專利名稱：利用同源重組的牛β－酪蛋白基因靶向載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及通過同源重組而實現其功能的牛β-酪蛋白基因靶向載體、利用該載體基因靶向的牛體細胞和用該牛體細胞進行核移植的胚胎。本發(fā)明還涉及到，從植入上述胚胎而制備的轉基因牛的牛奶中生產大量目標蛋白的方法。
背景技術：
我們在鑒定動物基因組的基因和其功能方面的不斷努力，使得產生轉基因動物成為可能。轉基因動物已經在工業(yè)生產中創(chuàng)造了巨大的市場價值，比如在生物醫(yī)學和農業(yè)等方面。還發(fā)展了各種制備轉基因動物或者所謂的遺傳改良動物的技術，例如顯微注射、病毒轉染、精子載體、胚胎干細胞(ES)應用和體細胞核移植(SNCT)。
顯微注射方法就是將一段DNA分子注射到雄性或者雌性受精卵原核(Harbers等人，Nature.，293(5833)；540-2，1981；Brinster等人，Cell.，27；223-231，1981；Gordon等人，Proc Natl Acad Sci USA.，77(12)；7380-7384；Costantini等人，Nature.，294(5836)；92-94)，該方法已經被廣泛應用于生產轉基因動物。(Hammer等人，Nature.，315(6021)；680-683，1985；van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002；Damak等人，Biotechnology(NY)，14(2)；185-186，1996)。然而，該技術生產轉基因動物的效率卻很低，只有2-3％的被注射的卵細胞能夠產生轉基因后代(Clark等人，Transgenic Res.，9；263-275，2000)。使用顯微注射方法生產轉基因動物也是一種非常消耗勞力并且昂貴的生產程序，需要大量的實驗動物和生產設備(Brink等人，Theriogenology，53；139-148，2000)。該技術另一不足之處是，它不能控制轉入基因的整合位點和拷貝數目，這種隨機的整合有時會導致轉基因的低效或者非特異性表達。甚至有報道說某些轉基因的這種非調控式表達有時會導致胚胎發(fā)育中致死現象(Wei等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，37；119-141，1997)。
逆轉錄病毒介導方法也廣泛應用于動物的遺傳操作(Soriano等人，Genes Dev.，1(4)；366-375，1987；Hirata等人，Cloning Stem Cells.，6(1)；31-36，2004)?；谠摷夹g，目標基因序列通過病毒介導載體引進動物的基因組。雖然病毒轉化比原核注射的效率高，但是由于多重整合會導致外源基因的隨機插入和鑲嵌插入(Piedrahita等人，Theriogenology，53(1)；105-116，2000)。另外，轉入基因的最大長度通常限制在約7kb，還存在病毒編碼的蛋白引起的潛在干擾因素(Wei等人，Annu Rev Pharmacol Toxicol.，37；119-141，1997；Yanez等人，Gene Ther.，5(2)；149-159，1998)。
為了解決上面提到的問題，我們研發(fā)了一種基因靶向技術，該技術能夠在特異位點插入或者去除一段DNA片段。基因靶向技術首先應用于老鼠的胚胎干細胞基因功能研究。老鼠胚胎干細胞目前正被用于進行胚胎預定遺傳修飾。通過使用這種技術操作鼠胚胎干細胞，產生了很多特異基因靶向的老鼠(Brandon等人，Curr Biol.，5(6)；625-634，1995；Capecchi等人，Science，244(4910)；1288-1292，1989；Thompson等人，Cell，56(2)；313-321，1989；Hamanaka等人，Hum Mol Genet.，9(3)；353-361，2000；Thomas et al，Cell，51(3)；503-512，1987；te Riele等人，Proc Natl Acad Sci USA，89(11)；5182-5132，1992；Mansour等人，Nature，336(6197)，348-352，1988；Luo等人，Oncogene，20(3)；320-328，2001)。將這種基因靶向技術推廣到其它的哺乳動物，尤其是牲畜，可能帶來巨大的生物醫(yī)學效益，例如大規(guī)模生產藥用蛋白質和動物疾病模型。
至今，大部分重組治療性蛋白質是利用細胞，例如酵母、細菌和動物細胞，通過細胞培養(yǎng)系統產生的。然而，由于生產量和高成本限制，很難用細胞培養(yǎng)系統大規(guī)模的生產這些蛋白質。而且，對于某些蛋白質還需要額外的步驟進行適當的翻譯后的修飾，例如糖基化、γ-羧基化作用、羥基化作用等等(Houdebine等人，Transgenic Res.，9(4-5)；305-320，2000；Lubo等人，Transgenic Res.，9(4-5)；301-304，2000)。
能生產有價值的或治療性的蛋白質的動物生物反應器已經被認為是一種有效的、成本效益高的表達系統。尤其是從轉基因動物體內大規(guī)模生產治療性重組蛋白質，要比從細胞培養(yǎng)系統生產更劃算(van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。大家公認，在動物乳液中產生的重組蛋白經過了類似于人體內相應蛋白質的翻譯后的修飾作用(Edmunds等人，Blood，91(12)；4561-4571，1998；Velander等人，Proc Natl Acad SciUSA.，89(24)；12003-12007，1992；van Berkel et al，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。
牛奶包含約88％的水、3.3％蛋白質、其余為碳水化合物和脂肪。酪蛋白構成了80％的牛奶蛋白質，酪蛋白分成四類αS1、αS2、β和κ酪蛋白。牛奶中β-酪蛋白含量最高，用濃度表達，在牛奶中的含量達到10mg/ml(Brophy等人，Nat Biotechnology.，21(2)；157-162，2003)。
體細胞核移植技術(SCNT)生產轉基因動物比顯微注射方法更為有效，因為幾乎所有的源于轉化體細胞的克隆動物都是轉基因動物(Brink等人，Theriogenology，53；139-148，2000)。該技術還能夠預先確定動物的性別并且形成遺傳純合的牧群來生產相同產物。(Lubo等人，Transgenic Res.，9(4-5)；301-304，2000；van Berkel等人，Nat Biotechnol.，20(5)；484-487，2002)。
至今，胚胎干細胞(ES細胞)和用于靶向特異基因的載體構建體被認識是產生基因靶向動物的先決條件。盡管有些研究表明在豬和牛體內能夠生成ES類似細胞，但是，來源于大的牲畜ES細胞的使用還是受到了限制(Doetschman等人，Dev Biol.，127(1)；224-227，1988；Stice等人，Biol Reprod.，54(1)；100-110，1996；Sukoyan等人，MolReprod Dev.，36(2)；148-158，1993；Iannaccone等人，Dev Biol.，163(1)；288-292，1994；Pain等人，Development，122(8)；2339-2348，1996；Thomson等人，Proc Natl Acad Sci USA.，92(17)；7844-7848，1995；Wheeler等人，Reprod Fertil Dev.，6(5)；563-568，1994)。
作為替代，利用正常體細胞作為核供體細胞被認為是一種生產轉基因牛的有效的、可行的方法(Brophy等人，Nat Biotechnol.，21(2)；157-162，2003；Cibelli等人，Science，280(5367)；1256-1258，1998；Campbell等人，Nature，380(6569)；64-66，1996；Wilmut等人，Experientia，47(9)；905-912，1997；Denning等人，Cloning stem cells，3(4)；221-231，2001)，這就暗示了體細胞取代胚胎干細胞被用于靶向特異基因的可能性。
運用體細胞核移植(SCNT)技術，使用乳蛋白基因啟動子區(qū)指導重組蛋白在轉基因大型動物乳液中進行表達(Schnieke等人Science，278(5346)；2130-2133，1997；Baguisi等人，Nat Biotechnol.，17(5)；456-461，1999；Brophy等人，Nat Biotechnol.，21(2)；157-162，2003)。然而，將該技術應用于農場動物仍然不可行除非因基因隨機插入而導致的低表達和(或)異常表達問題得到了解決。外源基因的異常表達引起早期胚胎致死，這種情況在神經系統尤其嚴重，因為大多數神經系統結構在胚胎晚期和出生后早期階段進行發(fā)育(Gao等人，Neurochem Res.，24(9)；1181-1188，1999)。為了消除或者減少這些副效應，發(fā)明了一種允許外源基因只在泌乳期并且嚴格控制在乳腺中表達的新方法(Houdebine等人，Transgenic Res.，9(4-5)；305-320，2000)。通過同源重組事件向基因組導入特異位點修飾的基因靶向是用于組織特異性表達重組蛋白的高效工具(Muller等人，Mech Dev.，82(1-2)；3-21，1999；Clark等人，J Mammary Gland Biol Neoplasia.，3(3)；337-350，1998)。
