專利名稱：用于制備甲基丙二酰輔酶a或乙基丙二酰輔酶a的酶及其用途的制作方法
用于制備甲基丙二酰輔酶A或乙基丙二酰輔酶A的酶及其
用途 本發(fā)明涉及分離的DNA，載體，所述載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的用途，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，多肽，相對(duì)于其野生型而言經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，用于制備經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的方法，通過(guò)所述方法獲得的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞的用途，以及用于制備有機(jī)Cf和/或C;-化合物的方法。 有機(jī)C3_和C4_化合物，例如3-羥基丙酸或3-羥基異丁酸(3-HIB)，是重要的化學(xué)前體，并且例如用于制備藥用活性物質(zhì)或在制備生物可降解的聚合物中用作組分。因此，3-羥基異丁酸例如適合于作為用于合成表卡托普利(Epic即topril)(—種血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶(ACE)的抑制劑，其尤其用于治療高血壓)的前體。3-羥基異丁酸也可以通過(guò)脫水而轉(zhuǎn)化為甲基丙烯酸。例如，使用3-羥基異丁酸通過(guò)脫水來(lái)制備丙烯酸，通過(guò)氧化來(lái)制備丙二酸，或者通過(guò)還原來(lái)制備1，3-丙二醇。 現(xiàn)有技術(shù)中已知用于制備3-羥基異丁酸或3-羥基丙酸的發(fā)酵方法。如此，US4， 618， 583描述了一種用于制備3-羥基異丁酸的方法，其中用銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或白黃精朊桿菌(Protaminobacter alboflavus)這些種類的微生物將選自異丁酸、甲基丙烯酸、異丁酰氯、異丁酰氯的甲基酯、甲基丙烯酸的甲基酯、甲基丙烯酸的乙基酯、異丁醇、異丁醇的酯、異丁胺、異丁醛、異丁酰胺或其混合物的底物轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。W0-A-03/62173、W0-A-02/42418和W0-A-01/16346描述了借助于重組細(xì)胞從碳水化合物或甘油來(lái)制備3-羥基丙酸的方法，其中利用了不同的代謝途徑。 上面所描述的用于制備3-羥基異丁酸或3-羥基丙酸的發(fā)酵方法的缺點(diǎn)尤其在于，在發(fā)酵溶液中所形成的目標(biāo)產(chǎn)物的量太少了，以致不能將該發(fā)酵溶液用作用于大規(guī)模制備基于3-羥基異丁酸或3-羥基丙酸的第二產(chǎn)物(Folg印rodukt)的起始材料。
此外，在現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于制備3-羥基丙酸或3-羥基異丁酸的方法中，總是使用c6-化合物例如葡萄糖或者C3_化合物例如丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸或甘油，從而這些方法基本上限于使用碳水化合物或甘油作為碳源。然而，對(duì)于下列方面存在著日益增長(zhǎng)的興趣也從或C2_碳源例如二氧化碳、甲烷、甲醇或乙醇來(lái)制備有機(jī)C3_或C4_化合物。然而，借助于現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法，不可能以經(jīng)濟(jì)上合理的方式如此地從C「或C2-碳源來(lái)合成C3-或C;-化合物。 本發(fā)明基于這樣的任務(wù)，即克服產(chǎn)生自現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。 特別地，本發(fā)明基于這樣的任務(wù)，即提供核酸序列，所述核酸序列編碼酶，所述酶當(dāng)在合適的細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，使得這些細(xì)胞能夠從合適的碳源，特別是從C「或C2-碳源，以盡可能大的量產(chǎn)生有機(jī)C3_和/或C4_化合物，特別是3-羥基異丁酸或其衍生物。
本發(fā)明還基于這樣的任務(wù)，即提供酶，所述酶與現(xiàn)有技術(shù)中已知的酶相比較，在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)該酶的情況下，決定性地改善細(xì)胞形成3-羥基異丁酸或其衍生物的能力。
此外，本發(fā)明還基于這樣的任務(wù)，即提供細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠比現(xiàn)有技術(shù)中所描述的細(xì)胞更好地，特別是更有效地從合適的碳源，特別是也從Cr或C^碳源，制備在用于制備3_羥基異丁酸或其衍生物的方法中作為可能的中間產(chǎn)物的甲基丙二酰輔酶A或乙基丙二酰輔酶A，或者直接制備3-羥基異丁酸或其衍生物。 分離的DNA為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述分離的DNA選自下列序列
a)根據(jù)SEQ ID NO :01的序列， b)無(wú)內(nèi)含子的序列，其衍生自根據(jù)a)的序列并且與根據(jù)SEQ IDNO :01的序列編 碼相同的蛋白質(zhì)或肽， c)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO :02的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的序列， d)與根據(jù)組a)至c)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的序列至少80%，特別優(yōu)選地至
少90% ，更優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少99%同一的序列，其中所述序列優(yōu)選地編碼能
夠?qū)投辊］o酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A，和任選地也能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙
二酰輔酶A的蛋白質(zhì)或肽， e)與根據(jù)組a)至d)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的序列的反義鏈雜交或者在考慮 遺傳密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交的序列，其中所述序列優(yōu)選地編碼能夠?qū)投辊?輔酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A，和任選地也能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A 的蛋白質(zhì)或肽， f)根據(jù)組a)至e)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的序列的衍生物，其通過(guò)至少1個(gè)
堿基，優(yōu)選地至少2個(gè)堿基，更優(yōu)選地至少5個(gè)堿基和最優(yōu)選地至少10個(gè)堿基，然而優(yōu)選地
不多于100個(gè)堿基，特別優(yōu)選地不多于50個(gè)堿基和最優(yōu)選地不多于25個(gè)堿基的置換、添
加、倒位和/或刪除而獲得，其中所述衍生物優(yōu)選地編碼能夠?qū)投辊］o酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙
二酰輔酶A，和任選地也能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A的蛋白質(zhì)或肽， g)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍之內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID NO :01的序列， h)具有SEQ ID NO :01的中性有義突變的序列，以及 i)與根據(jù)組a)至h)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的序列互補(bǔ)的序列。 令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，從類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)菌種的細(xì)菌中分離
