專(zhuān)利名稱(chēng)：南京椴3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶a還原酶蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在南京椴中表達(dá)的tm-Hmgr蛋白(南京椴3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶蛋白，Tilia miqucliana 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase，TMHMGR)及其核酸序列。
背景技術(shù)：
南京椴(Tilia miqueliana Maxim)俗稱(chēng)菩提樹(shù)，屬椴樹(shù)科椴樹(shù)屬，產(chǎn)于華東各省、湖南東部、廣東，生于山坡、山溝林中。南京椴屬落葉喬木，樹(shù)干通直，材質(zhì)好，生長(zhǎng)慢，壽命長(zhǎng)。其樹(shù)葉美麗，樹(shù)姿清幽，夏日黃花滿(mǎn)樹(shù)，芳香馥郁，為著名的綠蔭樹(shù)種和優(yōu)良的蜜源植物。椴樹(shù)植物在西方是很著名的草藥，在民間作為藥茶飲用，具有利尿、健胃、治療神經(jīng)痛和鎮(zhèn)定等功能，含有多種活性物質(zhì)。我們?cè)谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)南京椴含有多種天然活性成分，其中包括萜類(lèi)化合物，許多萜類(lèi)化合物具有很好的藥理活性，是中藥的主要成分。南京椴目前資源越來(lái)越貧乏，但其潛在經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值是巨大的。
近年來(lái)，對(duì)許多植物材料的萜類(lèi)化合物次生代謝的研究證明，HMGR是甲羥戊酸途徑中一個(gè)關(guān)鍵酶。在甲羥戊酸途徑中3-羥基-3-甲基戊二酸單酰CoA(HMGCoA)在HMGR的作用下生成甲羥戊酸(MVA)。由于該反應(yīng)是一個(gè)不可逆過(guò)程，因此HMGR被認(rèn)為是該途徑中第一個(gè)限速酶。通過(guò)提高3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活性或含量，可以間接的提高南京椴中萜類(lèi)化合物次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量。近代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，萜類(lèi)化合物次生代謝產(chǎn)物是天然活性物質(zhì)，是解決目前世界面臨的西藥毒副作用大，癌癥、艾滋病等疑難疾病無(wú)法醫(yī)治等難題的一條新途徑。
在對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析中，“Plant Cell(植物細(xì)胞)，1992，4(10)1333-1344”報(bào)道了從馬鈴薯中克隆了3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因，NCBI網(wǎng)站上公布了橡膠樹(shù)等的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶還原酶基因的序列。但至今尚未有南京椴tm-Hmgr蛋白序列及其核酸序列報(bào)道。
在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)或報(bào)道過(guò)本專(zhuān)利申請(qǐng)中提及的南京椴tm-Hmgr蛋白序列及其核酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列。使其包含所說(shuō)基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說(shuō)基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物將具有顯著提高的萜類(lèi)化合物次生代謝產(chǎn)物含量。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ IDNO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列雜交。
較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本發(fā)明所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述載體。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是煙草。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“南京椴tm-Hmgr蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第131-1888位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第131-1888位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中第131-1888位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的南京椴tm-Hmgr蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為30個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，最佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“南京椴tm-Hmgr蛋白或多肽”指具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然南京椴tm-Hmgr蛋白相同功能的SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括南京椴tm-Hmgr蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與南京椴tm-Hmgr蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用南京椴tm-Hmgr蛋白多肽的血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“南京椴tm-Hmgr蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1

表285％ identity in 910nt overlapQuery207 attccaccaaagcctccgacgcactacctcctcctttgtatataatgaatgcggtgttct 266||||||||||||| || |||||| | || | |||||||||| ||| |||||| |||||||