第一只基因敲入的綿羊的誕生，已經打開了可能生產藥用外源蛋白靶向的大型動物的大門(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。開發(fā)了具有COL1A1基因同源區(qū)域的COLT-2靶向載體以富集基因靶向事件中的啟動子-陷阱，其中COL1A1基因在纖維原細胞中高度表達。。在綿羊β乳球蛋白(BLG)表達載體中包含有與人類α1-胰蛋白酶(AAT)互補DNA的AATC2轉基因，被設計為在乳腺中直接表達，該轉基因具有獨自的轉錄單位。從靶向小羊體內分泌出的AAT量比從用多重和隨機整合該基因的綿羊體內分泌量的37倍還多(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。所以，現在基因靶向技術被視為生產大量藥用蛋白的最有效方法。然而，應用啟動子-捕獲靶向載體限于體細胞中具有轉錄活性的基因。通常，轉錄活性基因比沉默基因更易于修正基因靶向作用，因為，轉錄活性基因具有更高的同源重組頻率(Kuroiwa等人，NatGenet.，36(7)；775-780，2004)。
乳蛋白質在乳腺中以組織特異方式進行表達。通過操作乳蛋白編碼基因，使得在不引起胚胎期或者出生后的發(fā)育致死情況下過量表達外源基因成為可能。在這些蛋白中，β-酪蛋白由于其豐富的表達而成為最佳候選者之一。牛β-酪蛋白在整個基因組中以單拷貝形式存在，而且不知道在除了乳腺細胞的體細胞中表達。通過利用啟動子-陷阱載體，還不能成功將外源基因靶向進入不能在正常體細胞表達的β-酪蛋白基因中。
基于這種背景技術，本發(fā)明人發(fā)明了牛β-酪蛋白基因特異的靶向載體盒，利用該盒插入外源基因的載體，導入所述載體的牛體細胞，以及用所述的牛體細胞進行核移植的胚胎。本發(fā)明人發(fā)現外源基因正確地靶向?；蚪MDNA的β-酪蛋白基因中，并且確認了利用所述的載體靶向事件是高效的。所以，利用所述的牛β-酪蛋白基因靶向載體盒，本發(fā)明人完成了可以產生大規(guī)模目的藥用蛋白的轉基因牛。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種牛β-酪蛋白質基因靶向載體，該載體包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質基因的啟動子和側翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白質基因的外顯子1、內含子1和外顯子2；(2)用于克隆編碼目的蛋白質的核酸的區(qū)域；(3)編碼正選擇標記的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的第二區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內含子5、6和7；其中，按照β-酪蛋白質基因5’-3’的排列方向，和第一區(qū)域相應的核酸片段位于和第二區(qū)域相應的核酸片段的上游。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種利用上述靶向載體牛β-酪蛋白基因靶向的牛體細胞。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種利用上述體細胞進行核移植的胚胎。
本發(fā)明的另一目的是提供了一種制備牛β-酪蛋白質基因靶向的體細胞的方法，該方法包括以下步驟(1)將上述載體導入牛體細胞；(2)在牛體細胞中發(fā)生同源重組事件；(3)篩選牛β-酪蛋白基因靶向的體細胞。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備轉基因牛的方法，該方法包括以下步驟(1)將上述載體導入牛體細胞；(2)在牛體細胞內發(fā)生同源重組事件；(3)篩選牛β-酪蛋白基因靶向的體細胞；(4)將上述基因靶向細胞導入去核的卵母細胞，產生核移植的胚胎；和(5)將上述胚胎植入一個代孕體以產生克隆的轉基因牛。
本發(fā)明還有另一目的是提供一種從上述方法產生的克隆牛的牛奶中制備大規(guī)模的目的藥用蛋白質的方法。


圖1描述了源于質粒pBluescriptII SK(+)靶向牛β-酪蛋白基因的18.8kbpBCKII載體盒。該載體還包括neo基因上游的SacII、NotI、和BamHI限制性酶切位點，以及短臂區(qū)下游的BamHI位點。
圖2描述了源于質粒pGEM-7Zf(+)(Promega公司)的靶向牛β-酪蛋白基因的14.8kbpBCKIII載體。
圖3描述了源于質粒pGEM-7Zf(+)的靶向牛β-酪蛋白基因的16.1kb pBCKIDTII載體。該載體也還包括neo基因上游的SacII、NotI、和BamHI限制性酶切位點，以及短臂區(qū)下游的BamHI位點。而且，還插入了1.3kb的白喉毒素(DT)基因作為負選擇標記物。
圖4顯示了pBCKII載體和基因組中的β-酪蛋白基因之間的同源重組。雙交換導致內源β-酪蛋白基因被載體盒中的序列取代。
圖5顯示了pBCKIII載體和基因組中的β-酪蛋白基因之間的同源重組。雙交換事件導致基因組中β-酪蛋白基因基因座部分序列被載體盒中的部分序列取代。
圖6顯示了pBCKIDTII載體和基因組中的β-酪蛋白基因之間的同源重組。雙交換導致內源β-酪蛋白基因被載體盒中的序列取代。同源重組事件的結果是DT基因被刪除。
圖7顯示了用于鑒定發(fā)生在牛β-酪蛋白基因座、和跨越靶向β-酪蛋白基因座與pBCKII、pBCKIII靶向載體盒中限制性酶切位點連接的DNA序列的基因靶向事件的PCR篩選策略。上面部分顯示兩條引物的大概位置，這兩條引物是用于擴增從β-酪蛋白基因靶向載體中特有的neo基因區(qū)域至載體盒中沒有使用的內源性β-酪蛋白基因座之間的4kb片段。序列A顯示跨越長臂區(qū)和neo基因連接的部分DNA序列。序列B顯示跨越neo基因和短臂區(qū)連接的部分DNA序列。顯示了5’PCR引物的位置和方向。序列C顯示跨越短臂區(qū)和內源性β-酪蛋白基因基因座之間連接的部分DNA序列，內源性β-酪蛋白基因基因座不包括在BCKII和BCKIII載體中。顯示了3’PCR引物的位置和方向。
圖8顯示了用于鑒定發(fā)生在牛β-酪蛋白基因座、和跨越靶向β-酪蛋白基因座和pBCKIDTII靶向載體盒中限制性酶切位點連接DNA序列的基因靶向事件的PCR篩選策略。上面部分顯示兩對引物的大概位置，這兩對引物用于擴增從β-酪蛋白基因靶向載體中特有的neo基因區(qū)至載體盒中沒有使用的內源性β-酪蛋白基因座區(qū)之間的4kb和3.4kb片段。這里，使用第一對引物擴增4kb PCR片段后，再用第二對引物擴增3.4kbPCR片段以得到少量DNA樣品。序列A顯示跨越長臂區(qū)和neo基因之間連接的部分DNA序列。序列B顯示跨越neo基因和短臂區(qū)之間連接的部分DNA序列。顯示了5’PCR引物的位置和方向。序列C顯示跨越短臂區(qū)和內源性β-酪蛋白基因基因座之間連接的部分DNA序列，內源性β-酪蛋白基因基因座不包括在BCKII和BCKIII載體中。顯示了3’PCR引物的位置和方向。
圖9顯示了我們以前研究中構建的pBC10載體(Kim等人，J Biochem(Tokyo).，126(2)；320-5，1999)。pBC10載體基于pBluescriptII SK載體骨架包括10kb長的牛β-酪蛋白啟動子區(qū)。這個啟動子區(qū)包括8kb的基因5’側翼序列、非翻譯的外顯子1和2(垂直空白框)、和2kb的牛β-酪蛋白基因內含子1。啟動子包含SacI、AatII和SacII限制性酶切位點，但是沒有其它諸如SmaI、BamHI、SalI、SpeI和ClaI限制性內切酶的識別序列。
圖10顯示了用SacI和SacII限制性內切酶消化的pBC10載體中分離的10kbDNA片段。該分離的10kbDNA片段用于構建pBCKII載體盒的長臂。
圖11顯示了用AatII和SacII限制性內切酶消化的pBC10載體中分離的6kbDNA片段。該分離的6kb DNA片段用于構建pBCKIII載體盒的長臂。
圖12顯示了用于pBCKII和pBCKIII載體盒短臂的pBC3.1載體構建過程。使用含有XhoI和SalI位點(黑體字母)的引物對從牛染色體DNA中通過PCR擴增制備含有牛β-酪蛋白基因的5、6、7和8外顯子的3.2kb DNA片段。用限制性內切酶XhoI和SalI消化所擴增的PCR片段，然后連接到載體pGEM-T(Promega公司)的限制性內切酶SalI位點。用限制性內切酶HincII和SalI消化pGEM-T載體中的3.2kbDNA片段，然后連接到載體pBluescriptII SK(+)中的SalI位點。
圖13顯示了獲得neo基因的過程，neo基因包括來源于載體pMAMneo(CLONTECH公司)的SV40復制起始點、早期啟動子、抗新霉素基因、SV40早期剪接區(qū)和多聚腺苷酸化位點。用限制性內切酶BamHI消化的2.7kb neo基因片段，連接到載體pBluescriptII SK(+)的BamHI位點。用限制性內切酶BglII和BamHI消化載體pBluescriptIISK(+)中neo基因的2kbDNA片段，連接到載體pSP73(Promega公司)中的BglII位點。用限制性內切酶BglII和EcoRV消化載體pSP73中的2kb片段，然后再次連接到包含0.7kb neo基因的載體pBluescriptII SK(+)中的BglII和EcoRV酶切位點，產生pneo2.7載體構建體。
圖14顯示了pBCKII和pBCKIII載體盒構建過程。用各自的限制性內切酶消化pBluescript II SK(+)中的相當于正選擇標記和短臂區(qū)的DNA片段，然后連接到含有pBC10DNA片段的載體pBluescriptII SK(+)中的BamHI、EcoRV和SalI位點。所得到的pBCKII載體包括10kb的長臂區(qū)、選擇標記基因和短臂區(qū)。為了縮短pBCKII的長臂長度，將用限制性內切酶AatII和SalI消化的DNA片段連接到載體pGEM7Zf(+)的AatII和XhoI位點。所得到的載體pBCKIII包括6kb的長臂區(qū)、neo基因和短臂區(qū)。
