專利名稱：一種長(zhǎng)距離pcr擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域的DNA熱循環(huán)擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增技術(shù)方法是進(jìn)一步分析序列結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的基礎(chǔ)，能夠從核基因組中擴(kuò)增超過20kb的片段，包括從cDNA中分離完整的基因(Rose，1991；Ohler and Rose，1992；Ohler et al.，1993)；包括分析一個(gè)群體中的高分子量限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Ohler and Rose，1992；Ohler et al.，1993)。在生命科學(xué)研究中許多撲朔迷離的問題終將由核基因組研究的開啟來回答。
長(zhǎng)距離PCR的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)組織材料的量要求較小，可以從1ng或更少的樣品(少于300拷貝，理論上可以是單細(xì)胞)中擴(kuò)增出足夠拷貝數(shù)的目的基因DNA序列(Barnes，1994)，因此，實(shí)驗(yàn)中就不必殺死整個(gè)動(dòng)物就可以獲取足夠的材料，這非常有利于保護(hù)稀有珍稀動(dòng)物。長(zhǎng)距離PCR技術(shù)是1990年以后才逐漸發(fā)展起來的(Frood and Rose，1995)，目前還遠(yuǎn)不是一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)，許多長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)條件需要摸索，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不容易實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)在成功報(bào)導(dǎo)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多在3～7kb之間，文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)擴(kuò)增長(zhǎng)度超過16kb序列并獲得成功的例子只有少數(shù)(Erlich etal.，1991；Rychlik et al.，1990；Krishnan et al.，1991；Maga andRrichardson，1991；Kainz et al.，1992；Ohler and Rose，1992；Barnes，1994；Ponce and Micol，1991)。
當(dāng)要擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小超過3～4kb時(shí)，一些普遍接受的“常規(guī)”PCR方案應(yīng)該作一些改動(dòng)，因?yàn)镻CR混合物中的各種成分都對(duì)長(zhǎng)距離PCR有影響。概括起來，高質(zhì)量的DNA模板(Rychlik et al.，1990；Kainz et al.，1992)，DNA聚合酶的選擇(Jeffreys et al.，1988；Krishnan et al.，1991；Maga and Richardson，1991；Poncce and Micol，1991)，引物的正確設(shè)計(jì)(Dieffenbanch et al.，1993；Ohler et al.，1993)，適宜的緩沖液條件(Ohler and Rose，1992；Myers andGelfand，1991)，都需要逐一摸索最適條件。另外，方法問題和熱循環(huán)條件同樣影響長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增(Frood and Rose，1994)。在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小超過10kb時(shí)，這些條件要求更加苛刻。

發(fā)明內(nèi)容
在對(duì)長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)條件進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法。
本發(fā)明方法主要包括以下步驟引物設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系建立，將按照設(shè)計(jì)合成的引物加入建立好的反應(yīng)體系后，再在一定條件下進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)完成后用電泳檢測(cè)擴(kuò)增的分子大小以確認(rèn)目標(biāo)片段的擴(kuò)增完成。
具體操作按擴(kuò)增要求設(shè)計(jì)并合成適合的引物；建立50～100μl反應(yīng)體系，其中含DNA模板，引物，Taq DNA聚合酶，PCR buffer，dNTP，MgCl2，ddH2O，可加適當(dāng)?shù)妮o助劑，并調(diào)節(jié)溶液pH值；熱循環(huán)72℃預(yù)變性后，30～40個(gè)熱循環(huán)，然后68℃完全延伸，最后在4℃終止反應(yīng)并保溫；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增分子的大小。