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Sbjct1725 tttttaacag 173490％ identity in 350nt overlapQuery1298 ggaaacttctgttcggacaaaaagccagctgcagtaaattggattgaaggacgtggcaaa 1357|||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||||Sbjct2364 ggaaacttctgttccgacaaaaagccagctgcagtaaattggattgaaggccgaggcaaa 2423Query1358 tctgttgtctgcgaggccatcattaaggatgatgtggtgaggaaggtcttgaagactggt 1417||||| ||||| |||||||||||||| | |||||| |||| ||||||||||||||| ||Sbjct2424 tctgtcgtctgtgaggccatcattaatggtgatgtagtgacgaaggtcttgaagacaagt 2483Query1418 gtggaatctctcgtggagcttaacatgcttaagaaccttactggatctgctatggctgga 1477|| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||||Sbjct2484 gtagaatctctcgtggagcttaacatgcttaagaaccttactggttctgccatggctgga 2543Query1478 gctctgggtggatttaatgcctatgccggtaacattgtgtctgctgtctacatagctacc 1537|||||||||||||||||||| ||||| |||||||||| |||||||||| ||||| ||Sbjct2544 gctctgggtggatttaatgctcatgccagtaacattgtcactgctgtctatatagccact 2603Query1538 ggtcaagatccggctcaaaatgtcgagagctctcattgcataacgatgatggaagctgtt 1597|| |||||||| || |||||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||Sbjct2604 ggccaagatcctgcccaaaatgtcgagagctctcattgcatcaccatgatggaagctgtt 2663Query1598 aatgatggcaaggaccttcacatctctgttacaatgccttccatcgaggt 1647|||| |||||||||||||| ||||||| |||||||||||||| |||||Sbjct2664 aatggcggcaaggaccttcatgtctctgtcacaatgccttccattgaggt 271388％ identity in 244nt overlapQuery1644 aggttggcactgttggtggtggaactcagcttgcatctcagtcagcgtgtttgaacctgc 1703||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || ||||| ||||||||||| |
Sbjct3553 aggttggcactgttggtggtggaactcagcttgcatcacaatcagcttgtttgaaccttc 3612Query1704 tcggtgtcaagggtgcaagcaaagaatcacctggagaaaactctagaatgcttgcaacca 1763| |||||||||||||||||||||||||| ||||||| |||||| | | | ||||| || |Sbjct3613 ttggtgtcaagggtgcaagcaaagaatcccctggagcaaactcaatactccttgcgacta 3672Query1764 ttgtagccggtgctgtccttgctggggagctgtcactcatgtctgcacttgcagctgggc 1823| |||||||||||||||||||| || ||||||||||| ||||| |||||||| || ||||Sbjct3673 tcgtagccggtgctgtccttgccggcgagctgtcactgatgtcagcacttgctgccgggc 3732Query1824 aactaattaacagccatatgaagtacaataggtcaaataaggacgtgtccaaggcttctt 1883||||| | || ||||||||||||||||||||||| | ||||| || ||||||| |||||Sbjct3733 aactagtgaaaagccatatgaagtacaataggtctagcaaggatgtttccaaggtttctt 3792Query1884 ccta 1887||||Sbjct3793 ccta 379691％ identity in 183nt overlapQuery1114 cagatcaagtagatttgctaggcttcaaggtatcaaatgtgcaattgctgggaagaatct 1173||||||||| |||||||||||||||||| | ||||||||||||||||| |||||||||||Sbjct1829 cagatcaagcagatttgctaggcttcaaagcatcaaatgtgcaattgcagggaagaatct 1888Query1174 ctatttgagattcacttgcagtactggtgatgctatggggatgaacatggtttccaaggg 1233||||| |||||| | ||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1889 gtatttaagattctcatgctttactggtgatgctatggggatgaacatggtttccaaggg 1948Query1234 agtccaaaacgtattggatttccttcaaactgatttctctgacatggatgtcattggcat 1293||| |||||||| || |||||||||||||| |||||| ||||||||||||||||||||||Sbjct1949 agttcaaaacgttttagatttccttcaaaccgatttccctgacatggatgtcattggcat 2008Query1294 ctc 1296|||Sbjct2009 ctc 201196％ identity in 30nt overlapQuery1983 catcatctctttgtaataagctaagtagac 2012||||||||||| ||||||||||||||||||Sbjct3877 catcatctcttagtaataagctaagtagac 3906Query南京椴tm-Hmgr的核酸序列