圖15顯示了獲得DT基因的過程，將來源于pKO SelectDT(Lexicon Genetics公司)的DT基因插入pBCKIDTII載體。用限制性內切酶RsrII分離包含SV40多聚腺苷酸和RNA聚合酶II啟動子的白喉毒素A(DT)基因。使用klenow片段補平被分離的DT基因后，將其插進載體pBluescriptII SK(+)(Stratagene公司)中的HindII位點，生成pSKDT載體。用限制性內切酶XhoI和EcoRV消化pSKDT載體中的DT基因，然后連接到pSP73載體(Promega公司)中的XhoI和PvuII位點，生成pSP73DT載體構建體。
圖16描述了pBCKIDTII載體盒的構建過程。用限制性內切酶XhoI和SalI消化pSP73DT載體中的DT基因，然后連接到pBCKII載體盒的SalI位點，生成pBCKIDTI載體。用AatII和SalI酶切所得到的pBCKIDTI載體，然后連接到pGEM-7Zf(+)載體(Promega公司)中的AatII和XhoI位點，生成pBCKIDTII載體盒。
圖17顯示了把一個有價值的基因導入pBCKII載體。以藥用蛋白質基因示例，將人類促血小板生成素(hTPO)cDNA插入本發(fā)明的pBCKII載體盒中。在我們先前實驗中，以全長形式編碼的1.0kb的hTPO cDNA用PCR擴增，和將300bp長的牛生長素(bGH)基因的多聚腺苷酸附加信號序列連接到hTPO cDNA片段下游的KpnI位點(Sohn，DNA Cell Biol.，18(11)；845-852，1999)。將包含hTPO cDNA和bGH基因的1.3kbDNA片段插入pBCKII載體中的SacII和NotI位點，生成20.1kb的pBCTPOKII載體構建體。
圖18顯示了將hTPO cDNA導入pBCKIII載體盒。生成了16.1kb的pBCTPOKIII構建體并且其構建過程同圖17描述的一樣。
圖19顯示了將hTPO cDNA導入pBCKIDTII載體盒。結果，生成了17.4kb的pBCTPOKIDTII構建體，并且其構建過程同圖17描述的一樣圖20顯示了用SalI消化后，用于轉染的線性化pBCTPOKII載體。
圖21顯示了用AatII消化后，用于轉染的線性化pBCTPOKIII載體。
圖22顯示了用AatII和ClaI消化刪除質粒載體后，用于轉染的線性化pBCTPOKIDTII載體。
圖23顯示了用AatII和ClaI消化刪除質粒載體后，用于轉染的線性化pBCTPOKIII載體。然而，圖21描述的pBCTPOKIII載體僅僅是被線性化并利用質粒載體轉染細胞，這里描述的是用兩種限制性內切酶消化刪除質粒載體后的pBCTPOKIII載體轉染細胞。
圖24顯示了牛胚胎纖維原細胞(bEF)和牛耳皮纖維原細胞(bESF)的形態(tài)學照片。A和B分別是非轉染的(正常)bEF和bESF細胞，培養(yǎng)至匯合。C和D分別顯示了靶向載體轉染到bEF和bESF后形成的克隆。使用LipofectamineTM2000試劑(Invitrogen公司)方法，將具有neo耐抗生素基因的靶向載體導入bEF和bES后，用G418(Gibco，Invitrogen corporation公司)處理被轉染的細胞，然后，僅對存活的克隆細胞進行關于插入外源基因的分析。
圖25顯示了pBCKIII轉染后存活的克隆細胞的PCR分析。箭頭所指的500bp PCR片段的陽性信號代表轉染的細胞克隆，被表示為“+”，陰性信號被表示為“-”。將本發(fā)明的pBCTPOKIII載體用作陽性對照，并使用hTPO基因特異的引物進行PCR擴增。
圖26和圖27描述了pneoBC3.7載體構建過程，pneoBC3.7載體將被用作長鏈PCR分析的對照。使用一對引物從牛染色體DNA中通過PCR擴增單獨制備相當于牛β-酪蛋白基因的從7888位至8479位堿基的包含內含子8和外顯子9的591bp DNA片段。3’引物含有XhoI位點，用粗體符號(boldcharacter)描述。將擴增的PCR片段連接到pGEM-T載體，生成pBC591載體構建體。用限制性內切酶SalI和XhoI消化pBC591載體，然后將生成的DNA片段連接到pBC3.1載體的SalI位點。同時，用限制性內切酶BamHI和EcoRV消化pneo2.7載體，然后將生成的DNA片段連接到用限制性內切酶BamHI和EcoRV消化的pBC3.1載體，生成pneoBC3.7載體。箭頭顯示了用于4kb長鏈PCR分析的引物對。
圖28顯示了用pBCTPOKIII.轉染的bESF細胞克隆的長鏈PCR分析結果。箭頭所示的4kb陽性信號代表靶向細胞克隆，在“81”和“89”兩個克隆中被檢測到，其他的克隆顯示陰性信號(-)。將pneoBC3.7載體用作陽性對照。
圖29顯示了用pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII轉染的bESF細胞克隆的長鏈PCR分析結果。箭頭所示3.4kb陽性信號代表靶向細胞克隆。第一次是對約五個細胞進行PCR分析，然后第二次對第一次的PCR產物進行PCR分析，顯示了得到了3.4kb的陽性信號(圖8)。A是用pBCTPOKIDTII載體轉染的細胞克隆的長鏈PCR分析結果，編號5、30、17、18、20、21、和26細胞克隆確定為被基因靶向。B是用pBCTPOKIII載體轉染的細胞克隆的長鏈PCR分析結果，編號16細胞克隆確定為被基因靶向。C是作為陰性對照(-)的野生型?；蚪MDNA的長鏈PCR結果，pneoBC3.7載體作為陽性對照(+)。
圖30顯示了確定靶向核酸序列的Southern印跡分析策略。用EcoRI消化BCTPOKIII載體和從轉染細胞克隆中純化的基因組DNA。用EcoRI限制性內切酶消化后的BCTPOKIII載體(A)和基因組(B)的DNA片段長分別是9.2kb和9.9kb。hTPO基因下面的帶代表用于Southern分析的探針位點。PCR擴增hTPO cDNA的500bp片段用作探針。
圖31顯示了通過Southern印跡分析來確定靶向克隆。81和89號兩個克隆確定為本發(fā)明的pBCTPOKIII載體靶向的內源性牛β-酪蛋白基因基因座。靶向克隆顯示出9.9kb片段，其它克隆97、47、43和34沒有顯示任何信號。不同濃度的?；蚪MDNA作為陰性對照，不同濃度的來自于pBCTPOKIII載體的9.2kb片段作為陽性對照。
圖32顯示了對81號細胞克隆的核移植胚胎的PCR分析。356bp長度的陽性(+)信號暗示克隆胚胎來自于本發(fā)明pBCTPOKIII載體靶向的體細胞。pBCTPOKIII載體作為陽性對照。用嵌套PCR重新確定陽性信號。
圖33照片顯示了在懷孕36天收集的由89號細胞克隆(A)發(fā)育的胚胎膜包裹的胎兒(A)、除去胚胎膜的胎兒(B)、和從胚胎膜上得到的細胞(C)和對來自胚胎膜的細胞的長鏈PCR結果(D)。4kb的陽性信號說明本發(fā)明的pBCTPOKIII載體靶向與克隆的胚胎遺傳相同的細胞，。pneoBC3.7載體用作陽性對照。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及制備牛β-酪蛋白基因靶向載體以用于生產β-酪蛋白基因靶向牛，該靶向?？蓮呐Ｄ讨挟a生大量的目的治療性蛋白質。牛一年最多產奶6,300升，而山羊和綿羊一年分別產奶300和200升。牛是被用作動物生物反應器的最佳物種，然而，還沒有關于把目的基因靶向牛體內的牛奶蛋白質基因的報告。本發(fā)明涉及能夠靶向牛奶蛋白質基因中的牛β-酪蛋白基因的載體構建體和制備β-酪蛋白基因靶向牛的方法，該靶向牛使用本發(fā)明的載體構建體產生大量的治療性蛋白質。
一方面，本發(fā)明涉及的牛β-酪蛋白基因靶向載體，該載體包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質基因的啟動子和其側翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白質基因的外顯子1、內含子1和外顯子2；(2)克隆編碼目的蛋白質的核酸的區(qū)域；(3)編碼陽性選擇標記物的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的的第二區(qū)域，該區(qū)域和牛β-酪蛋白質基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內含子5、6和7；其中，按照β-酪蛋白質基因5’-3’的排列方向，與第一區(qū)域相應的核酸片段位于與第二區(qū)域相應的核酸片段的上游。
這里所用的“基因靶向載體”術語，是指一種能夠將一個目的基因去除或者插入到一個特異基因基因座的載體，它包括一段與用于同源重組的特定基因同源的核酸序列。本發(fā)明的基因靶向載體是β-酪蛋白靶向載體，它將編碼目的蛋白質的核酸序列按5’-3’排列插入基因組中的β-酪蛋白基因。術語載體和載體盒在此可以交替使用，載體可以是環(huán)形或者線性的。本發(fā)明的基因靶向載體是牛β-酪蛋白基因靶向載體。
本發(fā)明的β-酪蛋白靶向載體包括與β-酪蛋白基因序列同源的第一區(qū)域和第二區(qū)域，它們位于克隆位點的前后位置。第一區(qū)域對應于長臂，第二區(qū)域對應于短臂。
在發(fā)明的牛β-酪蛋白基因靶向載體組件中，特別是，“第一區(qū)域”和“第二區(qū)域”是決定基因靶向效率的重要參數。
這里的“第一區(qū)域”，特征是具有5至12kb的長度，該區(qū)域具有與牛β-酪蛋白基因啟動子及其側翼序列同源的DNA序列，包括牛β-酪蛋白基因的外顯子1-2和內含子1。牛β-酪蛋白基因啟動子是已知的誘導外源蛋白質高效表達的理想啟動子(Kim等人，J Biochem(Tokyo).，126(2)；320-325，1999)，并且是用來表達大量目的外源蛋白質的理想候選者。尤其是，5.5kb至10kb是優(yōu)選的長度。
這里的“第二區(qū)域”，特征是具有2.8至3.5kb長度的與牛β-酪蛋白基因DNA序列同源的序列，并且包括牛β-酪蛋白基因的外顯子5-8和內含子5-7。3.0kb至3.2kb是優(yōu)選長度。
按牛β-酪蛋白基因5’-3’排列，所述第一區(qū)域位于所述第二區(qū)域的上游。
