專利名稱：人血紅蛋白(珠蛋白)α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬遺傳檢測(cè)領(lǐng)域，是用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因檢測(cè)的技術(shù)。
編碼血紅蛋白(珠蛋白)的α1基因或α2基因的缺失會(huì)引起α-地中海貧血癥(簡(jiǎn)稱地貧)。它在我國(guó)是一種常見(jiàn)病，發(fā)病率為2.64%，廣西的一些地區(qū)竟高達(dá)14.95%以上，目前尚無(wú)有效的根治方法，重癥患者需常年輸血，不僅本人十分痛苦，對(duì)家庭和社會(huì)也帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
α-地貧除少數(shù)是由α-基因的點(diǎn)突變引起外，多數(shù)是由α-基因的缺失所引起的。α-基因族有2個(gè)序列極為相似的α1和α2基因，二者之間只有7個(gè)核苷酸序列上的差異，它們?cè)诠δ苌鲜窍嗤?，都編碼α-珠蛋白分子，這二個(gè)基因的缺失或部分缺失，都會(huì)減少α-珠蛋白的合成。在正常人基因組中存在2個(gè)α1等位基因和2個(gè)α2等位基因。一般缺失一個(gè)α基因的患者表現(xiàn)為α-地貧2，貧血癥狀很輕或看不出癥狀;缺失2個(gè)α基因的患者表現(xiàn)為α-地貧1，貧血癥狀較重;缺失3個(gè)α基因的患者表現(xiàn)為HbH病，貧血癥狀嚴(yán)重，需常年輸血;缺4個(gè)α基因的胎兒表現(xiàn)為Bart′s水腫，不能成活。
目前應(yīng)用紅細(xì)胞形態(tài)觀察、血紅蛋白電泳分析對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因的缺失進(jìn)行分型檢測(cè)，也可用限制性內(nèi)切酶和α基因探針雜交等方法對(duì)α基因缺失情況進(jìn)行研究，這些方法或則操作技術(shù)復(fù)雜，或則難于掌握客觀標(biāo)準(zhǔn)。1987年以來(lái)，普遍采用設(shè)計(jì)在α基因族ψα1(α1假基因)基因內(nèi)的一對(duì)引物對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因或α2基因的缺失進(jìn)行PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerase chain Reaction)擴(kuò)增，如果α基因族包括α1和α2基因在內(nèi)的大片段缺失時(shí)，可獲得正確的檢測(cè)結(jié)果;如果缺失僅為α1和α2基因或者是α1或α2基因而不包括ψα1時(shí)，則獲得假陰性結(jié)果;如果缺失的僅為ψα1基因而α1和α2基因或者α1或α2基因并不缺失，則獲得假陽(yáng)性結(jié)果。所以這種PCR檢測(cè)方法具有很大的局限性，況且中國(guó)的α-地貧患者多為α1和α2基因或者是α1或α2基因缺失，應(yīng)用此法易于導(dǎo)致檢測(cè)錯(cuò)誤。
本發(fā)明的目的是建立一種操作簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)明確無(wú)誤的人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因的PCR基因分型檢測(cè)技術(shù)。
本發(fā)明用PCR擴(kuò)增技術(shù)，主要有引物合成、基因擴(kuò)增、顯示檢測(cè)主要步驟。發(fā)明設(shè)計(jì)了五種核苷酸引物，它們是αp15′d(CGG CTC TGC CCA GGT TAA GG)αp25′d(CCT TGG TCT GAG ACA GGT AAA CA)αp35′d(AGT GGG GCC GAG GGC CCA G)βp15′d(AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC)βp25′d(TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC)其中αp1和αp2引物擴(kuò)增Hbα1基因片斷278bP，αp1和αp2擴(kuò)增Hbα2基因片段603bp，βp1和βp2擴(kuò)增Hbβ基因片段400bP。五種引物分別形成三對(duì)，擴(kuò)增的片段具有明顯的特征。
引物αp1、αp2、αp1、βp1、βp2按上述的核苷酸排列順序，可以用化學(xué)方法合成。278bp、603bp、400bp的DNA片段可以用電泳法檢測(cè)。如用普通的瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段后用溴乙錠染色，在紫外光照射下的紅色熒光來(lái)檢測(cè)。
基因擴(kuò)增的試劑體系是可以在30-100μl的反應(yīng)體系中有10-50mM/L的Tris-HCl(PH＝8.1-8.5)，50mM/L的KCl，0.5-3.0mM/L的MgCl2，10-25mM/L的(NH4)2SO4，明膠200ug/ml，4-8%的甲酰胺，dNTP(A·G·C·T)各200-300μM/L，1-1.5U的耐熱DNA聚合酶，0.25-0.5μM/L的αp1，0.125-0.25μM/L，的αp2，0.125-0.25μM/L的αp1，0.125-0.25μM/L的βp1，0.125-0.25μM/L的βp2。
將上述試劑，除了耐熱DNA聚合酶以外，濃縮10倍，將引物按所需濃度配好，組成試劑盒，則使用更方便。
采用上述PCR反應(yīng)試劑體系，則PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶清晰明亮，沒(méi)有雜帶，易于鑒別。
擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，先將反應(yīng)體系混合打勻，可以高速離心30秒鐘，然后在90-93℃溫度下變性3-10分鐘，加酶，打勻，再離心;按90-93℃ 0.5-1分鐘、50-60℃ 0.5-1分鐘、68-72℃ 1-2分鐘作30-35個(gè)循環(huán);再在68-72℃溫度下保溫?cái)?shù)分鐘，取反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠板上電泳，紫外光照射下觀察電泳帶。使用Hybaid或FR-300PCR擴(kuò)增儀或恒溫水浴擴(kuò)增，采用的溫度和保溫時(shí)間在上述范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。
在該擴(kuò)增程序下擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳顯示檢測(cè)時(shí)泳帶清晰，靈敏度高，以正常人的血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物中，278bp、603bp、400bp三個(gè)基因片段的電泳帶之間的距離相等，很易識(shí)別。配上本發(fā)明的擴(kuò)增試劑體系和擴(kuò)增程序，這三條電泳帶清晰明亮，而且條帶的亮度相近。
參照βp1、βp2基因片段400bp的標(biāo)準(zhǔn)，如果受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因?yàn)棣?基因或α2基因缺失的雜合子，則它們?chǔ)?基因或α2基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的亮度僅為β基因擴(kuò)增產(chǎn)物400bp帶亮度的一半以下。
如受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因?yàn)棣?基因和α2基因缺失的純合子，則僅有β基因擴(kuò)增的產(chǎn)物400bp帶，而沒(méi)有αp1和αp3、αp1和αp2擴(kuò)增的278bp、603bp電泳帶。α基因族的兩個(gè)序列相似的α1基因和α2基因中若缺失1個(gè)α1基因或α2基因，則為雜合子，缺兩個(gè)等位α基因的為純合子。
若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失3個(gè)α基因，則α1基因或α2基因片斷擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶只有一條帶，其亮度為β帶亮度的一半以下;
若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失4個(gè)α基因，那么沒(méi)有α1基因和α2基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶。


圖1是顯示檢測(cè)的電泳圖，1是αp1和αp2擴(kuò)增的Hbα1基因片段278bp，2是αp1和αp2擴(kuò)增的Hbα2基因片段603bp，3是βp1和βp2擴(kuò)增的Hbβ基因片段400bp。圖中黑度表示電泳帶的亮度，行4是φX174(RF)-HaeⅢ的電泳帶，行5是血紅蛋白(珠蛋白)α基因無(wú)缺失的電泳帶，即正常人血紅蛋白(珠蛋白)α基因檢測(cè)的結(jié)果，行6是缺失一個(gè)α2基因的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因擴(kuò)增后的電泳帶，是α地貧2患者的檢測(cè)結(jié)果，行7是缺失兩個(gè)α基因(α1和α2)的DNA基因組擴(kuò)增后的電泳帶，這是α地貧1患者的檢測(cè)結(jié)果，行8是缺失3個(gè)α基因的DNA基因組擴(kuò)增后的電泳帶，這是HbH病人的檢測(cè)結(jié)果，行9是4個(gè)α基因都缺失的DNA基因組擴(kuò)增后的電泳帶，這是Bart′s水腫患者的檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明的引物順序明確，可用DNA合成儀自動(dòng)合成，在本研究領(lǐng)域中常規(guī)易行，引物擴(kuò)增的基因明確，配上本發(fā)明的擴(kuò)增試劑體系、擴(kuò)增程序和電泳檢測(cè)，使得顯示結(jié)果清晰無(wú)疑。
本發(fā)明不僅可以分別檢測(cè)α1基因和α2基因是否缺失，還可以對(duì)照比較正常人的內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確地判斷受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失是屬于α1基因和α2基因還是α1基因或α2基因缺失的純合子或雜合子?？煽康貙?duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α基因缺失進(jìn)行分型檢測(cè)，不會(huì)發(fā)生假陽(yáng)性或假陰性的失誤檢測(cè)。
本發(fā)明技術(shù)配上用本技術(shù)制成的檢測(cè)試劑盒，操作方便，檢測(cè)結(jié)果明確，無(wú)論是科學(xué)研究還是α基因缺失分型檢測(cè)都方便可靠。
圖1是人血紅蛋白(珠蛋白)α1基因和α2基因的PCR分型檢測(cè)電泳圖。
圖2是HbH病先征者家系的PCR基因分型檢測(cè)圖。
