專利名稱：一種篩選抗真菌抗腫瘤活性物質(zhì)微生物菌株的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選抗真菌抗腫瘤活性物質(zhì)微生物菌株的新方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物、植物、微生物是生物制藥的三大資源，由于動(dòng)物、植物的野生資源有限，人工養(yǎng)殖和種植成本較高，與其相比，微生物以資源豐富，種類繁多，繁殖周期短，可通過發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)，成為生物制藥尤其是抗生素的主要資源。微生物產(chǎn)生的各種類型的代謝產(chǎn)物不但可能隨種類不同而不同，而且隨同種微生物生長的環(huán)境而變化，即不同的菌株就可能產(chǎn)生不同的化合物，而微生物一個(gè)種的菌株就是無數(shù)的，面對(duì)如此大量的微生物，藥用微生物的篩選方法特別是初篩方法就變得格外重要，操作簡便、速度快、用量少且相關(guān)性好的篩選模型是提高篩選機(jī)率的關(guān)鍵措施。
近年來有關(guān)專家發(fā)現(xiàn)，一些抗真菌、抗細(xì)胞有絲分裂的化合物可以引起特定的真菌如稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)的分生孢子和芽管在生長過程中形態(tài)發(fā)生改變，即通過觀察稻瘟霉分生孢子形態(tài)變化作為篩選微生物菌株的指示或指標(biāo)，由此方法篩選的微生物產(chǎn)生的化合物，不僅對(duì)真菌有抑制作用，而且由于其作用表現(xiàn)在抑制真核生物微管形成，已知的微管抑制劑不少又是抑癌抗生素，因此這一篩選方法選出的菌株產(chǎn)生的化合物可作為抗真菌和腫瘤初選菌株。該篩選方法不需要復(fù)雜的設(shè)備與技術(shù)，篩選用指示菌稻瘟霉對(duì)所試化合物反應(yīng)尚敏感，形態(tài)變異的孢子、芽管可以通過顯微鏡直接觀察，較以往的動(dòng)物活細(xì)胞篩選方法，成本較低，較簡單。日本學(xué)者kobayashi H等人用此方法成功的篩選到多種抗真菌、抗細(xì)胞有絲分裂的化合物，其中化合物rhizoxin等已開發(fā)成抗腫瘤、抗真菌新藥。
已有稻瘟霉篩選方法是利用引起水稻病害的植物病原菌稻瘟霉菌作指示菌，其篩選方法需先將欲篩選的細(xì)菌、放線菌、真菌(應(yīng)先離心去除菌絲體)發(fā)酵液用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液；再將10ml稻瘟霉孢子懸浮液與300μl沙氏液體培養(yǎng)基混合，以每孔50μl的量加入到96孔板的各孔中；然后分別在96孔板的第一行加入各篩選菌株的無細(xì)胞濾液50μL，每列從第一行開始依次倍半稀釋到最后1孔，對(duì)照列孔內(nèi)加50μL無菌水；再將其置于溫箱中27℃培養(yǎng)16h；最后在倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)生長的形態(tài)，根據(jù)kobayashi H等人制定的活性指標(biāo)(孢子正常萌發(fā)為沒有抑制活性，用“-”表示；孢子萌發(fā)，但孢子絲比對(duì)照短，有輕微抑制作用，用“+”表示；孢子萌發(fā)，但芽管很短，有較強(qiáng)抑制作用，用“++”表示；孢子不能萌發(fā)并嚴(yán)重變形，有強(qiáng)烈抑制作用，用“+++”表示；孢子完全不萌發(fā)與培養(yǎng)前相同，生長受到抑制作用，用“×”表示)判斷篩選菌株是否有活性和活性的強(qiáng)弱，選出活性強(qiáng)的菌株。
在這一篩選方法中，作為指示菌的稻瘟霉菌，其在篩選中培養(yǎng)物中孢子量的多少，孢子的新鮮程度(培養(yǎng)7-10天效果最佳)直接影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，為了獲得新鮮的分生孢子，篩選試驗(yàn)中需要不斷在其生長的PDA培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟霉菌有一致命的缺點(diǎn)，其產(chǎn)孢量隨傳代接種很快降低，一般在PDA培養(yǎng)基上傳代接種5次左右，孢子量就減少的不能再用，再復(fù)壯恢復(fù)產(chǎn)孢功能需要較長的時(shí)間，影響試驗(yàn)進(jìn)度。而且稻瘟霉菌的分生孢子幾乎無色，在顯微鏡下觀察不易發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