這里所用的“同源性”術語，是指第一區(qū)域或第二區(qū)域的核酸序列與對應于這些第一和第二區(qū)域的內源β-酪蛋白基因序列之間的相似程度。當序列顯示至少90％的，優(yōu)選至少95％的序列相同性時，序列彼此同源。
這里所用的“(多)克隆位點”(MCS)術語，是指包含至少兩個能被限制性內切酶特異識別并消化的不同核苷序列的核酸序列以允許插入編碼目的蛋白質的核酸序列。
能夠插入本發(fā)明載體上的MCS的目的蛋白質，可以包括所有應用于醫(yī)藥的或者工業(yè)的蛋白質，例如激素、細胞因子、酶、凝血因子、載體蛋白質、受體、調控蛋白質、結構蛋白質、轉錄因子、抗體、抗原等。
目的蛋白質具體的實例包括，但不限于，血小板生成素、人生長素、生長素釋放激素、生長素釋放多肽、干擾素、干擾素受體、集落刺激因子、胰高血糖素類多肽、G蛋白偶聯受體、白細胞介素、白細胞介素受體、酶、白細胞介素結合蛋白、細胞因子結合蛋白、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞多肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白A、過敏反應抑制因子、細胞壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤抑制因子、轉化生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、載脂蛋白-E、紅細胞蛋白、高糖基化紅細胞蛋白、血管生成素、血色素、凝血酶、凝血酶受體激活肽、血栓調節(jié)蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX，因子X III、纖溶酶原激活物、纖維結合蛋白、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白C、C-反應蛋白、腎素抑制劑、膠原酶抑制劑、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生長素、上皮生長因子、表皮生長因子、血管抑制素、血管緊張素、成骨生長因子、生骨刺激蛋白、降血鈣素、胰島素、心房肽激素、軟骨誘導因子、elcatonin、結締組織活化蛋白、組織因子通路抑制劑、促卵泡刺激素、促黃體素、促卵泡激素釋放激素、神經生長素、甲狀腺激素、松弛肽、促胰液素、生長調節(jié)素、類胰島素生長因子、促腎上腺皮質激素、胰高血糖素、縮膽囊素、胰多肽、胃泌素釋放多肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、甲狀腺刺激激素、生育酚(autotaxin)、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、受體、受體拮抗劑、細胞表面抗原、病毒衍生疫苗抗原、單克隆抗體、多克隆抗體等等。
這里所用的“選擇標記”術語，是篩選載體轉化的細胞所必需的。選擇標記基因賦予了對藥物、營養(yǎng)需要和細胞毒素藥物的抗性，或者誘導了諸如熒光和色彩儲存等可選擇的表現型。有”陽性選擇標記”和”陰性選擇標記”。“陽性選擇標記”使得細胞表達陽性選擇標記以抵抗所選試劑而存活，所以，能夠賦予了表達那個標記的細胞陽性選擇特征。陽性選擇標記包括，但并不限于，新霉素、潮霉素、組氨醇脫氫酶、鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶等等。
本發(fā)明的載體包含了陰性選擇標記作為附加組件?！瓣幮赃x擇標記”去除隨機整合的細胞，從而使表達那個標記的細胞具有陰性選擇特征。陰性選擇標記包括，但并不限于，胸苷激酶(tk)、次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hprt)、胞嘧啶脫氨酶、白喉毒素(DT)等等。陰性選擇標記位于第一DNA序列的5’末端或者第二DNA序列的3’末端。在這些陰性選擇標記中，tk和DT用得普遍。在本發(fā)明中，DT基因用作陰性選擇標記。Tk要求丙氧鳥苷處理，然而，DT不需要任何其他的處理。據報道，用丙氧鳥苷處理攜帶tk的細胞，對共培養(yǎng)的非修飾細胞顯示了有效的“旁觀者效應”，并且丙氧鳥苷抑制細胞生長(Yoshiyasu Kaneko等人，Cancer Letters，96；105-110，1995)。在那些方面，DT比tk更優(yōu)選。
本發(fā)明的陽性和陰性選擇標記具有獨立的啟動子和多聚腺苷酸(poly A)區(qū)域。啟動子包括，但并不限于，猿病毒40(SV40)啟動子、老鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子、人免疫缺陷病毒長末端重復序列(HIV-LTR)啟動子、莫洛尼氏病毒啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、埃-巴二氏病毒(EBV)啟動子、呼吸合胞體病毒(RSV)啟動子、RNA聚合酶II啟動子、β-肌動蛋白啟動子、人血色素啟動子、人肌肉肌氨酸啟動子等等。
編碼目的蛋白質的核酸，通過同源重組被整合進宿主細胞內細胞基因組DNA中的β-酪蛋白基因基因座，并且取代內源性β-酪蛋白在細胞內被表達。
為了提高同源重組事件效率，本發(fā)明的牛β-酪蛋白基因靶向載體具有以下特征。
將編碼目的蛋白質的核酸基因整合進細胞基因組DNA的β-酪蛋白基因基因座的效率，顯示出與靶向載體系統，特別是與同源區(qū)域核酸序列的相似程度和長度有關(Scheerer等人，Mol Cell Biol.，14(10)6663-6673，1994；Thomas等人，Cell，51(3)；503-512，1987；Hasty等人，Mol Cell Biol.，11(11)；5586-5591，1991；Lu等人，Blood，102(4)；1531-1533，2003)。本發(fā)明通過優(yōu)化第一和第二區(qū)域的同源區(qū)位置和長度，使效率最大化。另外，為了使同源重組事件發(fā)生時位置干涉最小化，將本發(fā)明載體的陽性選擇標記插入相應于牛β-酪蛋白基因的外顯子3-4和內含子2-4的區(qū)域基因座。另外，在本發(fā)明中，在“第一區(qū)域”后部設計多克隆位點(MCS)，以便于插入外源蛋白質基因。另外，本發(fā)明最終載體設計有別于先前的載體(SHEN Wei等人，Chinese Journal ofBiotechnology，20(3)；361-365，2004)，本發(fā)明最終載體包含用于基因靶向的編碼目的蛋白質的基因的。在先前報道的載體中存在3個用于同源重組事件的同源區(qū)域，是因為編碼目的蛋白質的基因被隨機插入載體的第一區(qū)域(SHEN Wei等人，Chinese Journal ofBiotechnology，20(3)；361-365，2004)。然而，在本發(fā)明的載體中只存在兩段用于重組事件的同源區(qū)域，因為，編碼目的蛋白質的基因被插進載體的MCS中。因此，當使用本發(fā)明的載體盒時，基因靶向載體結構簡單，且載體靶向效率比先前的載體高很多(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)。
事實上，本發(fā)明載體系統甚至在轉錄沉默的體細胞中誘導同源重組事件發(fā)生，導致外源蛋白質基因穩(wěn)定地整合到β-酪蛋白基因的基因座。
在本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案中，制備pBCKII和pBCKIII載體、和攜帶陰性選擇標記的pBCKIDTI和pBCKIDTII載體用作靶向載體。
pBCKII載體，約18.8kb長，起源于pBluescriptII SK(+)質粒。pBCKI I載體的第一區(qū)域大約10kb長，它包括8kb的攜帶牛β-酪蛋白啟動子和牛β-酪蛋白基因的外顯子1、內含子1和外顯子2的序列。pBCKII載體的第二區(qū)域大約3.1kb長，且它包括外顯子5-8、內含子5-7和內含子4和8的一部分，如圖2所示。pBCKII載體包括作為選擇標記物的neo基因、SV40早期啟動子和多聚腺苷酸序列。pBCKII載體包括3個限制性內切酶位點(SacII、NotI和BamHI)，用于插入編碼目的蛋白質的核酸，如圖1所示。
pBCKII載體，約14.8kb長，源于pGEM7Zf(+)質粒。pBCKIII載體的第一區(qū)域大約6kb長，它包括約4kb長的牛β-酪蛋白啟動子和牛β-酪蛋白的外顯子1、內含子1和外顯子2。pBCKIII載體的第二區(qū)域大約3.1kb長，它包括外顯子5-8、內含子4-7和內含子4和8的一部分，如圖2所示。pBCKIII載體包括作為選擇標記的neo基因、SV40早期啟動子和多聚腺苷酸序列。pBCKIII載體包括3個限制性內切酶位點(SacII、NotI和BamHI)，用于插入編碼目的蛋白質的核酸，如圖2所示。
在pBCKII和pBCKIII載體的XhoI和SalI位點插入DT基因，產生pBCKIDTI和pBCKIDTII載體。
應用普通的DNA重組技術能夠制備本發(fā)明的靶向載體。應用本領域公知的酶能夠完成特殊位點的剪切和連接。
在一個具體實施方案中，將人血小板生成素(TPO)基因插入BCKII和BCKIII(圖17、18和19)。構建側翼為0.3kb牛生長素(bGH)基因片段的1kb人TPO cDNA片段(Sohn等人，DNA Cell Biol.，18(11)；845-852，1999)。被插入的bGH基因用于編碼穩(wěn)定的信使RNA。
