專利名稱：蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物農(nóng)藥的制造方法，尤其是一種用于制備微生物殺蟲劑——蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)簡稱B.T，是目前全世界產(chǎn)量最大的微生物殺蟲劑。它廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲、森林和果樹害蟲、貯藏害蟲以及醫(yī)學(xué)昆蟲，并取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。特別是在急需發(fā)展無公害農(nóng)產(chǎn)品的情況下，使用蘇云金芽孢桿菌可以大大減少化學(xué)農(nóng)藥的殘留，杜絕因施用化學(xué)農(nóng)藥而造成的人畜中毒現(xiàn)象。
現(xiàn)有技術(shù)中，一類是采用深層液體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌(如申請(qǐng)?zhí)枮?1105123.6的中國發(fā)明專利申請(qǐng)所公開的《一種植物用殺蟲菌的生產(chǎn)方法》等)，該類方法需要發(fā)酵罐、空氣過濾系統(tǒng)、板框壓濾機(jī)、濃縮罐等大型設(shè)備，工藝復(fù)雜、投資大、成本高、耗能大；另一類采用固體發(fā)酵技術(shù)，包括淺盤式、箱式和槽式發(fā)酵器培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌。此類傳統(tǒng)的固體發(fā)酵技術(shù)工藝簡單、投資少、但產(chǎn)量低。由于蘇云金芽孢桿菌屬好氧微生物，透氣性差將會(huì)抑制蘇云金芽孢桿菌的正常生長和代謝。因此，常常往培養(yǎng)基料(如麥麩、米糠、玉米粉、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等)中加入疏松劑(如谷殼、鋸末、玉米芯、高粱稈等富含粗纖維的物質(zhì))來改善其透氣性，但對(duì)蘇云金芽孢桿菌的發(fā)酵和后處理(制成不同的劑型的過程)造成以下不良后果①蘇云金芽孢桿菌生長增殖所需要的水分、空氣和營養(yǎng)物質(zhì)來自于培養(yǎng)基料固體顆粒表面，疏松劑的加入，大大減少了單位體積內(nèi)能被蘇云金芽孢桿菌所利用的有效表面積，使發(fā)酵效率降低；②蘇云金芽孢桿菌幾乎不分泌纖維素酶，添加的疏松劑不能被利用，既浪費(fèi)了原料，又使蘇云金芽孢桿菌生長增殖變慢、生產(chǎn)周期延長、產(chǎn)品的毒力效價(jià)不高；③疏松劑在發(fā)酵物中很難分離和粉碎，造成終產(chǎn)品的性能(如細(xì)度、穩(wěn)定性、懸浮率等)達(dá)不到相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在蘇云金芽孢桿菌可濕性粉劑的生產(chǎn)中顯得更為突出。因此，上述現(xiàn)有培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的方法有待于改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對(duì)上述采用固體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的方法進(jìn)行改進(jìn)，提供一種可縮短發(fā)酵周期，降低生產(chǎn)能耗，增加設(shè)備生產(chǎn)能力和提高產(chǎn)品毒力效價(jià)的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法是按以下步驟進(jìn)行①、對(duì)用于蘇云金芽孢桿菌固體培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基原料進(jìn)行機(jī)械粉碎，粉碎細(xì)度在200～400目；②、在粉碎后的固體培養(yǎng)基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養(yǎng)基原料總重量的60～80％；③、將濕化的固體培養(yǎng)基原料成型為顆粒，所成型顆粒的最大橫截面部位的直徑為2～10mm；④、將成型的顆粒在壓力0.1～0.15MPa、溫度121～135℃下滅菌30～45分鐘；⑤、使滅菌處理后的成型顆粒自然冷卻，當(dāng)其溫度降至28～30℃時(shí)，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入該成型顆粒中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為27～37℃、濕度為90～95％；當(dāng)成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現(xiàn)40～60％游離時(shí)即終止培養(yǎng)。
