業(yè)性的和非商業(yè)性的栽培種可以被用于育種程序。因素如，emergencevigor、營養(yǎng)勢(vegetativevigor)、應激耐受、抗病性、分枝、開花、結果、種子大小、種子密度、持久性和脫粒性等通常會決定該選擇。對于高度遺傳的特性，選擇在單個區(qū)域中被評價的優(yōu)良個體植物是有效的，而對于低遺傳力的特性，應當在從重復評價相關植物家族獲得的平均值的基礎上進行選擇。常用的選擇方法一般包括家譜選擇、改進的家譜選擇、群體選擇和輪回選擇。在優(yōu)選實施方案中，進行回交或輪回育種程序。遺傳的復雜性影響育種方法的選擇?；亟挥N可以被用于將一種或少數(shù)高度遺傳的特性優(yōu)良基因轉移給期望的栽培種。這種方法已經(jīng)被廣泛地用于繁育抗病的栽培種。各種輪回選擇技術被用于改進由大量基因控制的數(shù)量遺傳特性。輪回選擇在自花授粉的農(nóng)作物中的用途取決于授粉的難易程度、每次自花授粉的成功雜交的頻率和每次成功雜交的雜交后代的數(shù)量。繁育品系可以被檢測，在代表商業(yè)目標地區(qū)的環(huán)境下與合適的標準物比較兩代或多代。最好的品系是新的商業(yè)栽培中的候選；那些仍然缺乏特性的品系可以被用作親本來制備作為進一步選擇的新群體。一種確定較好的植物的方法是觀察其相對于其他試驗植物和相對于廣泛種植的標準栽培種的性能。如果一次觀察不是決定性的，重復觀察可以提供對其遺傳價值的較好評價。育種人員能夠選擇和雜交兩種或多種親本品系，接著通過重復自花授粉和選擇，產(chǎn)生許多新的遺傳組合。開發(fā)新的栽培種需要開發(fā)和選擇品種，雜交這些品種，和選擇較好的雜合雜交。雜合的種子可以通過手工雜交被選擇的雄性繁育親本或者通過采用雄性不育體系來制備。根據(jù)某些單基因特性來選擇雜種，如莢顏色、花的顏色、種子產(chǎn)量、軟毛(pubescene)顏色或除草劑抗性，該特性表明種子是真正雜種。關于親本品系的其他數(shù)據(jù)，以及雜種的表型，影響育種人員的決定是否繼續(xù)特定的雜合雜交。家譜育種和輪回選擇育種方法可以被用于從繁育群體中開發(fā)栽培種。育種程序將來自兩種或多種栽培種或各種廣泛來源的期望特性結合到育種庫(breedingpool)中，通過自花授粉和選擇期望表型從育種庫中開發(fā)栽培種。新的栽培種可以被評價來確定哪種具有商業(yè)潛能。家譜育種通常被用來改進自花授粉的農(nóng)作物。兩個具有期望、互補特性的親本進行雜交來制備F1。通過自花授粉一株或多株F1來制備F2群體。從最好的家族中選擇最佳個體。重復檢測家族可以在F4代開始進行來提高低遺傳力的特性的選擇效率。在近交的高級階段(即F6和F7)，最好的品系或表型相似品系被檢測作為新的栽培種的潛在釋放?；亟挥N已經(jīng)被用于將簡單遺傳、高遺傳特性的基因轉移到期望的純合栽培種或作為輪回親本的近交品系中。被轉移的特性的來源被稱為供體親本。生成的植物被期望具有輪回親本(如栽培種)的特征和從供體親本轉移來的期望特性。在開始雜交后，具有供體親本表型的個體被選擇和重復與輪回親本雜交(回交)。生成的親本被期望具有輪回親本(如栽培種)的特征和從供體親本轉移來的期望特性。在嚴格意義上，單一種子傳代程序是指種植一種分離群體，每棵植物收獲一粒種子樣本，并且使用該種子樣本來種植下一代。當該群體已經(jīng)從F2發(fā)展到期望水平的近交程度時，產(chǎn)生品系的植物各自追溯到不同的F2個體。由于一些種子未能夠發(fā)芽或者一些植物不能生產(chǎn)至少一粒種子，群體中植物的數(shù)量逐代減少。結果，當世代進展完成時，并非所有最初被取樣在群體中的F2植物都被后代表現(xiàn)。在多種子程序中，育種人員通常從群體的每棵植物中收獲一個或多個莢，并將它們在一起脫粒來形成批量。批量的一部分被用來種植下一代，一部分被保存。該程序已經(jīng)被稱作為改進的單一種子傳代或莢-批量技術。多種子程序已經(jīng)被用于在收獲時節(jié)約勞力。用機器脫粒莢顯著快于單一種子程序中通過手工從每個莢中取出種子。多種子程序還使得可能在每代近交中種植相同數(shù)量種子群體。對于通常用于不同特性和農(nóng)作物的其他育種方法的描述可以在一些參考書籍之一找到(如Fehr，PrinciplesofCultivarDevelopment，1，2-3(1987))。本發(fā)明的轉基因植物還可以采用孤雌生殖方法繁殖。孤雌生殖是植物中的繁殖的遺傳控制方法，其中胚乳不是通過卵子和精子的結合形成。有三種基本的孤雌生殖繁殖類型1)其中胚在從核來源的胚囊中由染色體不減數(shù)的卵子發(fā)育得到的孤雌生殖，2)其中胚在從大孢子母細胞來源的胚囊中由染色體不減數(shù)的卵子發(fā)育得到的二倍數(shù)孢子形成(diplospory)，和3)胚直接從體細胞發(fā)育得到的不定胚生殖。在大多數(shù)孤雌生殖形式中，假受精或極體核受精來生成胚乳對于種子發(fā)育能力是必需的。在無孢子生殖中，保育栽培種可以被用作種子中胚乳形成的花粉來源。由于栽培種的不減數(shù)卵子孤雌發(fā)育，保育栽培種不影響無孢子生殖的單性生殖的栽培種的遺傳學，而是可能生成胚乳。孤雌生殖在經(jīng)濟上是重要的，特別是在轉基因植物中，因為無論多大的雜合程度，其使任何的基因型進行純育。因此，通過孤雌生殖繁殖，雜合的轉基因植物能夠在整個重復的生活周期中保持其遺傳的忠實性。用于制備孤雌生殖的植物的方法在本領域是已知的。參見，美國專利5,811,636。實施例提供如下實施例，并且這些實施例無論如何不被解釋為限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1大豆lea9基因的啟動子(Hsing，etal.，PlantPhysiol.，1002121-2122(1992))通過對大豆基因組DNA(cv.Asgrow4922)進行PCR擴增獲得，利用基于公開序列設計的下述引物引物編號lea9-5′5′-ACCTGCGGCCGCCAAGTACTTACGCCACACCAACTTAC-3′(SEQIDNO5)；和引物編號lea9-3′5′-GCAGCTGTTTCCTTGATGGACTCTC-3′(SEQIDNO6).所有寡核苷酸引物均獲自于GibcoLifeTechnologies(GrandIsland，NY)。初步PCR反應利用TaqDNA聚合酶試劑盒(BoehringerMannheim，Germany)。嵌套式PCR反應在最初PCR反應之后進行，利用的引物是初步PCR反應的5′引物和lea9-3′nest′(GAAGATCTCCTGCAATTTCAAAGATCAATTATTTCC)(SEQIDNO7)。下面總述這些反應的成分初步PCR反應成分用量大豆基因組DNA(80ng/μl)1.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)1.0μl引物lea9-5′(10μM)1.0μl引物lea9-3′(10μM)1.0μl10XPCR緩沖液(含有MgCl2)5μl(最終濃度為1X)Taq聚合酶1.0μl蒸餾水補充到最終體積50μl嵌套式PCR反應成分用量初步PCR反應的等份1.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)1.0μl引物lea9-5′(10μM)1.0μl引物lea9-3′nest′(10μM)1.0μl10XPCR緩沖液(含有MgCl2)5μl(最終濃度為1X)Taq聚合酶1.0μl蒸餾水補充到最終體積50μl在加聚合酶之前，將反應混合液加熱到95℃。起始(initial)和嵌套式PCR反應均從樣品于94℃變性2分鐘開始。