人血小板生成素是主要的造血調控子之一，它參與一系列的巨核細胞生成過程，即誘導血小板生成的巨核細胞增殖和分化。作為血小板生成的主要生理調控子，它在促進巨核細胞的增殖和成熟中扮演關鍵角色。對血液系統癌癥和實體腫瘤患者進行侵襲性化療和骨髓移植時，可以觀察到嚴重的中性粒細胞減少癥和血小板減少癥(Lok等人，StemCells，12(6)；586-598，1994；Kaushansky等人，Stem Cells，15(1)；97-102，102-103，1997；Kaushansky等人，Ann Intern Med.，126(9)；731-733，1997；Kaushansky等人，Leukemia，11(3)；426-427，1997；Kaushansky等人，Annu Rev Med.，48；1-11，1997)。已確認，在動物模型中，重組的TPO能夠改善血小板減少癥，因此顯示了潛在的治療用途。TPO的安全和功效在第一階段臨床試驗中得到驗證(Fanucchi等人，N Engl J Med.，336(6)；404-409，1997；Basser等人，Lancet.，348(9037)；1279-1281，1996；O′Malley等人，Blood，88(9)；3288-3298，1996)。還顯示，TPO能夠增強接受癌癥化療的骨髓抑制患者恢復血小板生成。
特別提到，在2005年10月17日，被pBCTPOKIDTII載體轉化的大腸桿菌(Escherichia coli)細胞由國際保藏機構以編號KCTC 10864BP保存在韓國典型菌種保藏中心(KCTC，韓國大田宇松區(qū)歐洞#52，(#52Oun-dong Yuseong-gu，Daejeon，SouthKorea))。
在上述兩個載體中，在靶向基因組中的β-酪蛋白基因時攜帶具有長6kb的第一區(qū)域的pBCKIII載體比pBCKII載體更為有效。而攜帶陰性選擇標記DT基因的pBCKIDTII載體，顯示出比pBCKIII載體靶向效率要高4至5倍。在本發(fā)明中，36.6％的bEF和41.4％bESF細胞均被pBCKITPOKIDTII載體靶向，其靶向效率比先前靶向載體高3.3倍(41.4％/12.7％)，12.7％山羊胎兒成纖維細胞被先前的載體靶向(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)。因此，我們確信本發(fā)明的載體是高效的牛β-酪蛋白基因靶向載體。
在另一方面，本發(fā)明涉及用上述載體基因靶向的牛體細胞。
用本發(fā)明的載體靶向的細胞來自于真核細胞，并是原代細胞、次生或永久細胞。優(yōu)選地，這些細胞來自于牛、綿羊、山羊、豬、馬、兔、狗、猴等等，但不限于這些。能夠分離或者激活細胞的有用組織是肝、腎、脾、骨、骨髓、胸腺、心臟、肌肉、肺、腦、生殖腺、卵巢、胰島、腸、耳、皮膚、胰腺組織、前列腺、膀胱、胚胎、免疫系統、造血細胞等等，但不止這些。細胞類型有纖維原細胞、上皮細胞、神經細胞、胚胎細胞、肝細胞、卵泡細胞等等，但不限于這些。
載體的轉染方法包括任何將核酸導入細胞的方法，可以應用本領域眾所公知的適當技術進行轉染。轉染方法包括電擊、磷酸鈣共沉淀、逆轉錄病毒感染、微注射、二乙胺乙基葡聚糖轉染法、陽離子脂質體轉染等等，但不限于這些。在轉染的時候，用限制性內切酶消化線形載體比環(huán)形載體更加優(yōu)選，可作為示例。
特別提到，應用LipofectamineTM 2000試劑(Invitrogen公司)，將插入了人血小板生成素(hTPO)的β-酪蛋白靶向載體引入牛胚胎纖維原細胞(bEF)和牛耳皮纖維原細胞(bESF)。陽離子脂質體與帶負電的DNA有效地相互作用并且DNA脂質體復合物和細胞膜結合，因而導致DNA的共有化(internationalization)。應用長鏈PCR和Southern印跡分析從經過抗生素處理后存活的克隆中檢測和確認基因靶向載體插入特定的基因。使用這個程序，得到了hTPO靶向β-酪蛋白基因的bESF細胞克隆。81號細胞克隆命名為BCTPOKIbESF81，由韓國典型菌種保藏中心(KCTC)保存，編號為KCTC-10720BP，保藏日期為2004年11月10日，KCTC位于韓國大田宇松區(qū)歐洞#52。
在另一方面，本發(fā)明涉及用上述牛體細胞進行核移植的胚胎。
術語“核移植”是將核供體細胞遺傳物質移植到去核的卵母細胞中。因為相同供體細胞的遺傳物質被移植到受體細胞質中，所以，核移植技術使產生遺傳相同的動物克隆成為可能。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備牛β-酪蛋白基因靶向體細胞的方法，該方法包括的步驟是(1)將牛β-酪蛋白基因靶向載體導入牛體細胞；(2)在轉染體細胞中發(fā)生同源重組事件；和(3)選擇牛β-酪蛋白基因靶向的體細胞。
更加特別地，為了提高靶向效率，優(yōu)化了本發(fā)明的牛β-酪蛋白基因靶向載體pBCKII、pBCKIII、pBCKIDTI和pBCKIDTII。因此，使用上述載體，能夠提高牛β-酪蛋白基因靶向牛體細胞產生效率，牛β-酪蛋白基因攜帶編碼目的蛋白質的基因。
而且，在步驟(1)中的載體以線性形式或者以缺失質粒載體骨架的刪除形式導入細胞。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種提供制備克隆轉基因牛的方法，該方法包括的步驟是(1)將上述載體導入牛體細胞；(2)在牛體細胞中發(fā)生同源重組事件；(3)選擇通過同源重組攜帶目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向體細胞；(4)將上述基因靶向的細胞導入去核牛卵母細胞，產生核移植胚胎；和(5)將上述胚胎移植到代孕體，產生克隆的轉基因牛。
如上所述，本發(fā)明適于生產克隆的基因靶向牛，其中本發(fā)明的載體被優(yōu)化用于牛β-酪蛋白的基因靶向。
可以應用各種方法，例如物理去核、化學處理和松胞菌素B離心處理以除去卵母細胞的遺傳物質(Tatham等人，Hum Reprod.，11(7)；1499-1503，1996)。在本發(fā)明中，使用了玻璃微吸液管進行物理去核的方法。
通過使用諸如細胞融合方法和卵胞漿內單細胞注射(ICCI)等技術，將基因靶向的體細胞導入去核的動物胚胎。對于大量生產胚胎，細胞融合方法簡潔而有用。ICCI方法允許從供體細胞分離的細胞核最大限度地暴露在受體細胞質的胞液內。
通過電脈沖改變細胞表面的電荷，使得體細胞和去核的卵母細胞完成融合。使用脈沖長度和電壓易于控制的電極細胞操作器(electro-cell manipulator)是很方便的。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種從牛奶中生產目的蛋白質的方法，該方法包括如下步驟將本發(fā)明的載體導入動物體細胞；選擇通過同源重組目的基因靶向的細胞；將基因靶向的細胞導入去核的動物胚胎；將胚胎移植到產奶動物以產生轉基因動物；及從轉基因動物中產奶。
核移植的胚胎在體外激活并發(fā)育到胚泡階段，然后移植到受體中。
克隆胚胎的活化誘導臨時靜止的細胞周期的再啟動，由此胚胎分裂成為可能。為了激活克隆的胚胎，應該抑制細胞周期阻止因子，例如成熟促進因子(MPF)、有絲分裂活化蛋白(MAP)激酶等的激活，其中為了抑制這種因子的激活，增加克隆胚胎胞內鈣離子濃度是必要的。用電刺激法或者如離子霉素、6-二甲基氨基嘌吟(6-DMAP)化學處理方法等誘導鈣離子流入急劇增加，可完成細胞的激活，其中上面的方法可以單獨或者共同使用。在本發(fā)明中，用離子霉素+6-二甲基氨基嘌吟同時處理重構的胚胎并在體外發(fā)育到胚泡階段。
結果，產生了能夠在泌乳期表達目的蛋白質的克隆后代。使用本發(fā)明的靶向載體系統產生的轉基因動物，能夠從乳液中獲得大量的目的蛋白質，而在胚胎和出生之后的發(fā)育中不會引起嚴重的致死性。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種從克隆轉基因牛的牛奶中獲得目的蛋白質的方法，所述克隆轉基因牛用上述方法生產。
牛奶中表達的目的蛋白質能夠用傳統的方法純化出來，例如鹽析(例硫酸銨沉淀；磷酸鈉沉淀)、溶劑沉淀(例使用丙酮，乙醇等進行蛋白質分級沉淀)、透析、凝膠過濾、離子交換、色譜柱法如反向色譜柱法、超濾或其中方法相結合等等(Maniatis等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1982)；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，2d Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)；Deutscher，M.，Guide to Protein Purification MethodsEnzymology，vol.182.Academic Press.Inc.，San Diego，CA(1990))。
在下文中，本發(fā)明將參考下面的實施例進行詳細描述。然而，依照本發(fā)明的實施例可以被修改成其它形式，并且本發(fā)明的范圍不受下面實施例的限制。
實施例1——?；虬邢蜉d體構建1-1pBCKI I和pBCKIII載體構建在本發(fā)明中，我們應用了牛β-酪蛋白基因的啟動子基因座，它指導外源治療性基因在牛奶中表達。
如先前所述(Sohn等人，J Biotechnol.，103(1)；11-19，2003)的pBC10載體構建體(圖9)，包括了在pBluescriptII SK(+)質粒(Stratagene公司)中的牛β-酪蛋白的一個5’側翼序列的8kb的啟動子、整個外顯子1、2kb的內含子1和外顯子2的5’-URT。pBC10載體的β-酪蛋白基因區(qū)用作本發(fā)明的兩個載體盒pBCKII和pBCKIII的長臂(第一DNA區(qū))。如圖10所示，用SacI和SacII限制性內切酶消化10kb的β-酪蛋白基因，用作pBCKI I載體盒的長臂(第一DNA序列)(圖10和14)。用AatII和SacII限制性內切酶消化6kb的β-酪蛋白啟動子區(qū)用作pBCKIII載體的長臂(第一DNA序列)(圖11和14)，該區(qū)域包括牛β-酪蛋白基因4kb的啟動子、不翻譯的外顯子1、2和內含子1。