Sbjct陸地棉gh-Hmgr1的核酸序列(AF038045.1)表2為本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr與陸地棉(upland cotton)gh-Hmgr1的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表383％ identity in 585 aa overlap，87％ similarity in 585 aa overlapQuery1 MEARRRSSTKPIQSLKTTKTVSLEENSTKASDALPPPLYIMNAVFFTLFFSVVYFLLSRW 60ME RRSST I+S K + ++LE++STKASDALP PLY+ NAVFFTLFFS VYFLL RWSbjct1 METHRRSSTNSIRSHKPARPIALEDDSTKASDALPLPLYLTNAVFFTLFFSAVYFLLCRW 60Query61 REKIRISTPLHIVTFSEIVAVLALVASFIYLLGFFGIDFVQSLILRPSTDIWNSXXXXXX 120REKIR STPLH+VTFSEIVA+LA VASFIYLLGFFGIDFVQSL+LRPS D+W +Sbjct61 REKIRSSTPLHVVTFSEIVAILASVASFIYLLGFFGIDFVQSLVLRPSADVWATEDDEVE 120Query121 XXVLLRKEDSRKVPCGQALDCSFPPLPPSAPIVTAQKVFXXXXXXXXXXXXXXXXXSVVA 180VLLR ED+R VPCGQALD S L P PIVTA+KVF SVVSbjct121 SEVLLRNEDARHVPCGQALDRSIRSLQPPEPIVTAEKVFDEMPVTVMTEEDEEIIRSVVC 180Query181 GTTPSYSLESKLGDCKRATAIRREALQRLTGKSLSGLPLDGFDYASILGQCCEMPVGYVQ 240G TPSYSLESKL DCKRA AIRREALQR+TGKSLSGLPLDGFDY SILGQCCEMPVGY QSbjct181 GMTPSYSLESKLDDCKRAAAIRREALQRITGKSLSGLPLDGFDYESILGQCCEMPVGYEQ 240Query241 IPVGIAGPLLLNGREYTVPMATTEGTLVASTNRGCKAIHLSGGATSVLLKDGMTRAPVVR 300IPVGIAGPLLLNGREY+VPMATTEG LVASTNRGCKAIHLSGGATSVLL+DGMTRAPVVRSbjct241 IPVGIAGPLLLNGREYSVPMATTEGCLVASTNRGCKAIHLSGGATSVLLRDGMTRAPVVR 300Query301 FSTAKRAADLKFYLEDPENFETLAVVFNRSSRFARLGGIKCAIAGKNLYLRFTCSTGDAM 360F TAKRAADLK YLEDPENFETLA VFNRSSRFARLQ IKCAIAGKNLYLRF+C TGDAMSbjct301 FGTAKRAADLKLYLEDPENFETLACVFNRSSRFARLQSIKCAIAGKNLYLRFSCFTGDAM 360Query361 GMNMVSKGVQNVLDFLQTDFSDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIIKDD 420GMNMVSKGVQNVLDFLQTDF DMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAII DSbjct361 GMNMVSKGVQNVLDFLQTDFPDMDVIGISGNFCSDKKPAAVNWIEGRGKSVVCEAIINGD 420Query421 VVRKVLKTGVESLVELNMLKNLTGSAMAGALGGFNAYAGNIVSAVYIATGQDPAQNVESS 480VV KVLKT VESLVELNMLKNLTGSAMAGALGGFNA+A NIV+AVYIATGQDPAQNVESSSbjct421 VVTKVLKTSVESLVELNMLKNLTGSAMAGALGGFNAHASNIVTAVYIATGQDPAQNVESS 480Query481 HCITMMEAVNDGKDLHISVTMPSIEVGTVGGGTQLASQSACLNLLGVKGASKESPGENSR 540HCITMMEAVN GKDLH+SVTMPSIEVGTVGGGTGLASQSACLNLLGVKGASKESPG NSSbjct481 HCITMMEAVNGGKDLHVSVTMPSIEVGTVGGGTGLASQSACLNLLGVKGASKESPGANSI 540
Query541 MLATIVAGAVLAGELSLMSALAAGQLINSHMKYNRSNKDVSKASS 585+LATIVAGAVLAGELSLMSALAAGQL+ SHMKYNRS+KDVSK SSSbjct541 LLATIVAGAVLAGELSLMSALAAGQLVKSHMKYNRSSKDVSKVSS 585Query南京椴tm-Hmgr氨基酸序列Sbjct陸地棉gh-Hmgr1氨基酸序列(GenBank Accession No.AAC05088.1)表3為本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白的氨基酸序列與陸地棉gh-Hmgr1的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明還包括南京椴tm-Hmgr蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽時(shí)，可以將南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成南京椴tm-Hmgr蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線(xiàn)性DNA序列的某些部分能夠影響同一線(xiàn)性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析南京椴tm-Hmgr蛋白基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析南京椴tm-Hmgr蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明中可用作探針的核酸分子，該分子通常具有南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼南京椴tm-Hmgr蛋白的核酸分子。
本發(fā)明涉及檢測(cè)樣品中是否存在南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選南京椴tm-Hmgr蛋白同源基因或同源蛋白。
為了得到與南京椴tm-Hmgr蛋白基因相關(guān)的杜仲cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選南京椴cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)南京椴tm-Hmgr蛋白的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自南京椴的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與南京椴tm-Hmgr蛋白的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
利用本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與南京椴tm-Hmgr蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發(fā)明的南京椴tm-Hmgr蛋白基因可通過(guò)基因工程技術(shù)用來(lái)提高南京椴中萜類(lèi)化合物次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量，而這些次生代謝產(chǎn)物在臨床上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)有所幫助。因而本發(fā)明具有很大的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室具體的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1南京椴tm-Hmgr蛋白基因的克隆1.組織分離(isolation)南京椴幼嫩葉片來(lái)源于江蘇省藥用植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，采取材料后，立即置于液氮中冷凍保存。