的具有根據(jù)SEQ ID NO :Ol的DNA序列的DNA編碼這樣的多肽(SEQ ID N0:02)，所述多肽能
夠?qū)投辊］o酶A以及丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷基丙二酰輔酶A化合物(分別為乙基
丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A)。由于乙基丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A是例如在
纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的降解中或在丙酸的代謝中或在某些細(xì)菌的乙基丙二酰輔酶A
循環(huán)中形成的天然代謝產(chǎn)物，并且因?yàn)檫@些烷基丙二酰輔酶A化合物在上述代謝途徑的過(guò)
程中可以經(jīng)由相應(yīng)的半醛而被進(jìn)一步還原成相應(yīng)的3-羥基鏈烷酸(3-Hydroxyalkanoat)，
所以根據(jù)本發(fā)明的分離的DNA可被用于制備能夠直接形成大量的3-羥基異丁酸(和任選
地還有3-羥基丙酸)的重組細(xì)菌。此外，如果這些細(xì)胞能夠使所形成的3-羥基鏈烷酸聚
合形成聚羥基鏈烷酸(Polyhydroxyalkanoat)，那么所述DNA還適合于制備能夠產(chǎn)生基于
3_羥基異丁酸(或任選地還有3-羥基丙酸)的聚羥基鏈烷酸的重組細(xì)菌。 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，用已知的方法來(lái)測(cè)定"核苷酸同一性"以及"氨基酸同一性"。
通常，使用具有考慮了專門要求的算法的特殊的計(jì)算機(jī)程序。用于測(cè)定同一性的優(yōu)選的方
法首先在待比較的序列之間產(chǎn)生最大的一致。用于測(cè)定同一性的計(jì)算機(jī)程序包括，但不限
于，GCG程序包，該程序包包括 -GAP(Deveroy， J.等人，Nucleic Acid Research 12 (1984)，第387頁(yè))，Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine (Wi)，禾口
-BLASTP、 BLASTN和FASTA(Altschul， S.等人，Journal o飾lecular Biology 215(1990)，第403-410頁(yè))。BLAST程序可以從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnologylnformation，NCBI)以及從其他來(lái)源(BLAST Handbuch，Altschul S.等 人，NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894 ;Altschul S.等人，同上)獲得。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，多種計(jì)算機(jī)程序可供用于計(jì)算兩個(gè)核苷酸序列或氨基酸序 列之間的相似性或同一性。因此，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分比可以例如通過(guò)在GCG 軟件包(可從http:〃www. gcg. com獲得)中的GAP程序之中的Needleman禾口 W墜ch(J. Mol.Biol. (48) :444-453(1970))算法來(lái)測(cè)定，更確切地說(shuō)通過(guò)使用Blossom 62矩陣或 PAM250矩陣，16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重，和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。本領(lǐng)域技 術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，使用不同的參數(shù)會(huì)導(dǎo)致略微不同的結(jié)果，但兩個(gè)氨基酸序列之間的同 一性百分比總體上不會(huì)顯著不同。通常，采用Blossom 62矩陣，其中使用缺省值(缺口權(quán) 重12，長(zhǎng)度權(quán)重1)。 在本發(fā)明的情況下，根據(jù)上述算法的80%的同一性意味著80%同一性。這也適用 于更高的同一性。 根據(jù)備選項(xiàng)e)的特征"與根據(jù)組a)至d)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的序列 的反義鏈雜交或者在考慮遺傳密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交的序列"是指這樣 的序列，該序列在優(yōu)選地嚴(yán)緊的條件下與根據(jù)a)至d)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組a)的 序列的反義鏈雜交，或者在考慮遺傳密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交。例如，雜交 可以于68t:在2XSSC中或者根據(jù)Boehringer公司(Mannheim)的地高辛標(biāo)記試劑盒 (Dioxygenin-Labelling-Kit)的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行。優(yōu)選的雜交條件為例如于65。C在7% SDS，1% BSA，lmM EDTA， 250mM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 2)中溫育過(guò)夜，然后于65。C用2 X SSC， 0. 1% SDS洗滌。 根據(jù)本發(fā)明的分離的DNA的衍生物(其根據(jù)備選項(xiàng)f)，可以通過(guò)根據(jù)組a)至e) 之一的序列的一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、添加、倒位和/或刪除而獲得)特別包括這樣的序 列，所述序列在其所編碼的蛋白質(zhì)中導(dǎo)致保守氨基酸替換，例如甘氨酸替換為丙氨酸或者 天冬氨酸替換為谷氨酸。此類功能中性突變被稱為有義突變(sense mutation)，并且不 會(huì)造成多肽活性的根本變化。此外已知，多肽的N-和/或C-末端的變化不會(huì)極大地?fù)p害 其功能，甚至可以穩(wěn)定該多肽，因而，與之相應(yīng)地，其中將堿基附加至具有SEQ ID N0:01的 序列的3'-末端或5'-末端的DNA序列也被包括在本發(fā)明之中。本領(lǐng)域技術(shù)人員尤其 可以在下列文獻(xiàn)中找到關(guān)于此的陳述Ben-Bassat等人(Journal ofBacteriology 169: 751-757(1987))， 0' Regan等人(Gene 77 :237-2511989))， Sahin-Toth等人(Protein Sciences 3 :240-247 (1994)) ， Hochuli等人(Bio/Technology 6 :1321-1325 (1988))，以及 已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書。 為了分離根據(jù)本發(fā)明的DNA，首先根據(jù)F.M.Ausubel等人，〃 Current Protocols in Molecular Biology" ， John Wiley and Sons, New York, 1987，從類球紅細(xì)菌中分離出 染色體DNA。在該DNA中鑒定出同源核酸序列，該同源核酸序列編碼與來(lái)自扭脫甲基桿菌 (Methylobacterium extorquens)的巴豆酰輔酶A還原酶基因(ccr基因)78%同一，與來(lái)自 山丘鏈霉菌(S. colli皿s)的ccr基因41%同一，和與來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌(S. coelicolor) 的ccr基因39X同一的蛋白質(zhì)。然后，通過(guò)使用兩種合成的多核苷酸，如在下面的實(shí)施例1中更詳細(xì)地描述的，借助于PCR從類球紅細(xì)菌中擴(kuò)增出整個(gè)ccr基因。 此外，載體，優(yōu)選地表達(dá)載體，也為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述載體包