構建載體pBC3.1(圖12)用作本發(fā)明載體盒的短臂。牛β-酪蛋白基因序列(4676至7898)的3.2kb DNA片段包括外顯子5、6、7、8和內含子5、6、7和部分內含子4與8，通過以?；蚪MDNA作為模板進行PCR擴增。用于PCR反應的引物序列如下序列編號No1正向引物5’-attcagtcgagtggaacataaactttcagcc-3’序列編號No2反向引物5’-catatgtcgactgtgagattgtattttgact-3’引物序列的粗體字母表示為了生成XhoI和SalI限制性內切酶位點而改變的一些堿基。
用XhoI和SalI限制性內切酶消化PCR產物(圖12)，并連接到pGEM-T(Promega公司)的SalI位點。為了生成插入pBC10載體的酶切位點，用HincII和SalI限制性內切酶消化pGEM-T中的3.2kb牛β-酪蛋白基因片段。將生成的3.1kb片段連接到pBluescriptII SK(+)的SalI位點，產生BC3.1載體。
用作選擇性標記的neo基因片段也插進pBC10載體中。為了得到包括SV40復制起始位點、早期啟動子、SV40早期剪接區(qū)和多聚腺苷酸化區(qū)的neo基因片段，用BamHI限制性內切酶消化pMAMneo載體(CLONTHECH公司)。首先，將所生成的2.7kb DNA片段連接到pBluescriptII SK(+)的BamHI位點。其次，用BglII和BamHI限制性內切酶消化已連接載體中的2kb neo基因片段，然后連接到pSP73(Promega公司)的BglII位點。最后，用BglII和EcoRV限制性內切酶消化pSP73中2kb的neo基因片段，然后，重新連接到攜帶0.7kb pMAMneo基因片段的pBluescriptII SK(+)中BglII和EcoRV位點。這些DNA消化和連接步驟是將2.7kb neo基因片段插入pBC10載體所必需的(圖14)。
如圖11所示，通過將pneo2.7和pBC3.1基因片段組裝到pBC10載體，制成了pBCKII和pBCKIII載體盒。用BamHI和EcoRV限制性內切酶消化pBluescriptII SK(+)中的neo基因，然后，連接到pBC10載體的BamHI和EcoRV位點。用EcoRV和SalI限制性內切酶消化pBC3.1載體，然后，連接到包含億連接pMAMneo基因片段的pBC10載體中的EcoRV和SalI位點，生成pBCKII載體盒。用AatII和SalI限制性內切酶消化pBCKII載體盒，并連接到pGEM-7Zf(Promega公司)的AatII和XhoI位點，生成pBCKIII載體盒。因此，構建了pBCKII和pBCKIII載體盒。
1-2pBCKIDTI和pBCKIDTII載體構建將陰性選擇標記DT基因插入上述載體中(圖3和16)。當使用攜帶陰性選擇標記的pBCKIDTI載體pBCKIDTII時，因為大部分在隨機位點整合到載體的細胞克隆被DT基因毒性殺死，所以減少了非靶向細胞克隆(圖3和16)。用于本發(fā)明的DT基因分離于pKO SelectDT載體(Lexicon Genetics，The Woodlands，Tex.)。用限制性內切酶RsrII將攜帶SV40多聚腺苷酸和RNA聚合酶II啟動子的白喉毒素A鏈(DT)基因分離。用Klenow片段補平被分離的DT基因后，插入pBluescriptII KS(+)(Stratagene公司)的HindII限制性位點，生成pKS DT載體。用XhoI和EcoRV消化pKS DT載體中的DT基因，并連接到pSP73載體(Promega公司)的XhoI和PvuII位點，生成pSP73 DT載體(圖15)。用XhoI和SalI消化pSP73DT載體中的DT基因，然后插入pBCKII載體盒的Sal I位點，生成pBCKIDTI載體。用AatII和SalI消化pBCKIDTI載體，并連接到pGEM-7Zf(+)(Promega公司)的AatII和XhoI位點，生成pBCKIDTII載體盒(圖16)。
通過對所有合成DNA區(qū)和所有連接DNA片段的接合處進行DNA測序和酶切圖譜鑒定再次確認目標載體盒的保真度。
實施例2-pBCTPOKII和pBCTPOKIII的構建如圖17、18和19所示，將1kb的人TPO cDNA加上300bp的牛生長素插入pBCKII、pBCKIII和pBCKIDTII載體盒。攜帶SacII和NotI位點的1.3kb外源基因分別連接到pBCKII、pBCKIII和pBCKIDTII載體中的SacII和NotI位點，從而產生靶向載體，命名為pBCTPOKII、pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII(圖17、18和19)。特別提到，用pBCTPOKIDTII載體轉化的大腸桿菌(Escherichia coli)細胞保存在韓國典型菌種保藏中心(KCTC)，KCTC位于韓國大田305-333宇松區(qū)歐洞#52保存日期是2005年10月17日，保藏編號KCTC 10864BP。
實施例3-將pBCTPOKII、pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體構建體轉染到牛胚胎纖維原細胞(bEF)和牛耳部皮膚纖維原細胞(bESF)3-1導入線性載體用“QIAfilter Plasmid Midi試劑盒”(Qiagen公司)純化質粒DNA，pBCTPOKII和pBCTPOKIII，然后通過CsCl-溴化乙錠梯度平衡離心分離閉環(huán)的DNA。通過限制性內切酶SalI(圖20)和AatII(圖21)消化使被分離的質粒pBCTPOKII和pBCTPOKIII分別成為線性，然后用乙醇沉淀純化。最后，用分光光度計測定被純化的DNA濃度。
使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen公司)將線性的pBCTPOKII和pBCTPOKIII構建體導入2或3代的bEF和bESF中。對于bEF，我們檢測了三個不同的轉染試劑體積，例如2、4和10μl的，和兩個不同的DNA濃度，例如2和4μg。對于bESF，檢測了2、4和10μl的轉染試劑體積，和1、2和4μg DNA濃度。體細胞暴露在轉染試劑-DNA復合物中24小時。
在添加10％胎牛血清(Hyclone公司)、0.001％慶大霉素(Gibco，Invitrogen公司)和1％的無必需氨基酸的基本培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen公司)的Dulbecco Modified Eagle培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen公司)中培養(yǎng)體細胞，培養(yǎng)基每天更換。細胞在37℃，5％CO2空氣中培養(yǎng)。根據下面顯示的平板類型，細胞培養(yǎng)基體積不同。

在37℃，用1x胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Invitrogen公司)溶液處理生長至匯合的細胞3分鐘，然后用Dulbecco的磷酸生理緩沖液(Gibco，Invitrogen公司)清洗兩次。經1x胰蛋白酶-EDTA處理分開的細胞克隆通過輕輕抽吸被解里，然后轉移到更寬的平板中增殖。1x胰蛋白酶-EDTA溶液的使用體積依賴于下面顯示的細胞培養(yǎng)平板類型

實驗步驟顯示如下

將在96孔板生長至匯合的細胞轉移到48孔培養(yǎng)板，然后逐漸地擴展到24孔、12孔、6孔和100毫米的培養(yǎng)板。
在6孔板中，挑取約一半的轉染細胞進行PCR反應，其他的細胞被轉移到6孔培養(yǎng)板的兩孔中。
3-2刪除質粒載體后導入線性載體用限制性內切酶AatII和ClaI消化刪除pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體構建體中的質粒載體區(qū)域，然后參考上面(圖22和23)轉染bESF和bEF細胞。
實施例4-通過PCR分析鑒定轉染的細胞克隆為了篩選轉基因細胞系，PCR分析G418抗性克隆細胞。使用“AccuPrep基因組DNA提取試劑盒”(Bioneer公司)從6孔板的一半細胞中純化基因組DNA，并使用“AccuPower PCR預混合料”(Bioneer公司)進行PCR。用于人TPO cDNA的引物對和熱循環(huán)條件顯示如下SEQ ID No 3正向引物GGA GCT GAC TGA ATT GCT CCT CGTSEQ ID No 4反向引物CCT GAC GCA GAG GGT GGA CCC TCC

PCR結果顯示，大部分抗G418細胞克隆鑒定為轉基因細胞(圖17)。
實施例5-長鏈PCR檢測靶向細胞克隆應用長鏈PCR確定轉基因細胞克隆中的基因靶向細胞克隆。使用“AccuPrep基因組DNA提取試劑盒”(Bioneer公司)或者通過3-4個液氮冷凍和沸水融化的循環(huán)暴露出來的方法來純化每個轉基因細胞克隆的基因組DNA。使用“AccuPower PCR預混合料”(Bioneer公司)進行長鏈PCR。
如圖5所示，5’引物設計為與所轉染的載體構建體中neo基因的3’端結合，3’引物設計為與牛β-酪蛋白基因的內含子8結合，所述的牛β-酪蛋白基因存在于內源區(qū)域中而不在載體構建體中。在1％瓊脂糖凝膠中，所示的基因靶向的細胞克隆代表4kb PCR產物。引物對序列和熱循環(huán)條件顯示如下SEQ ID No 5正向引物5’-ccacacaggcatagagtgtctgc-3’SEQ ID No 4反向引物5’-ccacagaattgactgcgactgg-3’

牛β-酪蛋白基因靶向效率在實施例3-1和3-2中進行比較。
在實施例3-1中，兩個細胞克隆鑒定為被基因靶向的(圖28)。
如在實施例3-1中所示，pBCTPOKII載體轉染體細胞后，分離出41個單克隆細胞。在這些細胞中，38個(93％)克隆細胞確定為轉基因的，但是沒有檢測到靶向克隆細胞(0％)。pBCTPOKIII載體轉染體細胞后，分離出31個單克隆細胞。其中，29個(94％)克隆細胞確定為轉基因細胞，2個克隆細胞(7％)確定為基因靶向的BCTPOKIII載體位于基因組中的內源性牛β-酪蛋白基因的基因座(表1和圖28)。