2.RNA的分離(RNA isolation)
取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。
3.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)一些植物Hmgr的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)兼并引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)3’-RACEPCR(UPM+F2)得到TMF2’(936bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知的陸地棉(Gossypiumhirsutum)等的Hmgr基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)Hmgr基因。
(2)5’-RACE根據(jù)3’RACE結(jié)果，設(shè)計(jì)反向特異引物R2，經(jīng)PCR(UPM+R2)得到TMR2’(1358bp)(過(guò)程同(1))?；厥?，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。
(3)將5’RACE測(cè)序結(jié)果與3’RACE測(cè)序結(jié)果比序并進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)片段序列信息，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增tm-Hmgr編碼區(qū)(DF1+DR1)得到tm-Hmgr編碼區(qū)(1758bp)(過(guò)程同(1)。
BLAST的結(jié)果證明從南京椴中新得到的基因確為一個(gè)植物Hmgr基因。通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的南京椴TmHMGR的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物TmHMGRF15’-ACTCAACCCCCGAAAACCG-3’(SEQ ID NO.1)為正向引物，寡核苷酸TmHMGRR15’-ACAATTCTGTCATTTTACC-3’(SEQ ID NO.2)為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，TmHMGRF1/TmHMGRR2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2107bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQ ID NO.3所示的序列。
實(shí)施例2南京椴tm-Hmgr蛋白基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的南京椴tm-Hmgr蛋白全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為2160bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.3，其中開(kāi)放讀框位于131-1888位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出南京椴tm-Hmgr蛋白的氨基酸序列，共585個(gè)氨基酸殘基，分子量62956.49，pI為6.11。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQ ID NO.4。
將南京椴tm-Hmgr蛋白的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redunoant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與陸地棉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1基因(AF038045.1)在核苷酸水平上具有較高的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它與陸地棉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1(GenBank Accession No.AAC05088.1)有78％的相同性和86％的相似性(見(jiàn)表3)。由此可見(jiàn)，南京椴tm-Hmgr蛋白與陸地棉3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶1無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認(rèn)為南京椴tm-Hmgr蛋白在功能上也相似。
實(shí)施例3南京椴tm-Hmgr蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)及提純?cè)谠搶?shí)施例中，將全長(zhǎng)的南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
將南京椴tm-Hmgr蛋白多肽以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)南京椴tm-Hmgr蛋白的氨基酸序列，設(shè)計(jì)蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pET32a(+)載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將南京椴tm-Hmgr蛋白基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pET32a(+)載體(Novagen)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，篩選鑒定得到含有pET32a(+)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶表達(dá)載體的工程菌BL22-pET32a(+)-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶。
表達(dá)Trx-tm-Hmgr重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的BL21-pET32a(+)-eu-Hmgr工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)Trx-3-tm-Hmgr融合蛋白的工程菌。