研究表明作為篩選方法中的指示菌的選擇極為重要，本發(fā)明是把引起蕃茄病害的植物病原菌—茄交鏈孢霉菌作為指示菌，依此作為本篩選方法的基礎(chǔ)和新應(yīng)用。
本發(fā)明是采用茄交鏈孢霉菌(Alternaria solani)為指示菌的篩選方法，也可以說以茄交鏈孢霉菌作為在篩選方法的新應(yīng)用；經(jīng)過大量的試驗(yàn)證明，凡是能引起稻瘟霉菌分生孢子形態(tài)變異的化合物，都能引起茄交鏈孢菌分生孢子的形態(tài)變異。且該菌分生孢子的個(gè)體較大，是稻瘟霉菌分生孢子體積的一倍左右，茄交鏈孢霉菌分生孢子有黑到褐色色素，非常容易觀察，其萌發(fā)只有稻瘟霉菌分生孢子萌發(fā)時(shí)間的十分之一左右。茄交鏈孢霉菌產(chǎn)孢量多，菌體產(chǎn)孢功能很穩(wěn)定，在PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代接種對(duì)其影響不大，與前述的已有篩選方法的主要區(qū)別是勿須加沙氏液體培養(yǎng)基，而且在溫箱中27℃僅需培養(yǎng)2小時(shí)。因此用茄交鏈孢霉篩選方法，成本更低，更容易觀察、速度更快。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的茄交鏈孢霉篩選方法如下1先將需要篩選的的細(xì)菌、放線菌、真菌(先離心去除菌絲體)發(fā)酵液用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液；2再將10ml茄交鏈孢霉孢子懸浮液，以每孔50μl的量加入到96孔板的各孔中；3分別在96孔板的第一行加入各篩選菌株的無細(xì)胞濾液50μL，每列從第一行開始依次倍半稀釋到最后1孔，對(duì)照列孔內(nèi)加50μL無菌水；4置溫箱中27℃培養(yǎng)2h；5在倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)生長的形態(tài)，根據(jù)上述活性指標(biāo)，判斷篩選菌株是否有活性和活性強(qiáng)弱；依此選出活性強(qiáng)的菌株。
兩種篩選方法比較研究證明已有方法用的指示菌稻瘟霉菌孢子的平均尺度為22.1×8.7μ，分生孢子幾乎無色素，在顯微鏡下較難觀察，篩選時(shí)，每觀察1個(gè)孔大約需要2分鐘，觀察1個(gè)96孔板大約需要192分鐘；本發(fā)明用的指示菌茄交鏈孢霉菌的平均尺度為47.6×19.5μ，體積是前者的1倍左右，而且由于茄交鏈孢霉菌分生孢子有黑到褐色色素，非常容易觀察，每觀察1個(gè)孔大約只需要1分鐘，觀察1個(gè)96孔板約需96分鐘，篩選中此項(xiàng)速度提高1倍。
另外用指示菌稻瘟霉菌篩選時(shí)孢子萌發(fā)需要加沙氏培養(yǎng)液，80％以上孢子萌發(fā)需12-16小時(shí)，篩選時(shí)96孔板點(diǎn)樣后需要等16小時(shí)后方可觀察，本發(fā)明的指示菌茄交鏈孢霉菌，孢子萌發(fā)不需要加沙氏培養(yǎng)液，80％以上孢子萌發(fā)需1-2小時(shí)，篩選時(shí)96孔板點(diǎn)樣后只需要等2小時(shí)即可觀察，新篩選方法此項(xiàng)速度比原有方法提高8倍。
已有的篩選方法指示菌稻瘟霉菌不能連續(xù)使用，這是因?yàn)槠滏咦用總鞔囵B(yǎng)1次(8-10天)，產(chǎn)孢量降低的幅度較大(大約降低20％左右)，到第5代(40-50天)，其產(chǎn)孢量已不能維持觀察形態(tài)試驗(yàn)，只能進(jìn)行菌株復(fù)壯，菌株復(fù)壯大約需要15-20天左右時(shí)間，而選用茄交鏈孢霉分生孢子可連續(xù)使用，節(jié)省了大量的時(shí)間。
本發(fā)明的篩選方法比原方法更快，更容易操作。
實(shí)施例1陸地微生物菌株的篩選1先將需要篩選的的細(xì)菌、放線菌、真菌分別通過常規(guī)方法在三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)，真菌、放線菌發(fā)酵液需先離心去除菌絲體，上清液用0.221μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液，細(xì)菌發(fā)酵液直接用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液；2再將在PDA固體斜面培養(yǎng)基上生長7天左右的茄交鏈孢霉菌，每支菌株加入10ml左右無菌水配制成分生孢子懸浮液(＜100個(gè)孢子/ml)，以每孔50μl的量加入到96孔板的各孔中；3分別在96孔板的第一行加入各篩選菌株的無細(xì)胞濾液50μL，每列從第一行開始依次倍半稀釋到最后1孔，每1列第1孔的最小抑制濃度(MIC)為500μL/mL，依次稀釋的第2孔至第8孔的濃度分別為250、125、63、32、16、8、4μL/mL。對(duì)照列用同樣方法加入無菌水；4置溫箱中27℃培養(yǎng)2h后，在倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)生長的形態(tài)，根據(jù)上述活性指標(biāo)，判斷篩選菌株是否有活性和活性強(qiáng)弱，選擇至少在第4個(gè)孔活性指標(biāo)還能達(dá)到“+++”的菌株。