含如上面所定義的具有根據(jù)組a)至h)之一的序列的DNA。作為載體，可以考慮通常用于
將DNA引入宿主細(xì)胞中的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有載體。優(yōu)選的載體選自質(zhì)粒(例如，
大腸桿菌(E. coli)質(zhì)粒pTE13、 pTrc99A、 pBR345和pBR322)、病毒(例如噬菌體、腺病毒、
痘苗病毒、桿狀病毒、麻疹病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒)、粘?；験AC，其中質(zhì)粒對(duì)于作為載體來(lái)說(shuō)是
最優(yōu)選的。 依照根據(jù)本發(fā)明的載體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，具有根據(jù)組a)至h)之一的序列的 DNA處于可調(diào)控的啟動(dòng)子的控制之下，所述啟動(dòng)子適合于在微生物細(xì)胞中表達(dá)由這些DNA 序列所編碼的多肽，所述微生物細(xì)胞優(yōu)選地為細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞，特別優(yōu)選地為細(xì)菌細(xì) 胞，最優(yōu)選地為大腸桿菌細(xì)胞。此類啟動(dòng)子的實(shí)例例如為trp啟動(dòng)子或tac啟動(dòng)子。
除了啟動(dòng)子外，根據(jù)本發(fā)明的載體還應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及終止 子。在此，特別優(yōu)選的是，將根據(jù)本發(fā)明的DNA嵌入包含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子 的載體的表達(dá)盒中。除了上述的結(jié)構(gòu)元件之外，所述載體還可以包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的選擇基因。 進(jìn)一步地，上面所描述的載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的用途以及通過(guò)用所述載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化 而獲得的細(xì)胞為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)?？梢杂酶鶕?jù)本發(fā)明的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì) 胞可以是原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。在此，可以涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如來(lái)自人的細(xì) 胞)，植物細(xì)胞，或者微生物例如酵母、真菌或細(xì)菌，其中特別優(yōu)選的是微生物，最優(yōu)選的是 細(xì)菌和酵母。 作為細(xì)菌、酵母或真菌，以細(xì)菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物保 藏 中 心 (Deutsche Samml皿g yon Mikroorganismen 皿dZellkulturen GmbH(DSMZ)， Braunschweig, Deutschland)中的那些細(xì)菌、酵母或真菌是特別合適的。根據(jù)本發(fā)明合適 的細(xì)菌屬于在http://www. dsmz. de/species/bacteria. htm中所列出的那些類別，根據(jù)本 發(fā)明合適的酵母屬于在http:〃www. dsmz. de/species/yeasts. htm中所列出的那些類另U， 和根據(jù)本發(fā)明合適的真菌屬于在http:〃www. dsmz. de/species/fungi. htm中所列出的那 些類別。 特別地，依照上面所描述載體的根據(jù)本發(fā)明的用途的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施 方案，證實(shí)了用所述載體轉(zhuǎn)化甲烷營(yíng)養(yǎng)微生物或甲基營(yíng)養(yǎng)微生物，優(yōu)選地甲基營(yíng)養(yǎng)微 生物是有利的。甲基營(yíng)養(yǎng)微生物能夠利用Q-碳化合物，例如甲烷、甲醇或甲胺。作 為實(shí)例，在此可以提及甲基桿菌屬(Methylobacterium)的細(xì)菌，例如粘甲基桿菌 (Methylobacterium adhaesivum)、噬胺甲基桿菌(Methylobacterium咖inovorans)、水 生甲基木干菌(Methylobacterium aquaticum) 、二氯甲烷甲基木干菌(Methylobacterium dichloromethanicum)、 f丑月兌甲基木干菌(Methylobacterium extorquens)、藤 華氏甲 基桿菌(Methylobacterium fujisawaense)、西班牙甲基桿菌(Methylobacterium h i span i cum) 、 Methylobacterium isbiliense、葡萄牙礦甲基桿菌(Methylobacterium lusita皿m)、嗜中溫甲基桿菌(Methylobacterium mesophilicum)、嗜中溫假單胞菌 (Pseudomonasmesophilica)、嗜有機(jī)甲基桿菌(Methylobacterium organophilum)、 足甲基木干菌(Methylobacterium podarium)、而f車畐身寸甲基木干菌(Methylobacteriumradiotolerans)、抗方文身寸假單胞菌(Pseudomonasradiora)、羅得西亞甲基桿菌 (Methylobacterium rhodesia皿m)、攻瑰紅甲基桿菌(Methylobacterium rhodi皿m)、甲 基桿菌屬物禾中(Methylobacterium sp. ) 、 Methylobacterium suomiense、硫氛酸鹽甲基桿 菌(Methylobacterium thiocyanatum)、易變甲基桿菌(Methylobacterium variabile)或 扎氏甲基桿菌(Methylobacteriumzatmanii)，紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)的細(xì)菌，亞德里亞 紅細(xì)菌(Rhodobacter adriaticus)、亞德里亞紅細(xì)菌(Rhodobacteradriaticus)、亞德里 亞紅假單胞菌(Rhodopseudomonas adriatica)、生芽紅細(xì)菌(Rhodobacter blasticus)、 莢膜紅細(xì)菌(Rhodobactercapsulatus)、廣海紅細(xì)菌(Rhodobacter euryhali皿s)、廣 鹽小紅卵菌(Rhodovulum euryhali皿m)、廣海紅細(xì)菌(Rhodobactereuryhali皿s)、印 度紅細(xì)菌(Rhodobacter indicus)、紅細(xì)菌屬物種(Rhodobacter sp.)、類球紅細(xì)菌 (Rhodobacter sphaeroides)、類球紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sphaeroides)、嗜硫紅 細(xì)菌(Rhodobacter sulf idophilus)或維氏紅細(xì)菌(Rhodobacterveldkampii)，鏈霉菌屬 (Str印tomyces)的細(xì)菌，例如天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomyces coelicolor)。