實(shí)施例在50ul體系中，含有10mM/L Tris-HCl(PH＝8.5)，50mM/L KCl，2mM/L MgCl2，10mM(NH4)2SO4，明膠200μg/ml，甲酰胺8%，dNTP各200μM/L，0.25μM/L的αp1，0.125μM/L的αp2，0.125μM/L的αp1，0.125μM/L的βp1，0.125μM/L的βp2，人染色體DNA約0.5μg，用30μl液蠟復(fù)蓋液面。將反應(yīng)體系混合打勻，高速離心30秒，恒溫水浴93℃1分鐘，加入DNA聚合酶1U，打勻，離心，然后恒溫水浴93℃1分鐘、55℃1分鐘、68℃2分鐘，依次進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后再72℃保溫5分鐘，取20μl反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml EB)板上電泳，紫外光下觀察電泳帶。
該受檢者為HbH病先征者家系的PCR基因分型檢測(cè)例，觀察到的電泳帶結(jié)果如圖2。該圖中第6行(先征者的父親)中第2條電泳帶即αp1和αp2擴(kuò)增Hbα2基因片斷603bp帶的亮度僅為第3條β帶的亮度的一半以下，可以斷定父親是α2基因缺失的雜合子，父親患的是α地2癥。第7行是先征者母親的受檢結(jié)果，可以看到第1和第2電泳帶的亮度都為第3條β帶的亮度的一半以下，可以斷定母親缺失α1和α2兩個(gè)α基因(α1和α2均為雜合子)，因而患α地1癥。先征者本人的電泳條帶見(jiàn)第8行，其α2(603bp)電泳帶全無(wú)，α1(278bp)電泳帶的亮度僅為β(400bp)電泳帶亮度的一半以下，可斷定其缺失三個(gè)α基因，患HbH癥。
權(quán)利要求
1.一種用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴(kuò)增技術(shù)，它的內(nèi)容由引物合成、基因擴(kuò)增、顯示檢測(cè)三部分組成，其特征在于(1)基因擴(kuò)增的核苷酸引物及其順序?yàn)棣罰15′d(CGG CTC TGC CCA GGT TAA GG)αP25′d(CCT TGG TCT GAG ACA GGT AAA CA)αP15′d(AGT GGG GCC GAG GGC CCA G)βP15′d(AAG GAG ACC AAT AGA AAC TGG GC)βP25′d(TCT CCC CTT CCT ATG ACA TGA AC)(2)引物αP1和αP2擴(kuò)增Hbα1基因278bP，αP1和αP2擴(kuò)增Hbα2基因片段603bP，βP1和βP2擴(kuò)增Hbβ基因片段400bP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴(kuò)增技術(shù)，其特征在于基因擴(kuò)增試劑體系是在30-100μl反應(yīng)體系中含有Tris-Hcl10-50mM/L(PH＝8.1-8.5);KCl50mM/L;Mgcl20.5-3.0mM/L;(NH4)2SO410-25mM/L;明膠200ug/ml;甲酰胺4-8%;dNTP(A·G·C·T)各200-300mM/L;耐熱DNA聚合酶1-1.5U;αp10.25-0.50mM/L;αp20.125-0.25mM/L;αp10.125-0.25mM/L;βp10.125-0.25mM/L;βp10.125-0.25mM/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴(kuò)增技術(shù)，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)的程序是(1)90-93℃變性3-10分鐘，加酶打勻，離心;(2)按90-93℃ 0.5-1分鐘，50-60℃ 0.5-1分鐘，68-72℃ 1-2分鐘，作30-35個(gè)循環(huán);(3)68-72℃保溫?cái)?shù)分鐘后，取反應(yīng)產(chǎn)物在含有EB的瓊脂糖凝膠板上電泳，紫外光下觀察電泳帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α基因的擴(kuò)增技術(shù)、其特征在于(1)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因?yàn)棣?基因或α2基因缺失的雜合子，則其α1基因或α2基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶的亮度僅為血紅蛋白β基因電泳帶的亮度一半以下;(2)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因?yàn)棣?基因或α2基因缺失的純合子，則擴(kuò)增產(chǎn)物電泳時(shí)僅有β基因帶，沒(méi)有α1基因帶或α2基因帶;(3)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因中缺失3個(gè)α基因、則α1基因或α2基因片斷擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶只有一條，而且其亮度只有β電泳帶亮度的一半以下;(4)若受檢的人血紅蛋白(珠蛋白)α基因中缺失4個(gè)α基因，則沒(méi)有α1基因或α2基因片斷擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳帶。
全文摘要
一種遺傳檢測(cè)方法，利用DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，對(duì)人血紅蛋白(珠蛋白)α
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1065094SQ92108379
公開(kāi)日1992年10月7日 申請(qǐng)日期1992年4月14日 優(yōu)先權(quán)日1992年4月14日
發(fā)明者毛裕民, 楊樹(shù)青, 王先敏 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)