實(shí)施例2海洋微生物菌株的篩選1先將需要篩選的海洋細(xì)菌、放線菌、真菌分別進(jìn)行低鹽馴化培養(yǎng)，然后用海洋微生物常規(guī)培養(yǎng)方法在三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)，液體發(fā)酵時(shí)NaCl濃度不能超過1％，真菌、放線菌發(fā)酵液需先離心去除菌絲體，上清液用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液，細(xì)菌發(fā)酵液直接用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液；2再將在固體PDA斜面培養(yǎng)基上生長7天左右的茄交鏈孢霉菌，每支菌株加入10ml左右無菌水配制成分生孢子懸浮液(＜100個(gè)孢子/ml)，以每孔50μl的量加入到96孔板的各孔中；3分別在96孔板的第一行加入各篩選菌株的無細(xì)胞濾液50μL，每列從第一行開始依次倍半稀釋到最后1孔，每1列第1孔的最小抑制濃度(MIC)為500μL/mL，依次稀釋的第2孔至第8孔的濃度分別為250、125、63、32、16、8、4μL/mL。對(duì)照列用同樣方法加入無菌水；4置溫箱中27℃培養(yǎng)2h后，在倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)生長的形態(tài)，根據(jù)上述活性指標(biāo)判斷篩選菌株是否有活性和活性強(qiáng)弱，選擇至少在第4個(gè)孔活性指標(biāo)還能達(dá)到“+++”的菌株。
權(quán)利要求
1.一種篩選抗真菌抗腫瘤活性物質(zhì)微生物菌株的新方法，1先將需要篩選的的細(xì)菌、放線菌、真菌(先離心去除菌絲體)發(fā)酵液用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液；2再將10ml茄交鏈孢霉孢子懸浮液，以每孔50μl的量加入到96孔板的各孔中；3分別在96孔板的第一行加入各篩選菌株的無細(xì)胞濾液50μL，每列從第一行開始依次倍半稀釋到最后1孔，對(duì)照列孔內(nèi)加50μL無菌水；4置溫箱中27℃培養(yǎng)2h；5在倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)生長的形態(tài)，根據(jù)已有活性指標(biāo)，判斷篩選菌株是否有活性和活性強(qiáng)弱；依此選出活性強(qiáng)的菌株。
2.一種篩選抗真菌、抗腫瘤活性物質(zhì)微生物菌株的新方法，是以茄交鏈孢霉菌作為篩選方法中的指示菌。
全文摘要
一種篩選抗真菌抗腫瘤活性物質(zhì)微生物菌株的新方法，先將需要篩選的的細(xì)菌、放線菌、真菌發(fā)酵液用0.22μm無菌濾膜過濾得無細(xì)胞濾液；再將10ml茄交鏈孢霉孢子懸浮液，以每孔50μl的量加入到96孔板的各孔中；分別在96孔板的第一行加入各篩選菌株的無細(xì)胞濾液50μL，每列從第一行開始依次倍半稀釋到最后1孔，對(duì)照列孔內(nèi)加50μL無菌水；置溫箱中27℃培養(yǎng)2h；在倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)生長的形態(tài)，根據(jù)已有的活性指標(biāo)，判斷篩選菌株是否有活性和活性強(qiáng)弱；依此選出活性強(qiáng)的菌株。本發(fā)明的篩選方法以茄交鏈孢霉菌作為指示菌。篩選所用的成本更低，更容易操作、觀察，篩選速度更快。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK1557963SQ200410023529
公開日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月15日
發(fā)明者田黎, 裴月湖, 陳靠山, 田 黎 申請(qǐng)人:國家海洋局第一海洋研究所