根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為下列屬的那些細(xì)胞棒桿菌屬(Corynebacterium)、 短桿菌屬(Brevibacterium)、芽孢桿菌屬(bacillus)、乳桿菌屬(Xactobacillus)、乳 球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)、糖酵母屬(Saccharomyces) 、士矣希氏菌屬(Escherichia)、發(fā)酵單胞菌屬 (Zymomonas)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、羅爾其j 通氏菌屬 (Ralstonia)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)和梭菌屬(Clostridium)，其中甲基桿菌屬和紅細(xì) 菌屬是特別優(yōu)選的。 這樣的多肽也為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述多肽具有帶有SEQ ID NO : 02的氨基酸序列，或者與根據(jù)SEQ ID NO :02的氨基酸序列享有至少50%，優(yōu)選地至少 55%，更優(yōu)選地至少60%，更加優(yōu)選地至少65%和最優(yōu)選地至少70%同一性的氨基酸序 列。所述多肽為能夠?qū)投辊］o酶A以及丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的烷基丙二酰輔酶A化 合物(分別為乙基丙二酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A)的酶。這樣的多肽可以例如從具有 SEQ ID N0:01的DNA序列開始以合成方式來(lái)獲得，或者通過(guò)下列步驟來(lái)獲得用合適的包 含該核酸序列的載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞；在所述細(xì)胞中表達(dá)由該核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)； 裂解所述細(xì)胞以獲得細(xì)胞提取物；以及，隨后借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的純化技術(shù)，例如 借助于HPLC或其他色譜方法來(lái)純化該酶。 這樣的細(xì)胞也為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述細(xì)胞相對(duì)于其野生型而言 如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比較，它能夠形成更多的乙基丙二酰輔酶A或 更多的甲基丙二酰輔酶A (其優(yōu)選地在用于制備3-羥基異丁酸或其衍生物的方法中作為中 間產(chǎn)物)，或者直接形成更多的3-羥基異丁酸或其衍生物。在此，特別優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā) 明的細(xì)胞在確定的時(shí)段內(nèi)，優(yōu)選地在2小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選地在8小時(shí)內(nèi)和最優(yōu)選地在24小時(shí) 內(nèi)，所形成的3-羥基異丁酸或其衍生物的量為所述細(xì)胞的野生型的至少2倍，特別優(yōu)選地 至少10倍，更優(yōu)選地至少100倍，更加優(yōu)選地至少1000倍和最優(yōu)選地至少10000倍。在此， 產(chǎn)物形成的增加可以例如通過(guò)下列方式來(lái)測(cè)定將根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞和野生型細(xì)胞各自分 開地在相同的條件(相同的細(xì)胞密度、相同的培養(yǎng)基、相同的培養(yǎng)條件)下，在合適的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)經(jīng)過(guò)確定的時(shí)段；隨后測(cè)定培養(yǎng)基中目標(biāo)產(chǎn)物(3-羥基異丁酸或其衍生物)的量。
如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)"3-羥基異丁酸"在此總是描述以這樣形式的相應(yīng)的c;-羧
酸，所述形式為Q-羧酸在由相應(yīng)的微生物形成之后依賴于pH值而呈現(xiàn)的形式。因此，該術(shù) 語(yǔ)總是包括純的酸形式(3-羥基異丁酸)、純的堿形式(3-羥基異丁酸鹽)以及由酸的質(zhì)子 化和脫質(zhì)子化形式所組成的混合物。此外，術(shù)語(yǔ)"3-羥基異丁酸"原則上不僅包括(R)-立 體異構(gòu)體而且包括(s)-立體異構(gòu)體，其中特別優(yōu)選的是(S)-立體異構(gòu)體。同樣地，關(guān)于烷 基丙二酰輔酶A中間產(chǎn)物，名稱"甲基丙二酰輔酶A"和"乙基丙二酰輔酶A"總是不僅包括 (R)-立體異構(gòu)體而且包括(S)-立體異構(gòu)體。 術(shù)語(yǔ)"3-羥基異丁酸的衍生物"優(yōu)選地是指聚羥基鏈烷酸，其基于作為單體的 3-羥基異丁酸。 表述"能夠形成更多的乙基丙二酰輔酶A和/或甲基丙二酰輔酶A"和表述"能夠 形成更多的3-羥基異丁酸或其衍生物"也包括這樣的情況經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的野生 型完全不能形成乙基丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、3-羥基異丁酸或3-羥基異丁酸的衍 生物，或者至少不能形成可檢測(cè)量的這些化合物；并且在經(jīng)過(guò)基因工程改造之后才能形成 可檢測(cè)量的這些組分。 細(xì)胞的"野生型"優(yōu)選地是指這樣的細(xì)胞，其基因組以如同它自然地通過(guò)進(jìn)化而形 成的那種狀態(tài)存在。該術(shù)語(yǔ)不僅用于整個(gè)細(xì)胞，而且用于單個(gè)基因。因此，術(shù)語(yǔ)"野生型"特 別地不包括這樣的細(xì)胞或這樣的基因，其基因序列已由人借助于重組方法至少部分地進(jìn)行 了改變。 作為細(xì)胞，優(yōu)選的是這樣的細(xì)胞，它們已經(jīng)在根據(jù)本發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化的用途 方面作為優(yōu)選的細(xì)胞被提及。 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的酶^的活性，所述酶 E工能夠催化巴豆酰輔酶A向乙基丙二酰輔酶A的轉(zhuǎn)化以及丙烯酰輔酶A向甲基丙二酰輔 酶A的轉(zhuǎn)化。該酶E工由根據(jù)備選項(xiàng)a)至h)之一的DNA序列編碼，或者具有帶有SEQ ID NO :02的根據(jù)本發(fā)明的多肽序列或下列這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列與根據(jù)SEQ ID NO :02的氨基酸序列具有至少50 % ，優(yōu)選地至少55 % ，更優(yōu)選地至少60 % ，更加優(yōu)選地至少 65%和最優(yōu)選地至少70%的同一性，但能夠?qū)投辊］o酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A和任 選地還能夠?qū)⒈］o酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A。在此，根據(jù)本發(fā)明的DNA序列可以整 合到細(xì)胞的基因組中，或者存在于細(xì)胞內(nèi)的載體上。 現(xiàn)在接下來(lái)的關(guān)于提高細(xì)胞中的酶活性的論述不僅適用于提高酶E工的活性，而且 適用于下文提及的其活性任選地可以被提高的所有酶。 原則上，可以如此來(lái)獲得酶活性的增加，即通過(guò)增加編碼所述酶的基因序列的拷 貝數(shù)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子，或者利用編碼具有增加的活性的相應(yīng)酶的基因或等位基因，以及任選 地將這些措施相組合。根據(jù)本發(fā)明經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞例如通過(guò)用載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、 接合或這些方法的組合來(lái)產(chǎn)生，所述載體包含所期望的基因、該基因的等位基因或其部分 和使該基因能夠表達(dá)的載體。特別地，異源表達(dá)通過(guò)將所述基因或等位基因整合到細(xì)胞的 染色體中或染色體外復(fù)制型載體中來(lái)獲得。 DE-A-100 31 999給出了關(guān)于提高細(xì)胞中的酶活性(例如丙酮酸羧化酶的酶活 性)的可能性的綜述，該文獻(xiàn)在此引入作為參考，并且其關(guān)于提高細(xì)胞中的酶活性的可能 性的公開內(nèi)容構(gòu)成本發(fā)明公開內(nèi)容的一部分。