本發(fā)明可以通過以下操作得以實(shí)現(xiàn)第一步 引物設(shè)計(jì)在目的基因(目標(biāo)片段)的兩頭設(shè)計(jì)引物，要求設(shè)計(jì)的上下游引物之間和引物自身之間，不能存在連續(xù)3個(gè)或以上的配位堿基；保證引物3’末端有8個(gè)堿基的游離；引物GC含量要達(dá)到30％以上；引物設(shè)計(jì)以GC開頭，而以AT結(jié)尾。
用Primer 5程序設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為25個(gè)堿基的引物容易實(shí)現(xiàn)，該程序可以檢測(cè)引物并確保長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增的效率。
第二步 反應(yīng)體系建立采用50～100μl反應(yīng)體系，含以下成分DNA模板 1～60ng每條引物 10～20pmolPCR buffer10μl
dNTP 0.02～0.04pmolTaq DNA polymerase 2.5～5UMgCl20.125～0.25pmolBSA 10～30ngTris-base1.5～3pmolddH2O 補(bǔ)足反應(yīng)體積差額第三步 熱循環(huán)PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置預(yù)加熱72℃ 4～7min30個(gè)熱循環(huán)變性98℃ 3～8sec復(fù)性65℃ 20～60sec延伸68℃ 10～40min延伸 68℃ 10～40min保溫 4℃1～9h根據(jù)引物不同，熱循環(huán)中復(fù)性溫度和延伸溫度可有所不同。
第四步 電泳檢測(cè)用合適濃度的瓊脂糖凝膠，加擴(kuò)增產(chǎn)物到樣品孔，加合適的分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)作為分子量標(biāo)記，電泳，EB染色，紫外燈下觀察、記錄。
本發(fā)明公開了一種長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，可應(yīng)用于動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、微生物、細(xì)菌、病毒等基因組大片段DNA或者RNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小可達(dá)到35kb。
長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個(gè)關(guān)鍵條件在于寡核苷酸引物的正確設(shè)計(jì)，計(jì)算機(jī)輔助引物設(shè)計(jì)比人工設(shè)計(jì)或隨機(jī)選取更有效；所選的引物序列將決定PCR產(chǎn)物的大小、位置、以及擴(kuò)增區(qū)域的Tm值。
所設(shè)計(jì)的上下游引物之間和引物自身之間，不能存在連續(xù)3個(gè)或以上的配位堿基；保證引物3’末端有8個(gè)堿基的游離；引物GC含量30％以上；引物設(shè)計(jì)以GC開頭，而以AT結(jié)尾。
寡核苷酸引物、核酸模板在純度、GC含量和二級(jí)結(jié)構(gòu)方面的差別，DNA可能的化學(xué)修飾、核酸類似物或其它的特征，這些都能夠影響PCR擴(kuò)增的效率；PCR反應(yīng)比較粗放時(shí)，一定的引物模板復(fù)合體會(huì)導(dǎo)致非特異擴(kuò)增或者期望的PCR產(chǎn)物得率很低；通過修改特定條件下擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖液組分，將可能提高期望的PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率和特異性，比如使用增強(qiáng)反應(yīng)特異性的輔助劑小牛血清BSA，并用Tris調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至pH9.0～9.8。
長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增中，一個(gè)非常短的加熱步驟是非常必要的；因此需要一個(gè)預(yù)熱步驟，預(yù)熱溫度設(shè)置在72℃，4～7min便于引物和模板DNA的結(jié)合。
變性溫度達(dá)到98℃時(shí)，3～8sec處理將會(huì)得到大小10～35kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。延伸溫度設(shè)定在68℃，延伸時(shí)間根據(jù)DNA聚合酶延伸速度(1kb/min)來設(shè)定；相應(yīng)的減少反應(yīng)體積(30μl)，會(huì)得到更好的結(jié)果。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)藥品費(fèi)用低，主要費(fèi)用在后期的測(cè)序；技術(shù)簡(jiǎn)單可靠，對(duì)設(shè)備要求低，在普通的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室即可實(shí)現(xiàn)；材料要求量少，僅微量動(dòng)物組織(如1ng線粒體DNA)即可，特別適用于稀有的不可重復(fù)得到的生物材料。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1線粒體DNA(mtDNA)長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)材料冷凍整體材料(液氮冷凍后在-20℃保存)皺紋齒突蟾(Scutigerruginosus)，標(biāo)本編號(hào)為XM956，XM957，XM958，XM972。標(biāo)本保存在中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所兩棲爬行動(dòng)物研究室。