表1BCTPOKII和BCTPOKIII載體的轉染和靶向效率

如實施例3-2所示，pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體轉染bEF和bESF細胞，靶向的細胞克隆用長鏈PCR分析確認。這里，對于小量的DNA樣品，進行二次PCR分析(圖27和29)。
二次PCR反應的熱循環(huán)條件和實施例5中的一樣。在1％瓊脂糖凝膠中，所示的靶向細胞克隆代表3.4kbPCR產物。二次PCR反應的引物對序列顯示如下SEQ ID No 8正向引物5’-ttcactgcattctagttgtggtttgtcca-3’SEQ ID No 9反向引物5’-tctaggaccaaacatcggcttactt-3’。
如圖29A所示，pBCTPOKIDTII載體轉染的編號5、30、17、18、20、21和26的bESF細胞克隆鑒定為被靶向。B顯示pBCTPOKIII載體轉染的編號16的bESF細胞克隆被靶向。C是用作陰性對照(-)的野生型?；蚪MDNA的和用作陽性對照(+)的pneoBC3.7載體的長鏈PCR分析結果。
pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體轉染bEF和bESF細胞和比較靶向效率。18.2％(10/55)的pBCTPOKIII載體轉染的bEF細胞克隆和41.4％(12/29)的pBCTPOKIDTII載體轉染的bEF細胞克隆為基因靶向，說明pBCTPOKIDTII載體的靶向效率比pBCTPOKIII載體的高2.3倍(41.4％/18.2％)。并且，5.7％(12/212)的pBCTPOKIII載體轉染的bESF細胞克隆，36.6％(63/172)的pBCTPOKIDTII載體轉染的bESF細胞克隆為基因靶向，說明pBCTPOKIDTII載體的靶向效率比pBCTPOKIII載體高6.4倍(36.6％/5.7％)。在這兩種細胞類型中，pBCTPOKIDTII載體的平均靶向效率比pBCTPOKIII載體高4.5倍(37.3％/8.3％)(表2)，表明pBCKIDTII載體盒是高效的牛β-酪蛋白基因靶向載體。另外，pBCTPOKIDTII載體在bEF細胞中的靶向效率比先前在山羊胚胎纖維原細胞的靶向載體(SHEN Wei等人，Chinese Journal of Biotechnology，20(3)；361-365，2004)靶向效率高3.3倍(41.4％/12.7％)，表明本發(fā)明的載體是高效的基因靶向載體。
表2.pBCTPOKIII和pBCTPOKIDTII載體的轉染和靶向效率

實施例6-Southern印跡分析重新確認靶向的細胞克隆使用實施例1描述的載體，參考實施例3方法完成牛β-酪蛋白基因靶向。結果顯示，靶向效率是多變的，并依賴于載體和轉染細胞的類型。
這里，使用實施例3-1方法，pBCTPOKIII載體靶向的兩個細胞克隆通過Southern印跡重新分析。
通過PCR反應鑒定為基因靶向的兩個克隆細胞，用Southern印跡再一次分析。將這兩個細胞克隆分別轉移到兩個100毫米的培養(yǎng)皿中。從其中兩者之一收集細胞，從每個克隆中提取至少10毫克DNA，用EcoRI在37℃消化16小時。通過50V電壓1×TAE緩沖液0.75％瓊脂糖凝膠，電泳16小時分離EcoRI消化的DNA。將DNA轉移到帶正電荷的尼龍膜(Boehringer Mannheim公司)，用靶向載體構建體中人TPO cDNA的探針雜交(看圖30)。根據指導(Roche公司)用SEQ ID No 3和4的引物制備Southern印跡探針。使用“PCR DIG標記混合物”(Roche公司)和“Taq DNA聚合酶”(QIAGEN公司)進行PCR反應。熱循環(huán)條件如下

用Southern印跡再次確認先前確定為基因靶向的兩個克隆(圖31)。這這兩個靶向細胞克隆是編號81和89細胞系。
編號81細胞克隆命名為BCTPOKIbESF81，保藏于在韓國典型菌種保藏中心(KCTC)，KCTC位于韓國大田305-333宇松區(qū)歐洞#52保藏日期為2004年11月10日，保藏編號KCTC-10720BP。
實施例7-制備牛的體細胞根據韓國國家牲畜研究所動物安全和使用委員會指南進行實驗。從荷蘭斯坦因種(Holstein)母牛懷孕45天的胎兒中分離牛胚胎纖維原細胞(bEF)，Holstein母牛每年生產超過12,000公斤牛奶，制備如先前所述(Koo等人，Biol Reprod.，63(4)；986-992，2000)。用虹膜剪除去胎兒頭部，用兩把watchmarker鑷子舀出并除去肝和腸等軟組織。從每年生產超過12,000公斤牛奶的兩歲大荷蘭斯坦因種(Holstein)母牛耳部皮膚中分離牛耳部皮膚纖維原細胞(bESF)。用PBS(Gibco BRL公司)清洗兩遍后，bEF和bESF在100毫米培養(yǎng)皿中用外科手術刀切碎。在室溫下進行操作。切碎的組織在盛有10毫升的0.05％(w/v)胰蛋白酶的0.53mM EDTA溶液的培養(yǎng)器皿中于38.5℃孵育30分鐘。通過添加含有10％胎牛血清的等體積的細胞培養(yǎng)基使胰蛋白酶失活。細胞培養(yǎng)基是含有10％FBS、1000單位的青霉素和1000微克每毫升的鏈霉素(Gibco BRL公司)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium)。劇烈抽吸后，150xg離心上清液5分鐘。懸浮細胞，調節(jié)終濃度為2×106個細胞每毫升，然后在10毫升培養(yǎng)基37℃5％CO2空氣的175-cm2的組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(Nunc，Roskilde，丹麥)，直到匯合。bEF和bESF細胞在添加20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亞砜(DMSO)的冰Dulbecco磷酸鹽緩沖液中冷卻，在-70℃冷凍16小時。細胞儲藏在液氮中直到轉染實驗。
為了得到基因靶向細胞系，DNA轉染的細胞應該在體外培養(yǎng)中存活一長段時間，而沒有形態(tài)上的改變和凋亡。在本發(fā)明中，將BCTPOKII和BCTPOKIII載體導入兩種類型體細胞bEF和bESF。據報道，牛出生后的纖維原細胞比牛胎兒纖維原細胞在培養(yǎng)基中能維持更長時間的相對穩(wěn)定的染色體組型(Williams等人，Mol Reprod Dev.，66(2)；115-125，2003)。在本發(fā)明中，在體外培養(yǎng)物中bESF比bEF保持更長時間的正常的形態(tài)(表2)。
表2.4代和8代細胞存活率

4代304個bESF克隆中51個(17％)傳至8代，顯示正常的形態(tài)。然而，只有6％的bEF細胞克隆傳至8代。在本實驗中，我們從bESF細胞中得到了兩個基因靶向克隆。
實施例8-凍融冷凍的基因靶向細胞當基因靶向細胞在兩個100毫米的培養(yǎng)皿中生長至匯合時，對一個平板上的細胞進行Southern印跡分析。另一平板的一半細胞進一步傳代培養(yǎng)，其余的一半細胞在-70℃冷凍16小時后儲藏在液氮中。為了得到大量用作供體細胞的細胞，重復細胞亞培養(yǎng)和儲藏的過程。細胞冷凍培養(yǎng)基包含添加20％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亞砜(DMSO)的DMEM。
盡快融解一小瓶冷凍的基因靶向細胞后，將溶液轉移到含9毫升細胞培養(yǎng)基的15毫升試管中，1000轉每分鐘離心3分鐘。在3毫升培養(yǎng)基中重懸細胞沉淀，涂布到含有3毫升培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板上，然后在細胞核轉移之前在37℃5％CO2空氣中培養(yǎng)。
實施例9-細胞核轉移從屠宰場的牛卵巢獲得牛卵母細胞，在38.57℃5％CO2濕潤空氣的成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)基包含了添加10％(V/V)牛胎血清(FBS)(Gibco BRL，Grand Island，NY公司)的含Eagle鹽和L-谷氨酸的TCM-199(Sigma Chemical公司)、1微克每毫升的雌二醇、1微克每毫升的FSH-P(Schering-Plough Animal Health Corp.，Kenilworth，NJ公司)和25mM NaHCO3。在體外成熟之后，卵母細胞轉移到500微升含有0.1％透明質酸酶的TL-Hepes，然后手動吸取除去堆積的卵母細胞。使用一個精細的玻璃針部分切開裸露卵母細胞的透明帶(Tsunoda等人，J Exp Zool.，240(1)；119-125，1986)。應用裝備反向顯微鏡的顯微操作器(Leitz，Ernst Leitz Wetzlar GmbH，德國)進行卵母細胞的去核和細胞注射操作。用于操作的介質是包含7.5微克每毫升細胞松弛素B的TL-Hepes。用內徑20微米微移液器同時除去第一極體和部分可能包含中期II染色體的細胞質。單基因靶向細胞分別轉到受體細胞質的卵周隙。在50微升細胞融合培養(yǎng)基中小滴中平衡細胞-細胞質復合物10-20秒，然后轉移到具有間隔1毫米的兩個電極的融合杯中，上蓋融合培養(yǎng)基。細胞融合培養(yǎng)基包括0.3M甘露醇、0.5mM Hepes、0.01％牛血清白蛋白、0.1mM氯化鈣和0.1mM氯化鎂。使用Electro Cell Manipulator 2001(BTX，San Diego，CA)以1.6千伏每厘米的一次直流脈沖誘導細胞-細胞質復合物融合20毫秒。在室溫下進行操作。融合脈沖1小時后沒有可見體細胞的重組胚胎被確定為融合卵。電融合4小時后，用5μM離子霉素激活融合卵5分鐘，再用添加10％FBS的2.5mM 6-二甲基-氨基嘌呤的CR1aa培養(yǎng)液(Rosenkrans等人，Biol Reprod.，49(3)；459-462，1993)在38.5℃5％CO2空氣中處理3.5小時。