進而反應混合液于由94℃30秒、72℃2.5分鐘(-1℃/循環(huán))組成的循環(huán)進行7次。然后，將反應混合液于由94℃30秒、68℃2分鐘、72℃2分鐘(secondsminutes)組成的循環(huán)進行30次，最后72℃下保持10分鐘。再將反應液于4℃保持至下一步。嵌套式PCR反應的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并用QiagenGelExtractionKit(Qiagen，Valencia，California；產(chǎn)品編號Cat28704)純化。純化的PCR產(chǎn)物的分成等份后，用限制性內(nèi)切酶NotI和BglII(Promega，Madison，WI)進行消化，并連接到也用NotI和BglII進行切割而去除了e35S啟動盒的pMON8677載體(圖1)中。連接反應采用Boehringer-Mannheim(Germany，產(chǎn)品編號Cat#1635379)的RapidDNALigation試劑盒，并按廠商推薦的方法進行操作。獲得的構建體中，lea9啟動子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)報告基因的上游，稱為pMON49801(圖2)，用于瞬時檢驗分析。連接反應液的等分用于轉化合適的E.coli(DH5α)，將細胞涂布到選擇培養(yǎng)基上，所用的選擇培養(yǎng)基為含100μg/ml氨芐青霉素的LuriaBroth培養(yǎng)基((LB)(10％細菌用胰蛋白胨(Bactotryptone)、5％酵母抽提物和10％NaCl)。選擇的細菌轉化體，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進而用QiaprepSpinMicroprepKit(QiagenCorp.，Valencia，California)分離其質(zhì)粒DNA。對根據(jù)限制性酶分析而含有預期插入大小純質(zhì)粒進行測序。實施例2擬南芥(Arabidopsisthaliana)的perl基因的啟動子(Haslekas，etal.，PlantMolBiol.36833-845(1998))通過對Arabidopsis(cv.Columbia)基因組DNA進行PCR擴增，利用基于公開序列設計的下述引物引物編號JA445′-GGATCCAAATCAAAGTTTAATAGACTT-3′(SEQIDNO8)；和引物編號JA465′-TCTAGGTTCGGCACCGTGTCTC-3′(SEQIDNO9).所有寡核苷酸引物均由GibcoLifeTechnologies(GrandIsland，NY)提供。初步PCR反應用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim，(Germany)，產(chǎn)品編號1732641)進行。在初步PCR反應之后，取初步反應產(chǎn)物1μl用嵌套式PCR引物進行第二輪反應，利用基于公開的序列的下述引物引物編號JA455′-TAGCGGCCGCTAATAGACTTTGCACCTCCAT-3′(SEQIDNO10)；及引物編號JA475′-AACCATGGTTTACCTTTTATATTTATATATAGAA-3′(SEQIDNO11)。PCR反應成分和條件總述如下初步PCR反應成分用量擬南芥(Arabidopsis)基因組DNA0.5μl(0.75μg)dNTP混合物(每一種dNTP為10mM)2.0μl引物JA44(10μM)3.0μl引物JA46(10μM)3.0μl10XPCR緩沖液(含有MgCl2)10μl(最終濃度為1X)聚合酶0.75μl蒸餾水補充到最終體積100μl嵌套式PCR反應成分用量初步PCR反應的等份1.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)2.0μl引物JA45(10μM)3.0μl引物JA47(10μM)3.0μl10XPCR緩沖液(含有MgCl2)10μl(最終濃度為1X)聚合酶0.75μl蒸餾水補充到最終體積100μl在加聚合酶之前，將反應混合液加熱到95℃。初步和嵌套式PCR反應均從樣品于94℃變性2分鐘開始。反應混合液于由94℃15秒、60℃30秒和72℃90秒組成的循環(huán)進行10次。然后，將反應混合液于94℃15秒、60℃30秒、72℃30秒作為初始循環(huán)，而以后循環(huán)中的72℃50秒，共進行26個循環(huán)，每個額外循環(huán)50秒，最后72℃下保持7分鐘。再將反應液于4℃保持至下一步使用。PCR產(chǎn)物的等份25μl用于瓊脂糖凝膠電泳分析。剩余的PCR產(chǎn)物用QiagenPCRPurificationKit(Qiagen，INC.，Valencia，California，產(chǎn)品編號28104)按廠家推薦方法進行純化。純化的PCR產(chǎn)物分成等份后，用限制性內(nèi)切酶NotI和NcoI(Promega，Madison，WI)進行消化，并連接到也用NotI和NcoI進行切割而去除了e35S啟動盒的pMON8677載體(圖1)中。連接反應采用Boehringer-Mannheim(Germany，產(chǎn)品編號Cat#1635379)的RapidDNALigation試劑盒，并按廠商推薦的方法進行操作。獲得的構建體中，AtPerl啟動子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)報告基因的上游，稱為pMON42316(圖3)。連接反應液的等份用于轉化合適的E.coli(DH5α)，將細胞涂布到選擇培養(yǎng)基(含100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基)。選擇轉化的細菌，于液體培養(yǎng)基(含100μg/ml羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中生長，進而用QiaprepSpinMicroprepKit(QiagenCorp.，Valencia，California)分離其質(zhì)粒DNA。用限制性酶分析質(zhì)粒是否含有預期大小的插入片段，純化含有預期插入片段的質(zhì)粒，并用引物JA45、JA47和稱為GUS5′-2的引物進行測序，其中GUS5′-2的序列為5′-GTAACGCGCTTTCCCACCAACGCT(SEQIDNO12)，可與質(zhì)粒的GUS編碼區(qū)退火?？寺〉腁tPerl啟動子序列與公開的啟動子序列匹配。實施例3大豆Sle2基因的啟動子(Calvo，etal.，Theor.Appl.Genet.，94957-967(1997))通過對大豆基因組DNA(cv.Williams82，購自Stratagene，LaJolla，California；產(chǎn)品編號946103)進行PCR擴增獲得，基于公開序列，設計下述引物用于初步PCR反應引物編號JA415′-GTGTTACATTATCACTTATCCTGGTC-3′(SEQIDNO13)；和引物編號Jeahre25′-GCTCAATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′(SEQIDNO14).寡核苷酸引物由GibcoLifeTechnologies(GrandIsland，NY)提供。