Trx-3-tm-Hmgr融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)Trx-tm-Hmgr融合表達(dá)蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-tm-Hmgr，經(jīng)離心沉淀收集菌體，并根據(jù)廠家(Novagen)的說(shuō)明書(shū)以BugBuster試劑和Benzonase核酸酶來(lái)純化包涵體。包涵體可用溶解緩沖液(50mM CAPS，pH11.0，0.3％ N-lauroylsarcosine)來(lái)溶解，再用透析緩沖液(200mM Tris-HCl，pH8.5)來(lái)透析。然后用組氨酸結(jié)合(His·Bind)樹(shù)脂進(jìn)行親和層析，并經(jīng)洗脫緩沖液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH7.9)洗脫來(lái)收集Trx-tm-Hmgr融合蛋白。融合蛋白經(jīng)腸激酶20℃酶切16小時(shí)后即可分離獲得tm-Hmgr的表達(dá)蛋白。
純化的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的活力測(cè)定按Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，95702～5712)的方法對(duì)表達(dá)純化的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶進(jìn)行酶活力的測(cè)定，研究在其作用下3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸的能力。反應(yīng)體系含有0.05MTris-HCL(pH＝7.5)，5mM DTT，200mM NADPH，300mM14C標(biāo)記的乙酰輔酶A(1mCi/mmol)及20mM磷酸葡萄糖，每毫升9.75mU磷酸葡萄糖脫氫酶用于NADPH的再生，總體積為100ul。反應(yīng)流程如下首先加入400mg蛋白質(zhì)37℃水浴5分鐘。然后加入20ml 6N的HCL終止反應(yīng)，混合物再37℃水浴15分鐘，使3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸。反應(yīng)終產(chǎn)物和酶作用物在Bio-Rex 5柱子上分離，反應(yīng)終產(chǎn)物可從柱子中水洗下來(lái)?？捎靡后w閃爍記數(shù)器測(cè)定14C標(biāo)記的反應(yīng)終產(chǎn)物的含量。結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白的確具有催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸的酶活性。
實(shí)施例4南京椴tm-Hmgr蛋白在煙草中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)將含目的基因(南京椴tm-Hmgr蛋白基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建，根據(jù)南京椴tm-Hmgr蛋白的全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將南京椴tm-Hmgr蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤(pán)法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物煙草。
利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草1.用無(wú)菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽(yáng)性菌落，接種于2ml YEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長(zhǎng)兩周左右的煙草的無(wú)菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見(jiàn)方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時(shí)；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)愈傷組織的形成；8.約20天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，待芽長(zhǎng)大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
利用Northern blotting檢測(cè)tm-Hmgr蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)1.RNA的提取待轉(zhuǎn)基因煙草葉片長(zhǎng)到2-3片葉時(shí)抽取煙草葉的RNA。以正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照(條件同上)，利用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測(cè)OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3 總RNA脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無(wú)菌水，混勻。2)稱(chēng)取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過(guò)膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤(rùn)的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時(shí)。
5.膜上雜交信號(hào)的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚(yú)精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時(shí)。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說(shuō)明書(shū))。Northern雜交表明；轉(zhuǎn)基因煙草的tm-HMGR轉(zhuǎn)錄水平比未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照材料的表達(dá)水平明顯高得多。
含南京椴3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(tmhmgr)的轉(zhuǎn)基因煙草植株中的tm-Hmgr蛋白活性測(cè)定1.蛋白的提取a)取500mg葉片，加入1000ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl 0.2g/l，NaCl 8g/l)于50ml eppondorf管中研磨；b)13000，4℃離心10分鐘；c)取上清，備用。注以上過(guò)程于冰上進(jìn)行。
2.蛋白的定量參考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白樣品，加入1mlBradford試劑，混勻后，分光光度計(jì)測(cè)OD595；蛋白含量計(jì)算1 OD595＝28.57μg。