在上述步驟①中，所采用的固體培養(yǎng)基原料可以是現(xiàn)有固體發(fā)酵培養(yǎng)方法中的常規(guī)原料，如麥麩、米糠、玉米粉、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉等。同時(shí)，固體培養(yǎng)基原料中的各個(gè)組份均按原有工藝要求的比例進(jìn)行配制。也就是說，如何確定固體培養(yǎng)基的原料及其各組份的比例，均不是本發(fā)明方法所要解決的問題。在本發(fā)明方法的步驟①中，只需直接對(duì)按現(xiàn)有的固體培養(yǎng)方法(即按現(xiàn)有的原料配方)準(zhǔn)備的常規(guī)原料實(shí)施粉碎，使之達(dá)到一定的細(xì)度即可。對(duì)固體培養(yǎng)基原料的機(jī)械粉碎可以采用普通的超微粉碎機(jī)械進(jìn)行。在步驟②中，固體培養(yǎng)基原料中所加水量以能夠使固體培養(yǎng)基料濕化，使之具有擠壓成型的塑性，且成型后得到的顆粒不變形、不粘連、表面光滑為準(zhǔn)。在必要時(shí)，還可以將其它微量成分，如酵母粉、硫酸鎂、磷酸氫鈉、硫酸亞鐵、硫酸鋅、碳酸鈣等溶解于水中，再加入已攪拌均勻的固體培養(yǎng)基原料中。在步驟③中，可以采用現(xiàn)有的擠壓成型設(shè)備實(shí)現(xiàn)造粒，所制得的成型顆粒可以是圓柱狀、圓球狀、橢球狀或類似橢球形狀的顆粒。當(dāng)成型顆粒為圓柱狀時(shí)，其最大橫截面為圓柱的圓形橫斷面，而非圓柱的長度；當(dāng)成型顆粒為圓球狀時(shí)，其最大橫截面的直徑即為圓球的球徑；當(dāng)成型顆粒為橢球狀或類似橢球的形狀時(shí)，其最大橫截面直徑為橢球的短軸長度，而非橢球的長軸長度。所制顆粒的表面應(yīng)光滑圓潤、無毛刺、不開裂。就步驟④來說，采用的是現(xiàn)有固體發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的常規(guī)滅菌方法。在步驟⑤中，當(dāng)檢測(cè)到成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現(xiàn)40～60％游離時(shí)即終止培養(yǎng)，而不考慮發(fā)酵培養(yǎng)的全程時(shí)間。這是因?yàn)椋?dāng)采用不同的固體培養(yǎng)基原料或菌種時(shí)，其發(fā)酵培養(yǎng)的全程時(shí)間有可能發(fā)生較大的差異。另外，接入該成型顆粒中的菌種液可以是由蘇云金芽孢桿菌斜面制得的菌種液，也可以是由三級(jí)種子罐制得的菌種液，所應(yīng)用的蘇云金芽孢桿菌的培養(yǎng)條件實(shí)際上與現(xiàn)有技術(shù)中的固體發(fā)酵培養(yǎng)條件相同。在培養(yǎng)結(jié)束后，可以按現(xiàn)有工藝要求對(duì)培養(yǎng)所得產(chǎn)物進(jìn)行后處理，進(jìn)而制成水懸浮劑、可濕性粉劑等成品。
本發(fā)明的有益效果是①、采用固體造粒培養(yǎng)技術(shù)，在培養(yǎng)條件下顆粒與顆粒之間形成孔隙，可以保留充足的氧氣及順暢的通風(fēng)，保證了蘇云金芽孢桿菌在固體培養(yǎng)過程中對(duì)營養(yǎng)和透氣性的需求。有效地避免疏松劑給發(fā)酵和后處理帶來不良后果。尤其適宜于蘇云金芽孢桿菌固體發(fā)酵的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。②、傳統(tǒng)的固體發(fā)酵在接種后要立即進(jìn)行拌料，極易染菌。采用固體造粒培養(yǎng)技術(shù)之后，由于顆粒的光滑表面以及孔隙作用，可以省去接種后拌料這一操作，即只在由成型顆粒堆積成的培養(yǎng)基料料表面噴灑菌種液，菌種液便能自然地沉降在各個(gè)成型顆粒上，并能均勻分布，減小了蘇云金芽孢桿菌生產(chǎn)過程中雜菌感染的機(jī)率和勞動(dòng)強(qiáng)度。