肌肉組織mtDNA提取10g冷凍肌肉組織，剪碎，放入研缽，加液氮迅速研磨成粉末狀；加50ml SE液，混勻，轉(zhuǎn)入6個(gè)10ml離心管；吸管吹打，靜置10min；重復(fù)吹打3次；靜置10min；小心吸取上清液，轉(zhuǎn)入數(shù)個(gè)2ml的Eppendorf管，1000g離心10min，棄沉淀，轉(zhuǎn)移上清液至新的Eppendorf管，12000g離心15min，棄上清；收集沉淀至2ml的Eppendorf管，加PBS緩沖液清洗3次；加1ml的SDS提取緩沖液，加蛋白酶K至終濃度100μg/ml，50℃溫浴2小時(shí)；500g離心10min，用口徑φ3mm的寬槍頭吸取上清、轉(zhuǎn)入新的2mlEppendorf管，酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次；取上清液轉(zhuǎn)入新的2mlEppendorf管，加2倍體積預(yù)冷(-20℃)的無水乙醇沉淀DNA；5000g離心3min，無菌條件下風(fēng)干；加500μl TE溶解，4℃保存?zhèn)溆?；分別測(cè)定以上DNA溶液在260nm、280nm、310nm的光吸收值，以確定DNA的濃度和純度，依照本方法提取的肌肉組織mtDNA的產(chǎn)率為1.8μg/g，光吸收值A(chǔ)260/A280的比值為1.6759；用1.4％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mtDNA，EB染色，紫外燈下觀察并照相記錄。
PCR預(yù)擴(kuò)增以所提取的皺紋齒突蟾(XM958)mtDNA溶液為模板，作PCR擴(kuò)增。采用的通用引物P7/P8和L1091/H1478序列見表1，PCR擴(kuò)增12S rRNA和16S rRNA基因部分片段，PCR產(chǎn)物的純化和序列測(cè)定由上?；倒就瓿?。
采用常規(guī)PCR擴(kuò)增12S rRNA和16S rRNA基因部分片段。
電泳檢測(cè)，用1.4％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，EB染色，紫外燈下觀察并照相記錄。采用通用的特異引物P7/P8，L1091/H1478(見下表)分別擴(kuò)增出約420bp、530bp的片段。測(cè)序和BLAST檢索，證明該擴(kuò)增片段是線粒體rRNA基因片段。
Name SequenceReferenceP75’-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3’Kocher etP85’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’ al(1989)L1091 5’-GCTTGAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3’ Kocher etH1478 5’-TGACTCTGCAGAGGGTGACGGGCGGGTGTGT-3’ al(1989)引物設(shè)計(jì)原理是根據(jù)擴(kuò)增出的12S rRNA基因和16S rRNA基因兩個(gè)片段的兩頭設(shè)計(jì)引物，因?yàn)閙tDNA是環(huán)形，這樣就可以反方向?qū)⒄麄€(gè)mtDNA序列擴(kuò)增出來。
已測(cè)定393bp的12S rRNA基因部分片段序列，正鏈5’-GCTTCGACTGGGCTTTGATTCCTTACATTTTATTCGCCAGGGGACTACGAGCGCAGCTTAAAAC
CCAAAGGACTTGGCGGTGCCCTACACCTCCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAATCCACGATACACCTCACCGTTTCTTGCCAAAACCGCCTATATACCGCCGTCTTCAACTTACCCTATGAAGGATTCACAGTAAGTTCAATGATCACCCATCAGAACGTCAGGTCAAGGTGTAGCGAATGAAACGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTATTTTAGACTACACGGATAATCAGTATGAAACCTGATTTTGAAGGAGGATTTAGCAGTAAAAAGAAATCAGAAAGTTCTTTTTAAGTCGGACCTAGGGCGCGTACACACCGCCCGC-3’已測(cè)定526bp的16S rRNA基因部分片段序列，正鏈5’-GGACGCCTGCCGGTGACACTTGTTCAACGGCCGCGGTATTCTGACCGTGCGAAGGTAGCGTAATCACTTGTCTTTTAAATAAAGACTAGTATGAATGGCATCACGAGGACTTAACTGTCTCCCCCCTCCTATCAGTGAAACTGATCTCCACGTACAAAAGCGAGGATGACATCATAAGACGAGAAGACCCTATGGAGCTTAAAACTAAAATCCACCTGTTTAACCCACTGTCTTATCGCAGTGCTAAAATAATAGGACCGGTTTGAGTTTTCAGTTGGGGTGACTTTGGAGGAAAATAAATCCCCCATGAAGACTTAAGCTTTGAGCGACCACTCTATGCATTAGTAAACCTAACTTATTTGACCCAATATTTTGATCAACGGACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCATTTCAAGAGTCCATATCGACAAATGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATTAGGACATCCTAATGGTGCAGCCACTACTAAGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTAC-3’根據(jù)上述所測(cè)得的12S rRNA和16S rRNA基因部分序列，拼接后用primer-5程序得到設(shè)計(jì)引物W2990和W2991，序列如下W2990上游引物5’-GAA ATC CTC CCT GAT GAC TCA CAA A-3’W2991下游引物5’-CTG CTA AAT CCG CCT TCC AAC CA-3長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增以皺紋齒突蟾(XM958)肌肉中提取的mtDNA為模板，以上述設(shè)計(jì)的引物W2990/w2991為引物，作長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增。