3.tm-Hmgr蛋白活性測(cè)定 參考Thorsness等(Mol.Cell.Biol，1989，95702～5712)的方法(詳細(xì)操作過(guò)程同實(shí)例3)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草植株的中的tm-Hmgr蛋白酶活性比沒(méi)有轉(zhuǎn)基因的對(duì)照明顯高得多(P＜0.05)。從而再次證明所克隆的南京椴3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因的確具有催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A生成甲羥戊酸的酶活性，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)提高植物的萜類(lèi)化合物次生代謝產(chǎn)物的研究和產(chǎn)業(yè)化中。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii).分子類(lèi)型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1ACTCAACCCCCGAAAACCG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型寡核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.2
ACAATTCTGTCATTTTACC(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2160bp(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3(4)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度585氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii).分子類(lèi)型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.4<210>1<211>2160<212>DNA<213>南京椴(Tilia miqueliana Maxim)<220>
<221>CDS<222>(131)..(1888)<223>
<400>1acgcggggac tcaacccccg aaaaccgttt ttcccgaaac gaacctgaat cgtcttttca60
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160 165 170ata att aaa tcc gta gtg gct gga aca acc cct tca tat tct ttg gaa697Ile Ile Lys Ser Val Val Ala Gly Thr Thr Pro Ser Tyr Ser Leu Glu175 180 185tcg aaa tta ggt gat tgc aag aga gcg act gcg atc agg cgt gag gcg745Ser Lys Leu Gly Asp Cys Lys Arg Ala Thr Ala Ile Arg Arg Glu Ala190 195 200 205ctg cag aga tta acg gga aag tca tta tca gga ttg ccc ttg gat gga793Leu Glu Arg Leu Thr Gly Lys Ser Leu Ser Gly Leu Pro Leu Asp Gly210 215 220ttt gat tat gcg tcg att tta ggg cag tgt tgt gag atg ccg gtt ggg841Phe Asp Tyr Ala Ser Ile Leu Gly Glu Cys Cys GLu Met Pro Val Gly225 230 235tac gtg caa att ccc gtg gga att gct ggg ccg ttg ttg ctt aat gga889Tyr Val Glu Ile Pro Val Gly Ile Ala Gly Pro Leu Leu Leu Asn Gly240 245 250aga gaa tac acg gtt cct atg gca acc acg gag ggg acc ttg gtg gct937Arg Glu Tyr Thr Val Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Thr Leu Val Ala255 260 265agc act aat agg gga tgt aag gct att cat ttg tct ggt gga gct aca985Ser Thr Asn Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr270 275 280 285agt gtt ctt ttg aaa gat ggg atg act aga gct cct gtg gtt agg ttc1033Ser Val Leu Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe290 295 300agt act gcg aaa aga gca gct gat ctg aag ttt tat ttg gag gat cct1081Ser Thr Ala Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Tyr Leu Glu Asp Pro305 310 315gaa aat ttc gag acc ttg gct gtt gtt ttt aac aga tca agt aga ttt1129Glu Asp Phe Glu Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe320 325 330gct agg ctt caa ggt atc aaa tgt gca att gct ggg aag aat ctc tat1177Ala Arg Leu Glu Gly Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr
335 340 345ttg aga ttc act tgc agt act ggt gat gct atg ggg atg aac atg gtt 1225Leu Arg Phe Thr Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val350 355 360 365tcc aag gga gtc csa aac gta ttg gat ttc ctt caa act gat ttc tct 1273Ser Lys Gly Val Glu Asn Val Leu Asp Phe Leu Glu Thr Asp Phe Ser370 375 380gac atg gat gtc att ggc atc tct gga aac ttc tgt tcg gac aaa aag 1321Asp Met Asp Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys385 390 395cca gct gca gta aat tgg att gaa gga cgt ggc aaa tct gtt gtc tgc 1369Pro Ala Ala Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys400 405 410gag gcc atc att aag gat gat gtg gtg agg aag gtc