③、采用固體造粒培養(yǎng)技術(shù)之后，使蘇云金芽孢桿菌只在顆粒表面生長成厚厚的菌苔，而顆粒內(nèi)部則不形成。在后處理工序中，表面的菌苔易與顆粒分離，不僅使有效成分的收得率提高，而且也容易制得極高毒力效價(jià)的蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)品。④、固體造粒培養(yǎng)技術(shù)可以同現(xiàn)有的任何一種蘇云金芽孢桿菌固體發(fā)酵裝置相結(jié)合，在提高產(chǎn)品毒力效價(jià)的同時(shí)，還可以縮短發(fā)酵周期，降低能耗，增加設(shè)備的生產(chǎn)能力。
在本發(fā)明中，為了讓成型顆粒具有較為光滑的表面，并在成型顆粒之間形成足夠的孔隙，可以讓步驟③所制得的成型顆粒為表面具有弧形表面的顆粒。
本發(fā)明的內(nèi)容結(jié)合以下實(shí)施例作更進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實(shí)施例中所涉及的內(nèi)容。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施例中的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法按以下步驟進(jìn)行(以下所涉及的各重量份的單位為公斤)①、對(duì)用于蘇云金芽孢桿菌固體培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基原料進(jìn)行機(jī)械粉碎，粉碎細(xì)度為300目。在本實(shí)施例中，采用了現(xiàn)有的固體培養(yǎng)基原料配方，被粉碎的固體培養(yǎng)基原料為麥麩、豆餅粉和玉米粉，三者的重量份比例為82.2比2比2。粉碎后按上述比例進(jìn)行混合。
②、在粉碎后的固體培養(yǎng)基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養(yǎng)基原料總重量的70％。在本實(shí)施例中，在向固體培養(yǎng)基原料中加水時(shí)，將重量份分別為1.5、0.03、0.3的微量成分酵母粉、硫酸鎂和碳酸鈣加水?dāng)嚢?，將生石?重量份1.25)單獨(dú)加水成石灰水溶液后與酵母粉等制成的溶液混合，再加入上述被粉碎的固體培養(yǎng)基原料中。另外，將重量份為4.5的魚粉加水煮沸35分鐘，與重量份為2的葡萄糖混合后，制成營養(yǎng)液單獨(dú)滅菌待用。
③、將濕化的固體培養(yǎng)基原料成型為顆粒。在本實(shí)施例中，利用擠出成型設(shè)備，把混合均勻的固體培養(yǎng)基料擠壓成圓柱狀顆粒，其顆粒的最大橫截面部位的直徑(即圓柱的橫截面直徑)為4mm，顆粒長度在3cm。上述成型顆粒為表面具有弧形表面的顆粒。
④、將成型的顆粒(即顆粒狀培養(yǎng)基料)移入高溫滅菌鍋進(jìn)行滅菌。滅菌壓力為0.1MPa，溫度在121℃，滅菌40分鐘，待培養(yǎng)基料的溫度降至58℃，壓力為0時(shí)移入培養(yǎng)室內(nèi)。
⑤、使滅菌處理后的成型顆粒自然冷卻，當(dāng)其溫度降至29℃時(shí)，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入該成型顆粒中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為27～37℃、濕度為90～95％；當(dāng)成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現(xiàn)40～60％游離時(shí)即終止培養(yǎng)。具體過程是當(dāng)由成型顆粒堆積而成的培養(yǎng)基料的溫度降至29℃時(shí)，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液(菌株編號(hào)HBNK-1)與一半量的營養(yǎng)液混合，噴入培養(yǎng)基料的表面(無需攪拌培養(yǎng)基料，菌種液便能在顆粒間的孔隙中自然沉降，并能均勻分布在顆粒上)。培養(yǎng)的前1～12小時(shí)，蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)體處于對(duì)數(shù)期。培養(yǎng)至11～12小時(shí)，營養(yǎng)體處于對(duì)數(shù)峰期。