初步PCR反應用ExpandLongTemplatePCR系統(tǒng)(BoehringerMannheim，Germany，產(chǎn)品編號1681834)進行。在初步PCR反應之后，取初步反應的1μl產(chǎn)物作為模板進行嵌套式PCR反應，嵌套式PCR引物基于公開的序列進行設計引物編號JA435′-CTCTTGAGCACGTTCTTCTCCT-3′(SEQIDNO15)；和引物編號Jeahre25′-GCTCAATTAACCCTCACTAAAGGGA-3′(SEQIDNO16)。兩種PCR反應的成分和條件總述如下初步PCR反應成分用量大豆基因組DNA1.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)2.5μl引物JA41(10μM)1.0μl引物Jeahre2(10μM)1.0μl10XPCR緩沖液#3(含有MgCl2)5μl(最終濃度為1X)聚合酶混合物0.75μl蒸餾水補充到最終體積50μl嵌套式PCR反應成分用量初步PCR反應的等份1.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)2.5μl引物JA43(10μM)1.0μl引物Jeahre2(10μM)1.0μl10XPCR緩沖液#3(含有MgCl2)5μl(最終濃度為1X)聚合酶混合物0.75μl蒸餾水補充到最終體積50μl初步和嵌套式PCR反應均從樣品于94℃變性2分鐘開始。接著反應混合液于由94℃10秒、69℃30秒(-1.5℃/循環(huán))組成的循環(huán)進行10次和68℃12分鐘。然后，將反應混合液于由94℃10秒、58℃30秒和68℃12分鐘組成的循環(huán)進行25次，最后于68℃下保持7分鐘。再將反應液于4℃保持。在成功克隆和鑒定Sle2啟動子區(qū)后，再用ExpandHighFidelityPCRSystem(BoehringerMannheim，Germany，產(chǎn)品編號1732641)再次擴增，利用下述引物引物編號JA535′-GTGCGGCCGCACTCAAAGTTTATTGAGTTTACTTAGAG-3′(SEQIDNO17)；和引物編號JA545′-ACAGATCTGTTTCTCACACTTGCAAAATTCTCTC-3′(SEQIDNO18)。該第三次反應是為了在克隆的5′和3′末端分別增加NotI和BglII限制性位點。反應之后，HighFidelityPCR產(chǎn)物的等份25μl用于瓊脂糖凝膠電泳分析。凝膠中的條帶與預期大小(～1.3kb)相符，因而用QiagenGelExtractionKit(Qiagen，Valencia，California；產(chǎn)品編號28704)按所符詳細方法進行純化。純化的PCR產(chǎn)物的等份，用限制性內(nèi)切酶NotI和BglII(Promega，Madison，WI)進行消化，并連接到也用NotI和BglII進行切割而去除了e35S啟動盒的pMON8677載體(圖1)中。連接反應采用Boehringer-Mannheim(Germany，產(chǎn)品編號1635379)的RapidDNALigation試劑盒，并按廠商推薦的方法進行操作。獲得的構建體中，Sle2啟動子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)報告基因的上游，稱為pMON42320(圖4)。細菌的轉化按實施例1中描述的方法進行?；谙拗泼该盖蟹治鲎C實質(zhì)粒含有預期大小的插入片段，純化質(zhì)粒，并用引物JA51、JA53、JA54、JA55和GUS5′-2引物進行測序，其中JA515′-ATAGTACCCCAACACGCTAC-3′(SEQIDNO19)；JA535′-GTGCGGCCGCACTCAAAGTTTATTGAGTTTACTTAGAG-3′(SEQIDNO20)；JA54(SEQIDNO18)；JA555′-GGAACCGAATATAATTGGCTC-3′(SEQIDNO21)；和GUS5′-2引物(SEQIDNO12)，可與質(zhì)粒的GUS編碼區(qū)退火。實施例4大豆凝集素啟動子通過對大豆基因組DNA(cv.3237)進行PCR擴增獲得。PCR反應采用ExpandHighFidelityPCRSystem(BoehringerMannheim，Germany，產(chǎn)品編號Cat#1732641)，并基于公開序列(Vodkinet.al.，Cell，341023-1231(1983))，設計下述引物用于初步PCR反應引物編號JA235′-GCCTTCCTGGTCAGTAGCACCAGTA-3′[SEQIDNO22]；和引物編號JA255′-CCATGCCATCGTATCGTGTCACAAT-3′[SEQIDNO23]。寡核苷酸引物均由GibcoLifeTechnologies(GrandIsland，NY)提供。在初步PCR反應之后，取初步反應產(chǎn)物1μl進行嵌套式PCR反應，所用引物如下引物編號JA265′-AGGCGGCCGCCTGCAGATGGAATACAGCAATGAACAAATGC-3′(SEQIDNO24)；和引物編號JA285′-CTCCATGGAGATCTTGCTTTGCTTCAGCTAAATTGCACT-3′(SEQIDNO25)。該反應是為了在克隆的啟動子5′和3′末端分別增加NotI和NcoI限制性酶克隆位點。初步PCR反應的成分和條件總述如下初步PCR反應成分用量大豆基因組DNA2.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)1.0μl引物JA23(10μM)1.5μl引物JA25(10μM)1.5μl10XPCR緩沖液#3(含有MgCl2)5μl(最終濃度為1X)聚合酶混合物0.75μl蒸餾水補充到最終體積50μl初步PCR反應的開始步驟是將樣品加熱到94℃保持2分鐘。接著反應混合液于由94℃15秒、52℃30秒和72℃1分鐘組成的循環(huán)進行10次。然后，將反應混合液于由52℃30秒和72℃1分鐘組成的循環(huán)，進行20循環(huán)，并且每一循環(huán)后時間增加20秒，然后于72℃下保持7分鐘為最后延伸，最后于4℃保持用于下面的培養(yǎng)。嵌套式PCR反應的成分和條件總述如下嵌套式PCR反應成分用量初步PCR產(chǎn)物1.0μldNTP混合物(每一種dNTP為10mM)1.0μl引物JA26(10μM)1.5μl引物JA28(10μM)1.5μl10XPCR緩沖液#3(含有MgCl2)5μl(最終濃度為1X)聚合酶混合物0.75μl蒸餾水補充到最終體積50μl嵌套式PCR反應的開始步驟是將樣品加熱到94℃變性2分鐘。反應混合液于由94℃15秒、46℃30秒和72℃1分鐘組成的循環(huán)進行10次。然后，將反應混合液于由94℃15秒和72℃1分鐘組成的循環(huán)，進行20循環(huán)，并且每一循環(huán)后時間增加20秒，然后于72℃下保持7分鐘為最終延伸，最后于4℃保持直到下一個操作步驟延伸培養(yǎng)。嵌套式PCR之后，HighFidelityPCR反應的整個產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分析。切出0.96Kb條帶并用QiagenGelExtractionKit(Qiagen，Valencia，California；產(chǎn)品編號28704)進行純化。純化PCR產(chǎn)物的等份用限制性內(nèi)切酶NotI和NcoI(Promega，Madison，WI)進行消化并連接到也用NotI和NcoI切割以去除e35S啟動子盒(NBP#6301633)的pMON8677載體(圖1)上。