上文所提及的以及所有下文所提及的酶或基因的表達(dá)可借助于下列方式來(lái)檢 測(cè)l-和2-維蛋白質(zhì)凝膠分離，和隨后用相應(yīng)的評(píng)價(jià)軟件來(lái)光學(xué)鑒定凝膠中的蛋白質(zhì)濃 度。如果酶活性的提高僅基于相應(yīng)基因的表達(dá)的提高，那么可以簡(jiǎn)單地通過(guò)在野生型細(xì)胞 和經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞之間比較l-或2-維蛋白質(zhì)分離來(lái)定量酶活性的提高。用于制 備蛋白質(zhì)凝膠(例如在棒狀桿菌的情況下)和用于鑒定蛋白質(zhì)的常用方法為Hermann等 人(Electrophoresis, 22 :1712. 23(2001))所描述的程序。也可以通過(guò)下列方式來(lái)分析 蛋白質(zhì)濃度用對(duì)于待檢測(cè)的蛋白質(zhì)特異的抗體來(lái)進(jìn)行Western-印跡雜交(Sambrook等 人，Molecular Cloning :a laboratory ma皿al，第二片反，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA， 1989)，隨后用相應(yīng)的用于濃度測(cè)定的軟件來(lái) 進(jìn)行光學(xué)評(píng)價(jià)(Lohau s禾P Meyer (1989) Biospektrum， 5 :32-39 ;Lottspeich (1999)， AngewandteChemie 111 :2630-2647) 。 DNA結(jié)合蛋白的活性可以借助于DNA條帶移位 分析(也稱為凝膠阻滯)來(lái)測(cè)量(Wilson等人，(2001)Journalof Bacteriology, 183 : 2151-2155)。 DNA結(jié)合蛋白對(duì)于其他基因的表達(dá)的影響可以通過(guò)各種經(jīng)充分描述的報(bào)道 基因分析方法來(lái)檢領(lǐng)[J (Sambrook等人，Molecular Cloning :a laboratory ma皿al，第 二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. USA，1989)。 細(xì)胞內(nèi)的酶活性可以通過(guò)各種經(jīng)描述的方法來(lái)測(cè)定(Donahue等人，(2000) Journal of Bacteriology 182(19) :5624-5627 ;Ray等人，(2000) Journal of bacteriology 182(8): 2277-2284 ;Freedberg等人，(1973) Journal of Bacteriology 115(3) :816-823)。如果在 后面的論述中，沒(méi)有說(shuō)明用于測(cè)定特定酶的活性的具體方法，那么優(yōu)選地借助于下列文獻(xiàn) 中所描述的方法來(lái)測(cè)定酶活性的增加以及酶活性的降低He rmann等人，Electophoresis， 22:1712-23(2001) ;Lohau s等人，Biospektrum 532-39(1998) ;Lottspeich， Angewandte Chemie 111:2630-2647(1999); 和Wilson等人，Journal of Bacteriology 183: 2151-2155(2001)。 如果酶活性的提高是通過(guò)內(nèi)源基因的突變而實(shí)現(xiàn)的，那么這樣的突變可以或者根 據(jù)傳統(tǒng)方法隨機(jī)產(chǎn)生，例如通過(guò)UV輻射或通過(guò)誘發(fā)突變的化學(xué)藥品；或者借助于基因工程 方法例如刪除、插入和/或核苷酸交換來(lái)達(dá)到。通過(guò)這些突變獲得經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞。 特別地，特別優(yōu)選的酶突變體還是這樣的酶，其不再是反饋可抑制的或者至少與野生型酶 相比較而言其反饋可抑制性降低了 。 如果酶活性的提高是通過(guò)提高酶的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，那么就例如增加相應(yīng)基因的拷 貝數(shù)，或者使啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)域或位于結(jié)構(gòu)基因上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)突變。同樣地，嵌 入至結(jié)構(gòu)基因上游的表達(dá)盒也起作用。通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子另外還可能在任一時(shí)間點(diǎn)處增 強(qiáng)表達(dá)。此外，也可以給酶基因分派所謂的"增強(qiáng)子"作為調(diào)控序列，其通過(guò)RNA聚合酶和 DNA之間改善的相互作用也導(dǎo)致提高的基因表達(dá)。通過(guò)用于延長(zhǎng)mRNA壽命的措施也可改 善表達(dá)。此外，通過(guò)防止酶蛋白質(zhì)的降解也可增強(qiáng)酶活性。在此，基因或基因構(gòu)建體或者 存在于具有不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，或者整合在染色體中并于其中進(jìn)行擴(kuò)增。備選地，所涉 及的基因的過(guò)表達(dá)此外還可以通過(guò)改變培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件來(lái)達(dá)到。本領(lǐng)域技術(shù)人員 尤其可在Martin等人(Bio/Technology 5,137—146(1987))中，在Guerrero等人(Gene 138,35-41(1994))，在Tsuchiya和Morinaga(Bio/Technology 6,428-430(1988))中，在 Eikmanns等人(Gene 102,93-98(1991))中，在EP-A-0472869中，在US4， 601， 893中，在Schwarzer禾P P他ler (Bio/Technology 9,84-87(1991))中，在Reinscheid等人(Applied and EnvironmentalMicrobiology 60，126_132(1994))中，在LaBarre等人(Journalof Bacteriology 175，1001-1007(1993))中，在W0-A-96/15246中，在Malumbres等人 (Gene 134， 15-24 (1993))中，在JP-A-10-229891中，在Jensen和Hammer (Biotechnology andBioengineering 58,191-195(1998))中，以及在已知的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)教科書中 找到關(guān)于此的指導(dǎo)。與突變一樣，上面所描述的措施產(chǎn)生經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞。
