專利名稱：缺失型α珠蛋白基因的多重PCR檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種用于醫(yī)學(xué)檢測人α-珠蛋白基因的多重PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
α-珠蛋白基因位于第16號(hào)染色體短臂末端α-珠蛋白基因簇中。該基因簇包括二個(gè)重復(fù)的α基因(α2和α1)、一個(gè)胚胎期α類基因(ξ2)、三個(gè)假基因(ψξ1、ψα2、ψα1)和一個(gè)功能未明的基因(θ1)，其序列順序?yàn)?’-ξ2-ψξ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1-3’，全長50kb(Buckle VJ，1988；Lauer J，1980；Michelson AM，1983；Hatton CS，1990)。其中ξ基因編碼ξ珠蛋白鏈，在胎兒早期表達(dá)。在胎兒后期至出生后，ξ逐漸被α2，α1所代替。
α2和α1基因處于兩個(gè)高度同源的重復(fù)單元中，這些單元包括了三個(gè)同源的片段(X、Y和Z盒)，其間被三個(gè)非同源區(qū)(I、II和III)所分隔(圖2A)(Higgs DR，1989)。當(dāng)減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體間的錯(cuò)配和不等交換，導(dǎo)致兩α間丟失3.7kb而產(chǎn)生α2-α1融合基因，記作-α3.7(Higgs DR，1989)。由于互換在右側(cè)α1基因上進(jìn)行，α3.7又稱右側(cè)缺失(Higgs DR，1984)。當(dāng)互換發(fā)生兩個(gè)X片段之間，結(jié)果產(chǎn)生缺失左側(cè)α2基因4.2kb的染色體，稱為左側(cè)缺失，記作-α4.2(Embury SH，1980)。
另外，在東南亞人群中發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)α珠蛋白基因完全缺失的情況，其缺失基因序列達(dá)20kb，記作--SEA(Nicholls RD，1985)。由于主要發(fā)生在東南亞人群中，又叫東南亞缺失。--SEA是我國南方最常見的缺失類型，其缺失范圍從α-珠蛋白基因簇的基因5’端到高變區(qū)(3’HVR)5’端上游1kb間，含ψα2、ψα1、α2、α1和θ1基因在內(nèi)的約20kb的大DNA片段。東南亞型(--SEA)，右側(cè)缺失(-α3.7)和左側(cè)缺失(-α4.2)在我國最常見。
早在1987年，Chehab等(Chehab FF，1987)即將PCR技術(shù)運(yùn)用于對(duì)Bart’s水腫胎兒的產(chǎn)前診斷。由于此法是憑陰性擴(kuò)增結(jié)果診斷--SEA突變，故產(chǎn)生假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)甚大。而Chang等(Chang JG，1991)提出的Gap-PCR技術(shù)則可克服這種缺陷。
運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)--SEA進(jìn)行基因檢測已很成熟，對(duì)于-α3.7和-α4.2兩種缺失型的檢測已日漸成熟?，F(xiàn)能夠用三個(gè)PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳方法快速準(zhǔn)確地檢測α-珠蛋白基因的三種缺失型。如能用一管多重PCR完成三項(xiàng)檢測，對(duì)于使用者無疑方便了許多。但由于α-珠蛋白基因G-C含量高達(dá)70％以上，其擴(kuò)增片段長，加之基因簇內(nèi)同源序列多，增加了實(shí)驗(yàn)難度。Shaji RV等人應(yīng)用多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測-α3.7、-α4.2和--SEA三種缺失，但其擴(kuò)增的片段太大，且PCR運(yùn)行時(shí)間長，效率也不高(Shaji RV，2000)。Samuel等也發(fā)表了他們運(yùn)用多重PCR技術(shù)同時(shí)篩查-α3.7、-α4.2、--SEA、--MED、-(α)20.5、以及--FIL六種缺失的研究論文(Samuel，2000)，這一多重PCR體系中包含多種引物，最多能擴(kuò)增出7條特異擴(kuò)增帶。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)中國人中最常見的三種缺失型α-地中海貧血的檢測問題，本發(fā)明提供了一種快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好的單管多重PCR檢測方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括對(duì)人基因組DNA待測樣品的PCR擴(kuò)增和對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。其特征在于采用7個(gè)(4對(duì))引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7組成四重PCR(表1)，分別檢測正常等位基因和缺失等位基因。該P(yáng)CR體系的引物設(shè)計(jì)方案包括該P(yáng)CR體系的引物設(shè)計(jì)方案為引物P1、P2可從-α3.7缺失的基因中擴(kuò)增2.0Kb的產(chǎn)物，引物P3、P4則可從-α4.2缺失的基因中擴(kuò)增1.6Kb的產(chǎn)物，引物P5、P6則可從東南亞缺失的基因中擴(kuò)增1.3Kb的產(chǎn)物。此外在三種缺失型的共同缺失區(qū)域內(nèi)使用了引物P7，使引物P1、P7可從正常等位基因(αα或αTα)擴(kuò)增1.8Kb的產(chǎn)物，而不能從三種缺失型的任何一種擴(kuò)增出產(chǎn)物。因此，引物A、B可同時(shí)作為所有這三種缺失型的內(nèi)對(duì)照。
表1檢測α-珠蛋白基因三種缺失型PCR引物序列

本發(fā)明的檢測方法其具體檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴(kuò)增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應(yīng)體系中，分別加入等濃度的7個(gè)PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’
P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’的混合貯存液7μl。
等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。
反應(yīng)緩沖液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蠟30μl。
加入人基因組DNA1μl，PCR反應(yīng)用酶1μl，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。
(2)電泳鑒定PCR產(chǎn)物取PCR產(chǎn)物10μl，加2μl電泳加樣緩沖液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果判定見表2。
表2缺失型α-地中海貧血基因檢測結(jié)果判斷