本長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增采用100μl反應(yīng)體系，含以下成分DNA模板(180μg/ml) 6μl每條引物(4pmol) 4μlLA-PCR buffer II(Takara) 10μldNTP(10mM) 4μlLA-Taq DNA polymerase(5U/μl)(Takara)1μl
MgCl2(25mM) 10μlBSA(1mg/ml)20μlTris-base(2M) 1.5μlddH2O 39.5μl分裝3個(gè)薄壁管，每管33μl，每管再加40μl的oil。
PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)設(shè)置預(yù)變性72℃ 5min30個(gè)循環(huán)變性98℃ 5sec復(fù)性65℃ 30sec延伸68℃ 17min延伸68℃ 20min保溫4℃9h用1.4％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)長(zhǎng)距離PCI產(chǎn)物，EB染色，紫外燈下觀察，產(chǎn)物大小與預(yù)想的一致，為16kb左右。
實(shí)施例2λDNA的擴(kuò)增。
以λDNA為模板(Promega，上海)，引物，反應(yīng)體系同實(shí)施例1，除30個(gè)熱循環(huán)的延伸時(shí)間為38min外，其它熱循環(huán)參數(shù)同實(shí)施例1。電泳檢測(cè)表明，擴(kuò)增得到35kb的DNA片段。
權(quán)利要求
1.一種長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，包括以下步驟引物設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系建立，將按照設(shè)計(jì)合成的引物加入建立好的反應(yīng)體系后，再在一定條件下進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)完成后用電泳檢測(cè)擴(kuò)增的分子大小以確認(rèn)目標(biāo)片段的擴(kuò)增完成。
2.權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，具體步驟是按擴(kuò)增要求設(shè)計(jì)并合成適合的引物；建立50～100μl反應(yīng)體系，其中含DNA模板，引物，TaqDNA聚合酶，PCR buffer，dNTP，MgCl2，ddH2O，可加適當(dāng)?shù)妮o助劑，并調(diào)節(jié)溶液pH值；熱循環(huán)72℃預(yù)變性后，30～40個(gè)熱循環(huán)，然后68℃完全延伸，最后在4℃終止反應(yīng)并保溫；瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增分子的大小。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，其引物設(shè)計(jì)要求設(shè)計(jì)的上下游引物之間和引物自身之間，不能存在連續(xù)3個(gè)或以上的配位堿基；保證引物3’末端有8個(gè)堿基的游離；引物設(shè)計(jì)以GC開頭，而以AT結(jié)尾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，其反應(yīng)體系中加入1.5～3pmol的Tris-base調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值至pH9.0～9.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，其熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置預(yù)加熱72℃，時(shí)間4～7min；每個(gè)熱循環(huán)采用98℃變性，時(shí)間3～8sec。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，針對(duì)較長(zhǎng)基因序列的擴(kuò)增條件苛刻等困難，公開了一種長(zhǎng)距離PCR擴(kuò)增方法，擴(kuò)增方法包括以下步驟引物設(shè)計(jì)，反應(yīng)體系建立，將按照設(shè)計(jì)合成的引物加入建立好的反應(yīng)體系后，再在一定條件下進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，反應(yīng)完成后用電泳檢測(cè)擴(kuò)增的分子大小以確認(rèn)目標(biāo)片段的擴(kuò)增完成，本發(fā)明具有費(fèi)用低，需要材料少等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1632130SQ20031010406
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
發(fā)明者莫邦輝, 曾曉茂, 郭驍才 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所