為了提高各基因的表達(dá)，使用例如附加型質(zhì)粒。合適的質(zhì)粒特別為在棒狀 桿菌中進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒。眾多的已知質(zhì)粒載體，例如pZl(Menkel等人，Applied and Environmental Microbiology 64 :549-554 (1989)) 、 pEKExl (Eikma皿s等人，Gene 107: 69-74(1991))或pHS2-l(Sonnen等人，Gene 107:69-74(1991))基于隱蔽性質(zhì)粒pffll519、 pBLl或pGAl。同樣地，也可以使用其他質(zhì)粒載體，例如基于pCG4(US 4， 489， 160)或 pNG2(Serwold-Davis等人，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters 66:119-124(1990))或pAGl (US 5， 158,891)的那些質(zhì)粒。 此外，這樣的質(zhì)粒載體也是合適的，借助于所述質(zhì)粒載體可以采用通過(guò)整合入 染色體中來(lái)進(jìn)行基因擴(kuò)增的方法，如由Reinscheid等人(Applied and Environmental Microbiology 60 :126-132 (1994))對(duì)于復(fù)制或擴(kuò)增hom-t hrB操縱子所描述的那 樣。在該方法中，將完整的基因克隆到質(zhì)粒載體中，后者可以在宿主(通常為大腸 桿菌(Escherichia coli))中進(jìn)行復(fù)制，但不能在谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamic咖)中進(jìn)行復(fù)制。作為載體，例如可以考慮pSUP301 (Simon等人，Bio/Technology 1 :784-791 (1983)) 、 pK18mob或pK19mob( SchSfer 等人，Genel45 :69-73 (1994))、 pGEM-T (Promega Corporation, Madison， Wisconsin, USA) 、 pCR2. 1-T0P0 (Shuman， Journal of Biological Chemistry 269 :32678-84(1994))、pCR Blunt(Invitrogen， Groningen， Niederlande) 、 pEMl (Schr卿f等人，Journal of Bacteriology 173:4510-4516))或 pBGS8(Spratt等人，Gene 41 :337-342(1986))。隨后，包含待擴(kuò)增的基因的質(zhì)粒載體通
過(guò)接合或轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移到所期望的谷氨酸棒桿菌菌株中。接合的方法例如在Sch3fer等
人，Applied andEnvironmental Microbiology 60 :756_759 (1994)中進(jìn)行了描述。轉(zhuǎn) 化的方法在例如在Thierbach等人，Applied Microbiology andBiotechnology 29: 356-362(1988) ;Dunican禾P Shivnan， Bio/Technology 7 :1067-1070(1989);和Tauch等 人，F(xiàn)EMSMicrobiology Letters 123 :343-347 (1994)中進(jìn)行了描述。在借助于"交換 (cross-over)"事件進(jìn)行同源重組后，所得的菌株包含至少兩個(gè)拷貝的所涉及的基因。
在上文中和在下面的論述中所使用的表述"相對(duì)于其野生型而言增加的酶Ex的活 性"優(yōu)選地總是指，各酶Ex的活性增加到至少2倍，特別優(yōu)選地至少10倍，更優(yōu)選地至少 IOO倍，更加優(yōu)選地至少IOOO倍和最優(yōu)選地至少ioooo倍。此外，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞(其具 有"相對(duì)于其野生型而言增加的酶E,的活性")特別地也包括這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞的野生 型不具有該酶E,的活性或至少不具有可檢測(cè)的該酶E,的活性，并且在提高所述酶活性之后 (例如通過(guò)過(guò)表達(dá))才顯示出可檢測(cè)的該酶Ex的活性。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)"過(guò)表達(dá)"或者 在下面的論述中所使用的表述"表達(dá)的提高"也包括這樣的情況，即起始細(xì)胞例如野生型細(xì) 胞不具有表達(dá)或至少不具有可檢測(cè)的表達(dá)，并且只有通過(guò)重組方法才誘導(dǎo)出可檢測(cè)的酶Ex 的表達(dá)。
相應(yīng)地，下面所使用的表述"降低的酶E,的活性"優(yōu)選地是指，降低為至少0. 5倍， 特別優(yōu)選地至少0. 1倍，更優(yōu)選地至少0. 01倍，更加優(yōu)選地至少0. 001倍和最優(yōu)選地至少 0. 0001倍的活性。特定酶的活性的降低可以例如通過(guò)定向突變，通過(guò)添加競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng) 性抑制劑，或者通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于降低特定酶的表達(dá)的其他措施來(lái)實(shí)現(xiàn)。
依照根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式，除了增加的酶E工的活性外，該細(xì)胞還 具有增加的下述酶E2至E8中至少一種酶的活性
-酶E^其催化兩個(gè)乙酰輔酶A單元轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶A ;
-酶E3，其催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為3-羥基丁酸酯；
-酶E4，其催化3-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)化為巴豆酰輔酶A ;
-酶^，其催化乙基丙二酰輔酶八轉(zhuǎn)化為甲基琥珀酰輔酶八；
-酶^，其催化甲基琥珀酰輔酶八轉(zhuǎn)化為中康酰輔酶八；
-酶E7，其催化中康酰輔酶A轉(zhuǎn)化為|3 _甲基蘋果酰輔酶A ;
-酶Es，其催化13-甲基蘋果酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙醛酸和丙酰輔酶A。
在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中除了酶^的活性 夕卜，下列酶或酶組合的活性也是增加的E2 、 E3 、 E4 、 E5 、 E6、 E7、 E8、 E2E3 、 E2E4、 E2E5 、 E2E6、 E2E7 、 E2E8、 、 、 、 G3E!7 、 E3E!8 、 E4E!5 、 E4E!6 、 E4E!7 、 E4E!8 、 E5E!6 、 E5E!7 、 E5E!8 、 、 E6E!8 、 E7E!8和E2E!3E!4E!5E!6E!7E!8 。
在此，原則上可能的并且也優(yōu)選的是，使用其野生型已經(jīng)具有一種前述酶活性或任選地已 經(jīng)具有所有前述酶活性的細(xì)胞，例如類球紅細(xì)菌，然后在該野生型中通過(guò)重組方法只提高
酶&的活性，或者除此之外另外還提高酶活性E2至E8中的一種酶活性、多種酶活性或所有 酶活性。原則上，也可以使用這樣的細(xì)胞，所述細(xì)胞的野生型不具有上述酶活性^至Es中