實施例10-重組胚胎的培養(yǎng)重組胚胎在添加1mM谷氨酸和1x Eagle必需氨基酸溶液(Gibco BRL)的CR1aa培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后，分裂的胚胎在4孔培養(yǎng)板的每個孔中于38.5℃和含5％CO2空氣中進一步培養(yǎng)4天，4孔培養(yǎng)板中包含在老鼠胚胎纖維原細胞單層(添加10％FBS)上的750微升CR1aa(Park等人，Anim Reprod Sci.，59(1-2)；13-22，2000)。培養(yǎng)7天之后，觀察到胚泡的形成。
實施例11-克隆胚胎的PCR分析將每個胚胎轉移到20μl的裂解緩沖液中，裂解緩沖液包含50mM KCl、1.5mMMgCl2、10mM pH8.5的Tris-HCl、0.5％偌乃洗滌劑P40、0.5％吐溫和400微克每毫升蛋白酶K，65℃溫育30分鐘。95℃失活蛋白酶K 10分鐘(McCreath等人，Nature，405(6790)；1066-1069，2000)。使用“AccuPower PCR預混合液”(Bioneer公司)和SEQ IDNo 3、4的引物對對每個裂解的胚胎進行首次PCR，然后，用1微升的首次PCR產物進行嵌套PCR。使用SEQ ID No 3和7的引物和熱循環(huán)條件如下嵌套PCRSEQ ID No 7反向引物5’-gagacggacctgtccagaaagctg-3’

對各種不同的發(fā)育階段用PCR分析克隆的胚胎是否是轉基因的(表3)。
表3.各種不同發(fā)育階段的重組胚胎PCR分析

結果顯示，33個克隆胚胎中33個(100％)是轉基因的。這一結果表明，本發(fā)明能夠通過基因靶向的體細胞產生基因靶向的克隆動物。
圖32顯示了來自于細胞克隆81的核移植胚胎的PCR分析結果(圖23)。
實施例12-來源于克隆胎兒的胚胎膜的長鏈PCR分析。
使用非外科方法將胚泡階段的重組胚胎轉移到受體。懷孕36天，用Foley導管(Agtech，Manhatan，KS)以非手術的方式從母牛子宮取出胎兒和胚胎膜。如實施例7所述在體外培養(yǎng)提取的胎兒和來源于胎兒的胚胎膜。長鏈PCR結果顯示了4kb的條帶，確認本發(fā)明的載體精確地靶向于來源自胚胎膜的培養(yǎng)細胞基因組中的β-酪蛋白基因(圖33)?；蚪MDNA提取和長鏈PCR分析過程和實施例5所述相同。
工業(yè)實用性如這里所描述的，使用由牛β-酪蛋白基因靶向載體所靶向的細胞移植核移植胚胎而制備的轉基因牛能夠在它們的牛奶中生產大量的具有生物醫(yī)學或生物技術價值的蛋白質，并且在胚胎階段或者出生后發(fā)育階段外源蛋白質非調控的表達不會引起致死性。
關于國際承認的用于專利目的的微生物保藏的布達佩斯條約國際表格原始保藏事項的受理根據71條頒布的致韓龍萬韓國大田305-345宇松區(qū)星松洞漢那棟110-305

關于國際承認的用于專利目的的微生物保藏的布達佩斯條約國際表格原始保藏事項的受理根據71條頒布的致韓龍萬韓國大田305-345宇松區(qū)星松洞漢那棟110-305

序列表<110>韓國生命工學研究院<120>使用同源重組的牛β-酪蛋白基因靶向載體<150>PCT/KR2004003034<151>2004-11-23<160>9<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛酪蛋白基因擴增的引物<400>1attcagtcga gtggaacata aactttcagc c 31<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>牛酪蛋白基因擴增的引物<400>2catatgtcga ctgtgagatt gtattttgac t 31<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>hTPO擴增的引物<400>3ggagctgact gaattgctcc tcgt 24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>hTPO擴增的引物<400>4cctgacgcag agggtggacc ctcc 24<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>5ccacacaggc atagagtgtc tgc 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>6ccacagaatt gactgcgact gg22
<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>嵌套式PCR引物<400>7gagacggacc tgtccagaaa gctg 24<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>8ttcactgcat tctagttgtg gtttgtcca 29<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>鑒定基因靶向的引物<400>9tctaggacca aacatcggct tactt 2權利要求
1.一種牛β-酪蛋白基因靶向載體，包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域與牛β-酪蛋白質基因的啟動子和其側翼核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白質基因的外顯子1、內含子1和外顯子2；(2)用于克隆編碼目的蛋白質的核酸的區(qū)域；(3)編碼正選擇標記的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的第二區(qū)域，該區(qū)域與牛β-酪蛋白質基因的核酸序列同源，并包含牛β-酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內含子5、6和7；其中，按照牛β-酪蛋白質基因5’-3’的排列方向，與第一區(qū)域相應的核酸序列位于與第二區(qū)域相應的核酸序列的上游。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述第一區(qū)域長度是5.5至10kb。
3.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述第二區(qū)域的長度是3.0至3.2kb。
4.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述陽性選擇標記選自包括新霉素(Neo)、潮霉素(Hyg)、組氨醇脫氫酶基因(hisD)和鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Gpt)的組。
5.根據權利要求1所述的載體，其特征在于，所述載體還包括陰性選擇標記的區(qū)域。
6.根據權利要求5所述的載體，其特征在于，所述陰性選擇標記是白喉毒素(DT)基因。
7.根據權利要求1或5所述的載體，其特征在于，所述載體是分別在圖1、圖2、圖16或者圖3中顯示的pBCKI I、pBCKI II、pBCKIDT I或者pBCKIDT II。
8.一種牛體細胞，所述的牛體細胞使用權利要求1或者5所述的載體進行β-酪蛋白基因靶向。
9.一種胚胎，所述的胚胎利用權利要求8所述的牛體細胞進行核移植。
10.一種產生牛β-酪蛋白基因靶向的體細胞的方法，包括以下步驟(1)將權利要求1或5所述的牛β-酪蛋白基因靶向載體導入牛體細胞；(2)在牛體細胞中發(fā)生同源重組事件；和(3)選擇通過同源重組攜帶目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向的體細胞。
11.根據權利要求10的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的載體以線性或者缺失質粒載體骨架的刪除形式導入細胞。
12.一種產生轉基因牛的方法，包括以下步驟(1)將權利要求1或5所述的牛β-酪蛋白基因靶向的載體導入牛體細胞；(2)在牛體細胞中發(fā)生同源重組事件；(3)選擇通過同源重組攜帶目的基因的牛β-酪蛋白基因靶向的體細胞；(4)將所述基因靶向的細胞導入去核牛胚胎以生產核移植胚胎；和(5)將胚胎移植進受體。
13.一種從轉基因牛的牛奶中獲得大量目的蛋白質的方法，所述的轉基因牛根據權利要求12所述的方法獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牛β－酪蛋白基因靶向的載體，包括(1)具有5至12kb長度的第一區(qū)域，該區(qū)域和牛β－酪蛋白基因的啟動子和側翼核酸序列同源，并包含牛β－酪蛋白基因的外顯子1、內含子1和外顯子2；(2)用于克隆編碼目的蛋白質的核酸的區(qū)域；(3)編碼正選擇標記的區(qū)域；(4)具有2.8至3.5kb長度的第二區(qū)域，該區(qū)域和牛β－酪蛋白基因的核酸序列同源，并包含牛β－酪蛋白基因外顯子5、6、7和8，以及內含子5、6和7；其中，按照牛β－酪蛋白基因5’－3’的排列方向，和第一區(qū)域相應的核酸序列位于和第二區(qū)域相應的核酸序列的上游。本發(fā)明還涉及生產轉基因牛的方法，所述的轉基因牛使用上述攜帶編碼目的蛋白基因的載體進行牛β－酪蛋白基因靶向，并從上述轉基因牛的牛奶中獲得大量的目的蛋白質。
文檔編號C12N15/00GK1914324SQ200580003660
公開日2007年2月14日 申請日期2005年11月18日 優(yōu)先權日2004年11月23日
發(fā)明者韓龍萬, 李景廣, 張米亞, 具德本 申請人:韓國生命工學研究院