連接反應用RapidDNALigationKit(Boehringer-Mannheim，Germany，產(chǎn)品編號1635379)按廠家推薦方法進行。獲得的構建體中，凝集素啟動子直接位于uidA(β-葡糖苷酸酶)報告基因的上游，稱為pMON42302(圖5)。連接反應液的等份用于轉化合適的E.coli(DH5α)，將細胞涂布到選擇培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)。選擇轉化的細菌，于液體培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基)中生長，進而用QiaprepSpinMicroprepKit(QiagenCorp.，Valencia，California)分離其質(zhì)粒DNA。用限制性酶分析質(zhì)粒是否含有預期大小的插入片段，純化含有預期插入片段的質(zhì)粒，并用引物JA26、JA28和GUS5′-2引物進行測序，其中GUS5′-2可與質(zhì)粒的GUS編碼區(qū)退火?？寺〉哪貑幼有蛄信cVodkin，etal.，(1983)公開的啟動子序列匹配。實施例5該實施例描述由sle2和凝集素啟動子控制的異源基因轉化大豆植株。載體構建通過標準分子克隆方法(Sambrooketal.，MolecularCloning-Alaboratorymanual，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Maligaetal.，MethodsinPlantMolecularBiology-Alaboratorycoursemanual，1995，ColdSpringHarborLaboratoryPress)構建了兩個根癌農(nóng)桿菌載體。在兩個載體即pMON66893(圖10)和pMON66894(圖11)中均包括了由FMVElflα啟動子、CTP2和CP4編碼基因和E93′UTR組成的表達盒用于選擇標記。第三個載體pMON63682(圖13)利用的是由FMV啟動子、CTP2和CP4編碼基因及E93′UTR組成的表達盒作為選擇標記。在pMON66893(圖10)中，凝集素啟動子連接于由葉綠體轉運肽CTP1和農(nóng)桿菌鄰氨基苯甲酸合成酶(AgroAS)構成的基因的上游。用NOS3′UTR作為轉錄終止信號和聚腺苷酸化信號。載體pMON66894(圖11)的構建類似于pMON66893，只是所用的啟動子為sle2啟動子而非凝集素啟動子。載體pMON63682(圖13)的構建也類似于pMON66893，使用Lea9啟動子而不是凝集素啟動子。根癌農(nóng)桿菌介導的大豆轉化上述載體通過三親交配法轉移到根癌農(nóng)桿菌菌株ABI中(Dittaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，777347-7351(1980))。并按已知方法制備用于轉化的細菌細胞。從商業(yè)途徑獲得的大豆種子(AsgrowA3244)萌發(fā)10-12小時。切取分生組織作為外植體，置于創(chuàng)傷管中，通過超聲波進行創(chuàng)傷處理。創(chuàng)傷之后，加入上述的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，將外植體孵育大約1小時。之后，用吸管去除農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，將外植體共培養(yǎng)2-4天。然后將外植體轉移到選擇培養(yǎng)基即WoodyPlantMedium(McCown和Lloyd，Proc.InternationalPlantPropagaionSoc.，30421，(1981))，另加入75μM草甘膦和抗生素以抑制農(nóng)桿菌的過度生長)，培養(yǎng)5-7周以使轉基因苗得以選擇和生長。在接種后大約5-7周，收集表型為陽性的苗，將其置于根選擇培養(yǎng)基即含25μM草甘膦的BeanRootingMedia(BRM)(Martinell，etal.；美國專利5914451)，培養(yǎng)2-3周。將產(chǎn)生根的苗轉移到溫室中盆栽于土壤中。在選擇培養(yǎng)基上仍然健康，但沒有產(chǎn)生根的苗轉移到非選擇根培養(yǎng)基(即不含草甘膦的BRM)，再培養(yǎng)兩周。那些來自產(chǎn)根的任何苗的根進行篩選，在轉移到溫室盆栽之前，檢測植物選擇標記的表達。植株于標準溫室條件下生長直到收獲R1代種子。游離氨基酸分析利用下述程序分析每一轉基因事件中的游離氨基酸水平。將來自每次轉基因事件的種子單獨壓碎成細粉，并將大約50mg細粉轉移到預稱重的離心管中。記錄樣品的精確重量，在每一樣品管中加入1.0ml5％三氯乙酸。于室溫下旋渦混合后，于Eppendorf離心機(Model5415C，BrinkmannInstrument，Westbury，NY)以14,000rpm離心15分鐘。取出(remove)上清液的等份并用HPLC(Agilent1100)進行分析，其程序按AgilentTechnicalPublication″AminoAcidAnalysisUsingtheZorbaxEclipse-AAAColumnsandtheAgilent1100HPLC，″March17，2000中所述的進行。結果表明具有由lea9、凝集素和sle2啟動子控制的AgroAS基因的轉化大豆中，在它們的種子中有更高水平的游離色氨酸。實施例6該實施例描述了在轉化大豆植株中由lea9和perl啟動子控制的表達分析，以檢驗在轉基因大豆植株中l(wèi)ea9和perl啟動子控制異源基因表達導致在種子中的氨基酸含量提高的效率。載體構建通過標準分子克隆方法(Sambrooketal.，MolecularCloning-Alaboratorymanual，1989，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Maligaetal.，MethodsinPlantMolecularBiology-Alaboratorycoursemanual，1995，ColdSpringHarborLaboratoryPress)構建4個根癌農(nóng)桿菌載體。在所有4個載體中均包含由FMV啟動子(包括HSP70前導序列)、CTP2和CP4編碼基因和E93′UTR組成的表達盒作為選擇標記。在載體pMON69650(圖6)中，lea9啟動子連接于C28玉米的鄰氨基苯甲酸合成酶(AndersonetAL.；美國專利6,118,047)的對色氨酸不敏感α-亞基的上游。用NOS3′UTR作為轉錄終止信號和聚腺苷酸化信號。載體pMON696514(圖7)的構建類似于pMON69650，只是所用的啟動子為per1啟動子而非凝集素啟動子，控制相同的C28玉米鄰氨基苯甲酸合成酶的對色氨酸不敏感的α-亞基。載體pMON63662包括(圖12)的遺傳元件與pMON69651相同，但有兩套邊界序列將目標基因與選擇標記分開，以使標記與鄰氨基苯甲酸合成酶基因能夠獨立分離。載體pMON64210(圖8)和pMON64213(圖9)設計用于揭示對多個途徑同時去調(diào)節(jié)(deregulation)的效果。pMON64210和pMON64213兩者均包含由7Sα′啟動子控制的C28玉米鄰氨基苯甲酸合成酶的對色氨酸不敏感的α-亞基和NOS3′UTR。