ttg aag act ggt 1417Glu Ala Ile Ile Lys Asp Asp Val Val Arg Arg Val Leu Lys Thr Gly415 420 425gtg gaa tct ctc gtg gag ctt aac atg ctt aag aac ctt act gga tct 1465Val Glu Ser Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser430 435 440 445gct atg gct gga gct ctg ggt gga ttt aat gcc tat gcc ggt aac att 1513Ala Met Ala Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Ala Gly Asn Ile450 455 460gtg tct gct gtc tac ata gct acc ggt caa gat ccg gct caa aat gtc 1561Val Ser Ala Val Tyr Ile Ala Thr Gly Glu Asp Pro Ala Glu Asn Val465 470 475gag agc tct cat tgc ata acg atg atg gaa gct gtt aat gat ggc aag 1609Glu Ser Ser His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys480 485 490gac ctt cac atc tct gtt aca atg cct tcc atc gag gtt ggc act gtt 1657Asp Lys His Ile Ser yal Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val495 500 505ggt ggt gga act cag ctt sca tct cag tca gcg tgt ttg aac ctg ctc 1705Gly Gly Gly Thr Glu Leu Ala Ser Glu Ser Ala Cys Leu Asn Leu Leu
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Arg Gly Cys Lys Ala Ile His Leu Ser Gly Gly Ala Thr Ser Val Leu275 280 285Leu Lys Asp Gly Met Thr Arg Ala Pro Val Val Arg Phe Ser Thr Ala290 295 300Lys Arg Ala Ala Asp Leu Lys Phe Tyr Leu Glu Asp Pro Glu Asp Phe305 310 315 320Glu Thr Leu Ala Val Val Phe Asn Arg Ser Ser Arg Phe Ala Arg Leu325 330 335Glu Gly Ile Lys Cys Ala Ile Ala Gly Lys Asn Leu Tyr Leu Arg Phe340 345 350Thr Cys Ser Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Val Ser Lys Gly355 360 365Val Glu Asn Val Leu Asp Phe Leu Glu Thr Asp Phe Ser Asp Met Asp370 375 380Val Ile Gly Ile Ser Gly Asn Phe Cys Ser Asp Lys Lys Pro Ala Ala385 390 395 400Val Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Cys Glu Ala Ile405 410 415Ile Lys Asp Asp Val Val Arg Arg Val Leu Lys Thr Gly Val Glu Ser420 425 430Leu Val Glu Leu Asn Met Leu Lys Asn Leu Thr Gly Ser Ala Met Ala435 440 445Gly Ala Leu Gly Gly Phe Asn Ala Tyr Ala Gly Asn Ile Val Ser Ala450 455 460Val Tyr Ile Ala Thr Gly Glu Asp Pro Ala Glu Asn Val Glu Ser Ser465 470 475 480His Cys Ile Thr Met Met Glu Ala Val Asn Asp Gly Lys Asp Lys His485 490 495Ile Ser Val Thr Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Val Gly Gly Gly500 505 510
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1.一種南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列，其特征在于，所分離出的DNA分子包括編碼具有南京椴tm-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，分離出的南京椴tm-Hmgr蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第131-1888位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的南京椴tm-Hmgr蛋白編碼序列，其特征是，所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種南京椴tm－Hmgr蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。所分離出的DNA分子包括編碼具有南京椴tm－Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID No.3中從核苷酸第131－1888位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃條件下與SEQ ID No.3中從核苷酸第131－1888位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明是一種3－羥基－3－甲基戊二酰輔酶A的還原酶，有助于提高南京椴中萜類(lèi)化合物次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量，且可以開(kāi)拓新蛋白資源，對(duì)于保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)將有所幫助，同時(shí)對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥的研究和發(fā)展具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1769436SQ20041006526
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2004年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月2日
發(fā)明者蔣繼宏, 曹小迎, 開(kāi)國(guó)銀, 陳鳳美, 盧芳 申請(qǐng)人:蔣繼宏