的任一種，并且然后在所述細(xì)胞中借助于重組方法來(lái)提高所有這些活性。 在這種情況下，特別優(yōu)選的是， 酶E2為|3 -酮硫解酶(EC 2. 3. 1. 9)， 酶E3為乙酰乙酰輔酶A還原酶(EC 1. 1. 1. 36)， 酶E4為烯酰輔酶A水合酶(EC 4. 2. 1. 17)， 酶E5為乙基丙二酰輔酶A變位酶(EC 5. 4. 99. 2)， 酶E6為甲基琥珀酰輔酶A脫氫酶， 酶E7為中康酰輔酶A水合酶，禾口 酶E8為13 -甲基蘋果酰/L-蘋果酰輔酶A裂合酶。 優(yōu)選地，酶E2由選自下列的基因編碼acatl、 acat2、 loc484063、 loc489421、 mgc69098、 mgc81403、 mgc81256、 mgc83664、 kat_l、 erg10、 ygeF、 atoB、 fadAx、 phbA-l、 phbA-2、 atoB-2、 pcaF、 pcaF-2、 phb-A、 bktB、 phaA、 tioL、 thlA、 fadA、 paaj、 phbAf 、 pimB、 mmgA 、 yhfS 、 th1、 vraB 、 th1、 mvaC 、 th i L 、 paaJ 、 fadA3 、 fadA4 、 fadA5 、 fadA6 、 eg112392 、 catF 、 sc8f4. 03、 thiLl、 thiL2、 acaBl、 acaB2、 acaB3或acaB4，其中，acatl、 acat2、 atoB禾口 phbA 以及來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因是特別優(yōu)選的。 優(yōu)選地，酶E3由選自下列的基因編碼phbB、 fabG、 phbNl、 phbB2或cgl 12444，其 中，phbB以及來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因是特別優(yōu)選的。 優(yōu)選地，酶E4由選自下列的基因編碼echSl、ehhadh、hadha、echsl-prov、cg4389、 cg4389、 cg6543、 cg6984、 cg8778、 ech-l、 ech-2、 ech-3、 ech-4、 ech-5、 ech-6、 ech-7、FCAALL 314、fcaall. 21、fox2、ecil、eci2、paaF、paaG、yfcX、fadB、faoA、rpfF、phaA、phaB、 echAl、 echA2、 echA3、 echA4、 echA5、 echA6、 echA7、 echA8、 echA9、 echA9、 echA 10、 echAll、 echA12、 echA13、 echA14、 echA15、 echA16、 echA17、 echA18、 echA19、 echA20、 echA21、 fad-l、 fad-2、 fad-3、 fad-4、 fad-5、 dcaE、 hcaA、 fadj、 rsp0671、 rsp0035、 rsp0648、 rsp0647、 rs03234、 rs03271、 rs04421、 rs04419、 rs02820、 rs02946、 paaGl、 paaG2、 paaG3、 ech、 pksH、 ydbS、eccHl、eccH2、pimF、fabJl、fabJ2、caiD2、ysiB、yngF、yusL、fucA、cgl0919、scf41. 23、 scd10. 16、sckl3. 22、scp8. 07c、stbacl6h6. 14、sc5f2a. 15、sc6a5. 38、hbd-l、hbd-2、hdb-3、 hdb-4、 hdb-5、 hdb-6、 hdb-7、 hdb-8、 hdb-9、 hdb-10、 p朋F-l、 p肌F-2、 p朋F-3、 p肌F-4、 paaF-5、paaF-6、paaF-7和crt，其中，來(lái)自類球紅細(xì)菌的相應(yīng)基因是特別優(yōu)選的。
酶E5的合適的基因選自mut 、mutA、mutB、 sbm、 sbmA、 sbmB、 sbm5 、bhbA、mcmA、mcmA 1 、 mcmA2、mcmB、mcml、mcm2、mcm3、 icmA、meaAl禾口 meaA2，其中，來(lái)自類5求紅細(xì)菌的相應(yīng)基因在 此仍是特別優(yōu)選的。 酶Ee、E7和E8的優(yōu)選的基因特別為來(lái)自類球紅細(xì)菌的關(guān)于這些酶的基因。 酶E2至E8的上述基因以及其他基因的核苷酸序列的實(shí)例尤其還可以從KEGG數(shù)據(jù)
庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。 依照根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案(其中酶E工
的活性以及任選地還有酶E2至E8中的一種酶、多種酶或所有酶的活性被提高)，所述細(xì)胞
另外還具有提高的下述酶E9至E12中一種或多種酶的活性-酶E9，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A ;-酶Ew其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸；-酶En，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；-酶Ew其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。 在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中除了酶^的活性
以及活性E2至E8中的一種或多種活性外，下列酶或酶組合的活性也是增加的E9、 E1Q、 En、
E12、 ￡^￡^0、 EgE!n、 E9E12、 E^。Eu、 E10E12、 ￡!^￡^2、 EgE^oEm E9E10E!12、 ￡^￡^￡^2、 ￡^?！?^￡^2和EgE^oEnE^y其
中，組合E9E1QEnE12是最優(yōu)選的。 在這種情況下，特別優(yōu)選的是， 酶E9為丙酰輔酶A羧化酶(EC 6. 4. 1. 3)， 酶E1Q為甲基丙二酰輔酶A水解酶(EC 3. 1. 2. 17)， 酶En為醛脫氫酶(EC 1. 2. 1. 3)或醛氧化酶(EC 1. 2. 3. 1)，和 酶E12為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1. 1. 1. 31)或3_羥基?；o酶A脫氫酶(EC
1. 1. 1. 35)。 原則上，可以考慮使用四個(gè)相互獨(dú)立的酶E9至E12，或者使用酶復(fù)合物，憑借所述 酶復(fù)合物，能夠進(jìn)行上面由酶E9至E12產(chǎn)生的反應(yīng)中的至少兩種反應(yīng)。特別地，在此應(yīng)當(dāng)提 及這樣的酶復(fù)合物，其不僅催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸，而且催化隨后甲基 丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛。 酶Eg的合適的基因選自pccA、pccB、accDl、accD、rs03236、accB、accC、pycA、ygjD、 yngE、 pcc、 accA2、 accDl、 accD2、 accD3、 accD4、 accD5、 accD6、 bccAl、 pccBl、 pccB4、 pccB5、 cgl10707、 cgl10708、 cgl12870、 dtsR、 dtsRl、 dtsR2、 scd10. 12、 scd10. 13、mccB和mmdA，其中，pccA和pccB是特別優(yōu)選的。 優(yōu)選地，酶E1Q由aoxl基因編碼。來(lái)自大鼠肝臟的甲基丙二酰輔酶A水解酶例如 描述于Kovachy等人，〃 Recognition, isolation, andcharacterization of rat liver D_methylmalonyl coenzyme Ahydrolase〃 ，J. Biol. Chem. 258 (1983)，第11415-11421頁(yè)。