此外，pMON64210還包含由lea9啟動子控制擬南芥(Arabidopsis)SSUCTP和Ile-不敏感蘇氨酸脫氨酶的融合蛋白(Gruysetal；美國專利5,942,660)和Arc53′UTR。載體pMON64213的構建與pMON64210相似，只不過用per1啟動子取代lea9，調(diào)控相同的C28玉米鄰氨基苯甲酸合成酶的對色氨酸不敏感的α-亞基。根癌農(nóng)桿菌介導的大豆轉化上述載體通過三親交配法轉移到根癌農(nóng)桿菌菌株ABI中(Dittaetal.，Proc.Natl.ACAD.SCI.，777347-7351(1980))。并按已知方法制備用于轉化的細菌細胞。從商業(yè)途徑獲得的大豆種子(AsgrowA3244)萌發(fā)10-12小時。切取分生組織作為外植體，置于創(chuàng)傷管中，通過超聲波進行創(chuàng)傷處理。創(chuàng)傷之后，加入上述的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，將外植體孵育大約1小時。之后，用吸管去除農(nóng)桿菌培養(yǎng)物，將外植體共培養(yǎng)2-4天。然后將外植體轉移到選擇培養(yǎng)基即由WoodyPlantMedium組成(McCown和Lloyd，Proc.InternationalPlantPropagationSoc.，30421，(1981))，另加入75μM草甘膦和抗生素以抑制農(nóng)桿菌的生長)，培養(yǎng)5-7周以使轉基因苗得以選擇和生長。在接種后大約5-7周，收集表型為陽性的苗，將基置于根選擇培養(yǎng)基即含25μM草甘膦的BeanRootingMedia(BRM)(Martinell，etal.；美國專利5914451)，培養(yǎng)2-3周。將產(chǎn)生根的苗轉移到溫室中盆栽于土壤中。在選擇培養(yǎng)基上仍然健康，但沒有產(chǎn)生根的芽轉移到非選擇性根培養(yǎng)基(即不含草甘膦的BRM)，再培養(yǎng)兩周。對那些來自經(jīng)過篩選產(chǎn)根的苗的根，在轉移到溫室盆栽之前，檢測植物選擇標記的表達。植株于標準溫室條件下生長直到收獲R1代種子。游離氨基酸分析利用下述程序分析每一轉基因事件中的游離氨基酸水平。將來自每次轉基因事件的種子單獨壓碎成細粉，并將大約50mg細粉轉移到預稱重的離心管中。記錄樣品的精確重量，在每一樣品管中加入1.0ml5％三氯乙酸。于室溫下旋渦混合后，于Eppendorf離心機(Model5415C，BrinkmannInstrument，Westbury，NY)以14,000rpm離心15分鐘。取出上清液的等份并用HPLC(Agilent1100)進行分析，其程序按AgilentTechnicalPublication″AminoAcidAnalysisUsingtheZorbaxEclipse-AAAColumnsandtheAgilent1100HPLC，″March17，2000中所述的進行。上述分析的數(shù)據(jù)列如下面的表中。因為來自每一事件的R1種子代表了一個分離種子群，對每一事件，取10個被分析種子，選擇具有最高色氨酸含量的種子作為同源基因型的代表。從Asgrow3244中隨機選擇10個非轉基因種子也進行同樣的分析。具有最高色氨酸水平的種子作為陰性對照。數(shù)據(jù)表明，由lea9和perl啟動子控制Asα基因的表達(分別是pMON69650和pMON69651)時，色氨酸含量增加。具有由lea9和perl啟動子控制TD基因的(分別是pMON64210和pMON64213)的轉化植株中，色氨酸和異亮氨酸的含量增加。使用pMON69650的轉基因大豆種子中的色氨酸的積累量使用pMON69651的轉基因大豆種子中的色氨酸的積累量用pMON64210的轉基因大豆種子中的色氨酸和異亮氨酸的積累量用pMON64213的轉基因大豆種子中的色氨酸和異亮氨酸的積累量攜帶來自pMON63662的Perl-玉米AS的三個無標記事件(markfreeevent)的色氨酸含量構建體事件品系號平均/事件MaxTrppMON63662GM-A295742810761723pMON63662GM-A295784421293837pMON63662GM-A296727611881549攜帶來自pMON63682的Lea9-wt-AgroAS的三個無標記事件(兩個陽性和一個null)的色氨酸含量構建體譜系事件Avg(TRP＞450)MaxTrppMON63682GM-A30383@.0030.GM-A3038316782,018pMON63682GM-A30383@.0043.GM-A3038320642,820pMON63682GM-A30383@.0084.GM-A30383046參考文獻Ainleyetal.，PlantMol.Biol.，14949，1990.Ausubeletal.，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Inc.，1995.BartleyandScolnik，PlantPhysiol.，1041469-1470，1994.Backetal.，PlantMol.Biol.，179，1991.Baueretal.，Gene，3773，1985.BeckerandGuarente，InAbelsonandSimon(eds.)，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology，MethodsEnzymol.，194182-187，AcademicPress，Inc.，NY.BennettandLaSure(eds.)，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，California，1991.Bergeronetal.，TIBS，19124-128，1994.Bustosetal.，EMBOJ.，101469-1479，1991.Castresanaetal.，EMBOJ.，71929-1936，1988.Capecchi，Cell，22(2)479-488，1980.Cerda-Olmedoetal.，J.Mol.Biol.，33705-719，1968.Chauetal.，Science，244174-181.1989.Christensenetal.，PlantMol.Biol.，18675-689，1992.Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993.Costaetal.，MethodsMol.Biol.，5731-44，1996.Craik，BioTechniques，312-19，1985.Craig，Science，2601902-1903，1993.Curieletal.，Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992.Cyanobase，http://www.kazusa.or.jp/cyanobase.Dellaportaetal.，StadlerSymposium，11263-282，1988.Demolderetal.，J.Biotechnology，32179-189，1994.DengandNickloff，Anal.Biochem.，20081，1992.D′Halluinetal.，Bio/Technology，10309-314，1992.Doyleetal.，J.Biol.Chem.，2619228-9238，1986.EglitisandAnderson，Biotechniques，6(7)608-614，1988.EnderlinandOgrydziak，Yeast，1067-79，1994.Feinbaumetal.