此時(shí)將余下的另一半量的營養(yǎng)液噴入培養(yǎng)基料表面，補(bǔ)充營養(yǎng)源。這一時(shí)期的溫度控制在28～30℃。培養(yǎng)時(shí)間在13～25小時(shí)，此時(shí)蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)體處在穩(wěn)定期，這一時(shí)期的溫度控制在30～32℃。26小時(shí)以后，蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)體處在芽孢及伴孢晶體游離階段，此時(shí)的溫度控制在34～36℃，以促進(jìn)其老熟。培養(yǎng)時(shí)間至32～34小時(shí)，有50％的芽孢及伴孢晶體游離，故終止培養(yǎng)。整個(gè)發(fā)酵過程控制濕度在90～95％。此時(shí)在顆粒表面形成厚厚的一層蘇云金芽孢桿菌的菌苔(如果將培養(yǎng)基料直接干燥、粉碎后，測(cè)定其毒力效價(jià)在14000～16000IU/mg)。
在本實(shí)施例中，上述培養(yǎng)結(jié)束后，按現(xiàn)有工藝要求對(duì)培養(yǎng)所得產(chǎn)物進(jìn)行了后處理，其處理方法是A、將培養(yǎng)結(jié)束的固體培養(yǎng)基料倒入攪拌罐中加入1.8倍的無菌水，機(jī)械攪拌30分鐘，生長在培養(yǎng)基料表面的蘇云金芽孢桿菌菌苔，通過表面光滑的顆粒之間的相互磨擦，被洗入水中成為蘇云金芽孢桿菌的菌液，而培養(yǎng)基料在短時(shí)間內(nèi)不會(huì)溶散開，極易實(shí)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌與固體培養(yǎng)基料的分離。
B、將攪拌后的混合液通過2mm的振動(dòng)篩進(jìn)行自然沉降，顆粒狀的培養(yǎng)基料被濾出，濾出液粗濾后通過離心機(jī)進(jìn)行細(xì)濾，濾液再通過200目濾布后，裝入盛放第一次菌液的貯罐。將濾渣再加入無菌水，再重復(fù)洗滌一次。得到的菌液裝入第二次菌液的貯罐。經(jīng)過3次復(fù)洗，有效成份的收得率在93％。
C、將上一批次生產(chǎn)的第一次菌液作為水洗液，加入到下一批次的培養(yǎng)基料中，重復(fù)上述操作進(jìn)行洗滌。即可獲得高毒力效價(jià)的蘇云金芽孢桿菌的菌液。
D、將分級(jí)獲得的菌液直接制備2000IU/μl(合格品)、4000IU/μl(一級(jí)品)、8000IU/μl(優(yōu)級(jí)品)的水懸浮劑產(chǎn)品。
E、將獲得的高毒力效價(jià)的菌液經(jīng)過濃縮、干燥，可以制備出40000IU/mg(合格品)、50000IU/mg(一級(jí)品)的蘇云金芽孢桿菌原粉。也可以將發(fā)酵結(jié)束后的固體培養(yǎng)基料直接干燥、粉碎后制備8000IU/mg(合格品)、16000IU/mg(一級(jí)品)的可濕性粉劑產(chǎn)品。
為了進(jìn)一步說明本發(fā)明方法的技術(shù)效果，以下特給出采用現(xiàn)有固體發(fā)酵方法培養(yǎng)蘇云金芽孢桿菌的例子，即對(duì)照例對(duì)照例的原料配方同本發(fā)明以上實(shí)施例的配方。
其生產(chǎn)過程為第一步將原料(魚粉、葡萄糖除外)按比例進(jìn)行混合，加入總水量的70～80％混合均勻。魚粉加水煮沸30-40分鐘，與葡萄糖混合后制成營養(yǎng)液單獨(dú)滅菌待用。
第二步把配制好的固體培養(yǎng)基料移入高溫滅菌鍋進(jìn)行滅菌。滅菌壓力為0.1MPa，溫度在121℃，滅菌40分鐘，待培養(yǎng)基料的溫度降至58℃，壓力為0時(shí)移入培養(yǎng)室內(nèi)。
第三步當(dāng)培養(yǎng)基料的溫度降至29℃時(shí)，把蘇云金芽孢桿菌的種子液(菌株編號(hào)HBNK-1)與營養(yǎng)液混合，接入已滅菌的固體培養(yǎng)基料中，拌和均勻，并且每隔6小時(shí)翻料一次。1～17小時(shí)，蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)體處于對(duì)數(shù)期，這一時(shí)期的溫度控制在28～30℃。培養(yǎng)時(shí)間在18～32小時(shí)，蘇云金芽孢桿菌的營養(yǎng)體處在穩(wěn)定期，這一時(shí)期的溫度控制在30～32℃。33～50小時(shí)，此時(shí)期的溫度控制在32～34℃。整個(gè)發(fā)酵過程控制濕度在90～95％。當(dāng)有50％的芽孢及伴孢晶體游離，便終止培養(yǎng)，此時(shí)發(fā)酵周期在50小時(shí)左右。而且培養(yǎng)基料的表面肉眼看不出厚厚的菌苔。將培養(yǎng)基料直接干燥、粉碎后，測(cè)定其毒力效價(jià)在8000～10000IU/mg。