根據(jù)本發(fā)明所建立的缺失型α-地中海貧血檢測方法，不僅可同時(shí)檢測中國人常見的缺失型α-地中海貧血，而且有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。


圖1檢測α-珠蛋白基因三種缺失型PCR引物設(shè)計(jì)示意圖有字黑框代表a-珠蛋白基因簇中的5個(gè)連鎖的功能基因或假基因，即ψa2、ψa1、a2、a1、θ1。黑色條帶為每種缺失型相應(yīng)于a-珠蛋白基因簇的缺失區(qū)域。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施實(shí)例一檢測缺失型α-地中海貧血過程依次包括下列步驟(1)PCR擴(kuò)增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應(yīng)體系中，分別加入等濃度的7個(gè)PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3的混合貯存液7μl。
等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。
反應(yīng)緩沖液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蠟30μl。
加入人基因組DNA1μl，PCR反應(yīng)用酶1μl，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。
(2)電泳鑒定PCR產(chǎn)物取PCR產(chǎn)物10μl，加2μl電泳加樣緩沖液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結(jié)果。結(jié)果判定見表2。
實(shí)施實(shí)例二同時(shí)對(duì)多人DNA樣品進(jìn)行缺失型α-地中海貧血篩查的檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴(kuò)增在滅菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反應(yīng)體系中，分別加入等濃度的7個(gè)PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3的混合貯存液7μl。
等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。
反應(yīng)緩沖液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。
石蠟30μl。
加入多人(2-6人)基因組DNA混合物1μl(每人DNA量不得低于0.1μg)，PCR反應(yīng)用酶1μl，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。
(2)電泳鑒定PCR產(chǎn)物取PCR產(chǎn)物10μl，加2μl電泳加樣緩沖液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結(jié)果。如只出現(xiàn)一條1.8kb條帶，則所檢測的樣品均為正常人。如除出現(xiàn)一條1.8kb條帶外，還出現(xiàn)1.3kb或/和1.6kb或/和2.0kb，則所測樣品中有缺失型α-地中海貧血患者。應(yīng)按實(shí)施實(shí)例一的方法進(jìn)行確診。
權(quán)利要求
1.缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，包括對(duì)人基因DNA待測樣品的PCR擴(kuò)增和對(duì)經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，其特征在于采用7個(gè)(4對(duì))引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7組成四重PCR，該P(yáng)CR體系的引物設(shè)計(jì)方案為引物P1、P2可從-α3.7缺失的基因中擴(kuò)增2.0Kb的產(chǎn)物，引物P3、P4則可從-α4.2缺失的基因中擴(kuò)增1.6Kb的產(chǎn)物，引物P5、P6則可從東南亞缺失的基因中擴(kuò)增1.3Kb的產(chǎn)物。此外在三種缺失型的共同缺失區(qū)域內(nèi)使用了引物P7，使引物P1、P7可從正常等位基因(αα或α′α)擴(kuò)增1.8Kb的產(chǎn)物，而不能從三種缺失型的任何一種擴(kuò)增出產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，其特征在于其所采用的7條優(yōu)選引物序列為P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，其特征在于其檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴(kuò)增在滅菌的0.2或0.5ml Eppendoef管中，分別加入等體積等濃度的7個(gè)PCR引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7貯存液，引物濃度范圍為0.1-1.4μg/μl。等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP，dGTP。每種dNTP的濃度范圍為50-400μmol/L。反應(yīng)緩沖液為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。加入人基因組DNA，PCR反應(yīng)用酶，混勻。短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)。(2)電泳鑒定PCR產(chǎn)物通過電泳后凝膠上出現(xiàn)的熒光條帶的數(shù)目和不同的組合來分析判斷結(jié)果如出現(xiàn)引物P1、P2的擴(kuò)增產(chǎn)物2.0Kb條帶，則有-α3.7基因片段；如出現(xiàn)引物P3、P4的擴(kuò)增產(chǎn)物1.6Kb條帶，則有-α4.2基因片段；如出現(xiàn)引物P5、P6的擴(kuò)增產(chǎn)物1.3Kb條帶，則有--SEA基因片段。如出現(xiàn)引物P1、P7的擴(kuò)增產(chǎn)物1.8Kb條帶，則為正常等位基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的缺失型人α珠蛋白基因的多重PCR檢測方法，其特征在于其檢測過程依次包括下列步驟(1)PCR擴(kuò)增在滅菌的0.2或0.5ml Eppendoef管中，在25μl的反應(yīng)體系中，分別加入等濃度的7個(gè)PCR引物P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’的混合貯存液7μl。等濃度的四種脫氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合貯存液6μl。反應(yīng)緩沖液為10μl，其組分為20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/LMgCl2。石蠟30μl。加入人基因組DNA 1μl，PCR反應(yīng)用酶1μl，短暫離心后進(jìn)行PCR循環(huán)。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃5min；97℃45s，60℃75s，72℃150s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。(2)電泳鑒定PCR產(chǎn)物取PCR產(chǎn)物10μl，加2μl電泳加樣緩沖液，混勻。加入1.0％的瓊脂糖凝膠加樣孔中(其中含有0.6μg/mlEB染料)，6-8V/cm gel電泳約40min。在UVP或紫外燈下觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明提供一種缺失型人α－珠蛋白基因的PCR檢測方法，本發(fā)明采用7個(gè)(4對(duì))引物P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7組成四重PCR反應(yīng)，針對(duì)正常等位基因和中國人常見的缺失等位基因(－
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1626671SQ20031011255
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月10日
發(fā)明者李澤松, 耿永堯, 張文 申請人:深圳益生堂生物企業(yè)有限公司