，Mol.Gen.Genet.，226449-456，1991.Fraleyetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，804803，1983.FritsEcksteinetal.，NucleicAcidsResearch，106487-6497，1982.Frommetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，82(17)5824-5828，1985.Frommetal.，Bio/Technology，8833，1990.Fulleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，861434-1438，1989.Fynanetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，90(24)11478-11482，1993.GethingandSambrook，Nature，35533-45，1992.Glicketal.，MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology，CRCPress，BocaRaton，F(xiàn)L，1993.GrahamandVanderEb，Virology，54(2)536-539，1973.Greeneretal.，Mol.Biotechnol.，7189-195，1997.Hartletal.，TIBS，1920-25，1994.HersheyandStoner，PlantMol.Biol.，17679-690，1991.Hess，InternRev.Cytol.，107367，1987.Hincheeetal.，Bio/Technology，6915-922，1988.Hinnenetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，751920，1978.Horschetal.，Science，2271229-1231，1985.Ikatuetal.，Bio/Technol.，8241-242，1990.JaraiandBuxton，CurrentGenetics，262238-2244，1994.Jefferson(I)，PlantMol.Biol，Rep.，5387-405，1987.Jefferson(II)etal.，EMBOJ.，63901-3907，1987.JohnstonandTang，MethodsCellBiol.，43(A)353-365，1994.Jonesetal.，Science，266789-793，1994.Jonesetal.，Mol.Gen.Genet.，1987.Juliusetal.，Cell，32839-852，1983.Juliusetal.，Cell，371075-1089，1984.Karesetal.，PlantMol.Biol.，15905，1990.Katzetal.，J.Gen.Microbiol.，1292703-2714，1983.Keegstra，Cell，56(2)247-253，1989.Kelleretal.，EMBOL.，81309-1314，1989.Knutzonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)，892624-2628，1992.Kridletal.，SeedSci.Res.，1209，1991.Kudlaetal.，EMBO，91355-1364，1990.Kuhlemeieretal.，Seeds，1471，1989.Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，82488-492，1985.KyteandDoolittle，J.Mol.Biol.，157105-132，1982.LamandChua，J.Biol.Chem.，26617131-17135，1990.LamandChua，Science，248471，1991.LipmanandPearson，Science，2271435-1441，1985.Lindstrometal.，DevelopmentalGenetics，11160，1990.Loisetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，95(5)2105-2110，1998.Luetal.J.Exp.Med.，178(6)2089-2096，1993.Luoetal.，PlantMolBiol.Reporter，6165，1988.MacKenzieetal.，JournalofGen.Microbiol.，1392295-2307，1993.Malardieretal.，Gene，78147-156，1989.Mandeletal.，PlantMol.Biol.，29995-1004，1995.McElroyetal.，Seeds，2163-171，1990.Nawrathetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，9112760-12764，1994.NeedlemanandWunsch，JournalofMolecularBiology，48443-453，1970.Neuhausetal.，TheorAppl.Genet.，7530，1987.Odelletal.，Nature，313810，1985.Osunaetal.，CriticalReviewsInMicrobiology，20107-116，1994.Ou-Leeetal.，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A.)，836815，1986.Owetal.，Science，234856-859，1986.PearsonandLipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，852444-2448，1988.Pearson，″RapidandSensitiveSequenceComparisonwithFASTPandFASTA.″InMethodsinEnzymology，(R.Doolittle，ed.)，18363-98，AcademicPress，SanDiego，California，1990.Pearson，ProteinScience，41145-1160，1995.Penaetal.