現(xiàn)將本發(fā)明實(shí)施例(固體造粒培養(yǎng))和對(duì)照例(常規(guī)固體培養(yǎng))發(fā)酵的基本情況進(jìn)行比較，列表如下固體造粒培養(yǎng)與常規(guī)固體培養(yǎng)基本情況對(duì)照表

從以上對(duì)照表可以看出，與現(xiàn)有同類方法相比較，采用本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法的發(fā)酵周期大為縮短，產(chǎn)品的毒力效價(jià)和有效成份的收得率顯著提高，可生產(chǎn)的品種增多，勞動(dòng)強(qiáng)度減小，生產(chǎn)成本降低，生產(chǎn)能耗也較小，從而具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
權(quán)利要求
1.一種蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行①、對(duì)用于蘇云金芽孢桿菌固體培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基原料進(jìn)行機(jī)械粉碎，粉碎細(xì)度在200～400目；②、在粉碎后的固體培養(yǎng)基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養(yǎng)基原料總重量的60～80％；③、將濕化的固體培養(yǎng)基原料成型為顆粒，所成型顆粒的最大橫截面部位的直徑為2～10mm；④、將成型的顆粒在壓力0.1～0.15MPa、溫度121～135℃下滅菌30～45分鐘；⑤、使滅菌處理后的成型顆粒自然冷卻，當(dāng)其溫度降至28～30℃時(shí)，把蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入該成型顆粒中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為27～37℃、濕度為90～95％；當(dāng)成型顆粒中芽孢、伴孢晶體出現(xiàn)40～60％游離時(shí)即終止培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是在步驟③中，所制得的成型顆粒為表面具有弧形表面的顆粒。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是在步驟⑤中，通過向由成型顆粒堆積成的培養(yǎng)基料表面噴灑菌種液，完成將蘇云金芽孢桿菌的菌種液接入成型顆粒中的操作。
全文摘要
一種蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行①對(duì)固體培養(yǎng)基原料進(jìn)行機(jī)械粉碎，粉碎細(xì)度在200～400目；②在粉碎后的固體培養(yǎng)基原料中加水使之濕化并攪拌均勻，加水量為固體培養(yǎng)基原料總重量的60～80％；③將濕化的固體培養(yǎng)基原料成型為顆粒，所成型顆粒的最大橫截面部位的直徑為2～10mm；④將成型的顆粒滅菌；⑤把菌種液接入成型顆粒中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。采用本發(fā)明的蘇云金芽孢桿菌固體造粒培養(yǎng)方法的發(fā)酵周期大為縮短，產(chǎn)品的有效成分的收得率顯著提高，可生產(chǎn)的品種增多，勞動(dòng)強(qiáng)度減小，生產(chǎn)成本降低，生產(chǎn)能耗也較小，發(fā)酵產(chǎn)物的毒力效價(jià)達(dá)到14000～16000 IU/mg。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1554743SQ200310104078
公開日2004年12月15日 申請(qǐng)日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
發(fā)明者胡佩, 閻玉鵬, 胡 佩 申請(qǐng)人:胡佩, 閻玉鵬, 胡 佩