，Nature，325274，1987.Poszkows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gaattttgcaagtgtgagaaac1312<210>2<211>885<212>DNA<213>大豆(Glycinemax)<400>2caagtacttacgccacaccaacttacaacaatgtcatacataaatcatagtgtgacatta60ttgcgatttttgtactgaaaaacaatatttttaaaatatatgtacgaaggcaaagagcta120aactttgttgttctatctctatttcaaattcttcctttccatctctcttttttcttttca180attcacccttcacattctctttcaattgaggaatggttcaacactacgtgcgataggcta240aatgtcacttccactttaatataaataaaggatcatatttttgtatcaattgataaagaa300agtttttttttttcttcatgtttttatctgcctctaactactagtaagtggtattaatta360gagcttaagttgcatagaattaaagagaaacatttgagagttgagagatgattagcaata420attttaatcaataatcaataacttttagtatatttcgcatttgatttaactttttattat480cctttttcaaattattctttcaaaatgatatcattttaaatattaatacaaatcttaaca540tcatatggaagggataacggagagacaatttggaagggataagagaagtcaatttcatcc600ccaattagattaatcgaccgtttatgtaagcccctattgcacgagtggttgattgccacg660tgtccctaacactgtgttgaagctcgttgcaaacagacacgcggcaattacgtgtaagac720gattagtccaataatcctcagaaacttgccacgcgtactgcactgacacgtgtgcaaaag780atagcgccgcacctaaatctatttatttggtagcatgcggtgtgctgttgaaagaagaaa840gaacctaagtgagaaacaaagaaaggaaataattgatctttgaaa885<210>3<211>1006<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsisthaliana)<400>3taatagactttgcacctccatctatatagtatatcacaggacaataaacacaatgatcag60tgattatacaacatcaaagaaaacttgtaattctgggaatataactgagaaatgagaatt120aaagattcataatttgaacacaagaaatcctaaactggtacgaaagaaaaattgctcaac180aaaaaaatcaagctaattactcgtatacaaagacacgaagaactaatacaagaaacaaga240aacaacaaaccacaaagagattgaaccaatccaaattcgacaacataaaccaagtgtgtg300ggtgattggaatcagaggacgtaccaaagaaaagcgtccgtgatcaacaaaaaccaaaaa360gagacgtttgaaataaaccagaggaagacgaagaataattaagcaaagagaagcgttaag420cgggagcgagaaaggaaacgagagaaagagagagcttccagatccgacagaagttttcgg480cttcttctttttcgtttaagaacttctgatcctcctaggtctgtccgaagaactaatctt540tttgaggtaacgacgccgtttttctcaaaacatgggcccattaaccatagtctcggccca600aacgaaacttaatacgacaatgtttgggtgtaaacgcaaagattttgtcgattatcacaa660gtaaaaaaataaatacaaacacttgagtctctctagacatcgtgcgtcgccttagcttta720agttttttctcgaaacaaaagagttattttatttgaactttgaagattatacgaagacac780gtggcgtgaacccaattcataacaacgccacgctatactcttttgcatgcacctcaattt840gaacatcatcaagtctctctctctctttttctgactttgatccacgaacctaaccagctt900gcgatctctatttaatcggtcctcgacgcaacttcaacttctactacatccattcacatc960aaatcaatacagaaagttttttctatatataaatataaaaggtaaa1006<210>4<211>945<212>DNA<213>大豆(Glycinemax)<400>4atggaatacagcaatgaacaaatgctatcctcttgagaaaagtgaatgcagcagcagcag60cagactagagtgctacaaatgcttatcctcttgagaaaagtgaatgcagcggcagcagac120ctgagtgctatatacaattagacacagggtctattaattgaaattgtcttattattaaat180atttcgttttatattaattttttaaattttaattaaatttatatatattatatttaagac240agatatatttatttgtgattataaatgtgtcactttttcttttagtccatgtattcttct300attttttcaatttaactttttatttttatttttaagtcactcctgatcaagaaaacattg360ttgacataaaactattaacataaaattatgttaacatgtgataacatcatattttactaa420tataacgtcgcattttaacgtttttttaacaaatatcgactgtaagagtaaaaatgaaat480gtttgaaaaggttaattgcatactaactattttttttcctataagtaatcttttttggga540tcaattatatatcattgagatacgatattaaatatgggtaccttttcacaaaacctaacc600cttgttagtcaaaccacacataagagaggatggatttaaaccagtcagcaccgtaagtat660atagtgaagaaggctgataacacactctattattgttagtacgtacgtatttcctttttt720gtttagtttttgaatttaattaattaaaatatatatgctaacaacattaaattttaaatt780tacgtctaattatatattgtgatgtataataaattgtcaacctttaaaaattataaaaga840aatattaattttgataaacaacttttgaaaagtacccaataatgctagtataaatagggg900catgactccccatgcatcacagtgcaatttagctgaagcaaagca945<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>5acctgcggccgccaagtacttacgccacaccaacttac38<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>6gcagctgtttccttgatggactctc25<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>7gaagatctcctgcaatttcaaagatcaattatttcc36<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>8ggatccaaatcaaagtttaatagactt27<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>9tctaggttcggcaccgtgtctc22<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>10tagcggccgctaatagactttgcacctccat31<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>11aaccatggtttaccttttatatttatatatagaa34<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>12gtaacgcgctttcccaccaacgct24<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>13gtgttacattatcacttatcctggtc26<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>14gctcaattaaccctcactaaaggga25<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>15ctcttgagcacgttcttctcct22<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>16gctcaattaaccctcactaaaggga25<210>17<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>17gtgcggccgcactcaaagtttattgagtttacttagag38<210>18<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>18acagatctgtttctcacacttgcaaaattctctc34<210>19<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>19atagtaccccaacacgctac20<210>20<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>20gtgcggccgcactcaaagtttattgagtttacttagag38<210>21<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>21ggaaccgaatataattggctc21<210>22<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>22gccttcctggtcagtagcaccagta25<210>23<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>23ccatgccatcgtatcgtgtcacaat25<210>24<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>24aggcggccgcctgcagatggaatacagcaatgaacaaatgc41<210>25<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成引物<400>25ctccatggagatcttgctttgcttcagctaaattgcact39權利要求1.一種分離的核酸分子，其包含SEQIDNO1所示序列或其互補體。2.一種核酸構建體，其包含與第二核酸可操作性連接的啟動子，其中所述啟動子選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補體。3.一種植物，其包含權利要求2的核酸構建體。4.根據(jù)權利要求3的植物，其中所述第二核酸是結構性核酸。5.根據(jù)權利要求4的植物，其中所述結構性核酸編碼選自下述的蛋白質(zhì)種子貯藏蛋白質(zhì)、脂肪酸途徑酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、類固醇途徑酶或淀粉分支酶。6.根據(jù)權利要求4的植物，其中所述結構性核酸編碼選自下述的蛋白質(zhì)鄰氨基苯甲酸合成酶、色氨酸脫羧酶、蘇氨酸脫氨酶、或天冬氨酸激酶。7.根據(jù)權利要求4的植物，其中所述結構性核酸編碼淀粉分支酶。8.根據(jù)權利要求4的植物，其中所述結構性核酸被定向以表達反義RNA分子。9.根據(jù)權利要求3的植物，其中所述植物選自canola、海甘藍、芥菜、蓖麻子、芝麻、棉籽、亞麻子、玉米、大豆、Arabidopsisphaseolus、花生、紫花苜蓿、小麥、稻、燕麥、高梁、油菜籽、黑麥、tritordeum、粟類、酥油草、多年生黑麥草、甘蔗、酸果、番木瓜、香蕉、紅花、油棕櫚(oilpalms)、亞麻、香瓜、蘋果、黃瓜、石斛、唐菖蒲、菊花、liliacea、棉花、桉樹、向日葵、蕓苔、歐洲油菜、草坪草、甜菜、咖啡或薯蕷屬。10.根據(jù)權利要求3的植物，其中所述植物是大豆。11.根據(jù)權利要求4的植物，其中所述結構性核酸被器官特異性地表達。12.根據(jù)權利要求11的植物，其中所述結構性核酸在種子中表達。13.一種產(chǎn)生轉化植物的方法，包括(a)提供權利要求2的核酸構建體，其中所述第二核酸是結構性核酸；和(b)用所述核酸構建體轉化植物。14.根據(jù)權利要求13的方法，其中所述植物產(chǎn)生種子和所述結構性核酸在所述種子中轉錄。15.一種包含權利要求12的植物的食物。16.一種包含如權利要求12的植物的原種(feedstock)。17.來自于權利要求12的植物的油。18.包含權利要求2的核酸構建體的細胞。19.根據(jù)權利要求18的細胞，其中所述細胞選自細菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。20.根據(jù)權利要求19的細胞，其中所述細胞是根癌農(nóng)桿菌。21.由包含權利要求2的核酸構建體的植物產(chǎn)生的種子。22.一種在植物中表達結構性核酸的方法，包括(a)用核酸分子轉化所述植物，所述核酸分子包含與所述結構性核酸可操作性連接的啟動子，其中所述啟動子包括選自SEQIDNO1、2、3、4所示序列及其它們的互補體的多核苷酸，并且其中所述啟動子和所述結構性核酸彼此異源；和(b)培育所述植物。23.根據(jù)權利要求22的方法，其中所述結構性核酸是反義方向的。24.一種在植物的種子中積聚游離氨基酸的方法，包括(a)用權利要求2的核酸構建體轉化所述植物，其中第二核酸編碼氨基酸生物合成基因，其中所述啟動子和所述第二核酸彼此異源；和(b)培育所述植物。25.一種控制大豆種子萌發(fā)的方法，包括(a)用權利要求2的核酸構建體轉化所述植物，其中第二核酸編碼赤霉素生物合成多肽，所述啟動子和所述第二核酸彼此異源；和(b)培育所述植物；(c)收獲所述植物的種子；和(d)種植所述種子。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程領域。更具體地說，本發(fā)明涉及胚胎發(fā)生的固定時期中的種子特異性基因表達。本發(fā)明提供能夠在種子中轉錄異源核酸序列的啟動子，及對其修飾、制備和應用的方法。文檔編號C12N15/11GK1728937SQ03815774公開日2006年2月1日申請日期2003年5月5日優(yōu)先權日2002年5月3日發(fā)明者王琦,莉薩·M·韋弗,蒂姆·N·奧爾馬索夫,杰弗里·阿倫斯,帕特里斯·杜波依斯,杰弗里·Q·申申請人:孟山都技術公司