優(yōu)選地，酶En由選自下列的基因編碼acatl、 acat2、 loc484063、 loc489421、 mgc69098、 mgc81403、 mgc81256、 mgc83664、 kat_l、 erg10、 ygeF、 atoB、 fadAx、 phbA-l、 phbA-2、 atoB-2、 pcaF、 pcaF-2、 phb-A、 bktB、 phaA、 tioL、 thlA、 fadA、 paaj、 phbAf 、 pimB、 mmgA、 yhfS、 thl、 vraB、 thl、 mvaC、 thiL、 fadA3、 fadA4、 fadA5、 fadA6、 cgl12392、 catF、 sc8f4. 03、 thiU、 thiL2、織B1、織B2、織B3或織B4，其中織tl、織t2禾口 atoB是特別 優(yōu)選的。 酶E12的合適的基因選自hibadh、cgl5093、cgl5093、cg4747、mwL2. 23、tl3kl4. 90、 f 19bl5. 150、 hibA、 ygbj、 mmsB、 garR、 tsar、 mmsB-l、 mmsB-2、 yf jR、 ykwC、 ywjF、 hibD、 glxR、 SCM1. 40c、 ehhahd、 hadh2、 hadhsc、 hsdl7B4、 1oc488110、 had、 mgC81885、 hadh2-prov、 cg3415、 cg7113、 ech-l、 ech-8、 ech-9、 a rd-l、 yfcX、 fadB、 faoA、 fadB2x、 hbd-l、 hbd-2、 hbd-3、 hbd-4、 hbd-5、 hbd-6、 hbd-7、 hbd-8、 hbd-9、 hbd-10、 fadj、 rs04421、 rs02946、 rs05766、 bbsD、 bbsC、 fadBl、 fadB2、 fadB5、 hbdA、 pimF、 fabj-l、 fabj、 scbacl9f3. 11、 sci35.13、 scbac8d1. 10c、 sc5f2a.15、 sc6a5.38、 fadC2、 fadC4、 fadC5、 fadC6、 had禾口 paaH。其他合適的3-羥基異丁酸脫氫酶例如描述于下列文獻(xiàn)中Banner jee等人，(1970)， J. Biol. Chem， 245，第1828至1835頁(yè);Steele等人，(1992) ， J. Biol. Chem. ， 267，第13585 至13592頁(yè)；Harris等人，(1988) ， J. Biol. Chem. ，263，第327至331頁(yè)；Harris等人， Biochim. Biophys. Acta， 1645 (1)，第89至95頁(yè)；Hawes等人，(2000) ， Methods Enzymol.， 324，第218至228頁(yè)；Harris等人，J. Biol. Chem. ， 275 (49)，第38780至38786頁(yè)；Rougraff 等人，(1988) ， J. Biol. Chem. ， 263 (1)，第327至331頁(yè)；Robinson等人，J. Biol. Chem. ， 225， 第511至521頁(yè)；Hawes等人，(1995) ， Biochemistry, 34，第4231至4237頁(yè)；HasegawaJ. (1981) ， Agric. Biol. Chem. ， 45，第2805至2814頁(yè)；Hawes等人，(1996) ， FEBS Lett. ， 389， 第263至267頁(yè)；Hawes等人，(1996) ， Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism, Plenum Press, New York，第395至402頁(yè)；Adams等人，(1994) ， Structure, 2，第651至668頁(yè)；Zhang等人，(1999) ，Biochemistry, 38，第11231至11238頁(yè)；Mirny等 人，(1999)， J.Mol.Biol. ，291，第177至196頁(yè)；和Lokanath等人，(2005)， J Mol Biol.。 這些出版物的公開內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開內(nèi)容的一部分。
依照根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案(其中酶 活性E9至E12中的一種或多種酶活性被提高)，酶Eu由選自下列序列的DNA序列編碼
A)根據(jù)SEQ ID NO :03的序列， B)無(wú)內(nèi)含子的序列，其衍生自根據(jù)A)的序列并且與根據(jù)SEQ IDN0 :03的序列編 碼相同的蛋白質(zhì)或肽， C)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO :04的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的序列， D)與根據(jù)組A)至C)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組A)的序列至少80%，特別優(yōu)選地至
少90% ，更優(yōu)選地至少95%和最優(yōu)選地至少99%同一的序列，其中所述序列優(yōu)選地編碼能
夠?qū)⒓谆嵋约氨岱謩e轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的半醛即甲基丙二酸半醛和丙二酸半醛的蛋白質(zhì)或肽， E)與根據(jù)組A)至D)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組A)的序列的反義鏈雜交或者在考慮
遺傳密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交的序列，其中所述序列優(yōu)選地編碼能夠?qū)⒓谆?br> 二酸以及丙二酸分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的半醛即甲基丙二酸半醛和丙二酸半醛的蛋白質(zhì)或肽， F)根據(jù)組A)至D)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組A)的序列的衍生物，其通過(guò)至少1個(gè)堿
基，優(yōu)選地至少2個(gè)堿基，更優(yōu)選地至少5個(gè)堿基和最優(yōu)選地至少10個(gè)堿基，然而優(yōu)選地不
多于100個(gè)堿基，特別優(yōu)選地不多于50個(gè)堿基和最優(yōu)選地不多于25個(gè)堿基的置換、添加、
倒位和/或刪除而獲得，其中所述衍生物優(yōu)選地編碼能夠?qū)⒓谆嵋约氨岱謩e轉(zhuǎn)
化為相應(yīng)的半醛即甲基丙二酸半醛和丙二酸半醛的蛋白質(zhì)或肽，G)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍之內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID NO :03的序列，以及H)具有SEQ ID NO :03的中性有義突變的序列。 上面所描述的核酸序列為來(lái)自Sulfolobus tokodaii的關(guān)于甲基丙二酰輔酶A還 原酶或丙二酰輔酶A還原酶的基因，它們能夠特別有效地將甲基丙二酸或丙二酸轉(zhuǎn)化為相 應(yīng)的半醛。該酶不僅實(shí)行酶E1Q的活性，而且實(shí)行酶Eu的活性。 依照根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，所述細(xì)胞 因而相比于其野生型而言至少具有增加的酶E工和En的活性，其中，酶E工由根據(jù)備選項(xiàng)a) 至h)之一的DNA序列編碼，和酶En由根據(jù)備選項(xiàng)A)至H)之一的DNA序列編碼。在這種情 況下，如果這兩種酶的活性的增加是以這樣的方式達(dá)到的，即具有SEQ ID N0:02和SEQ ID NO :04的多肽，或者與根據(jù)SEQ ID NO :02和SEQ ID NO :04的氨基酸序列具有至少50%， 優(yōu)選地至少55 % ，更優(yōu)選地至少60 % ，更加優(yōu)選地至少65 %和最優(yōu)選地至少70 %同一性的 氨基酸序列在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，那么這是優(yōu)選的。在此，這兩種DNA序列可以整合到細(xì)胞的基 因組中，或者存在于細(xì)胞內(nèi)的載體上。 依照根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式的第二個(gè)特別的實(shí)施方案(其中酶E! 的活性以及任選地還有酶E2至E8中的一種酶、多種酶或所有酶的活性被提高)，所述細(xì)胞 另外還具有提高的下述酶E13和E12中一種或多種酶的活性
-酶Eu，其催化丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛；
-酶Ew其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。 在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中除了酶^的活性 以及活性E2至E8中的一種或多種活性外，下列酶或酶組合的活性也是增加的E12、 E13和 E12E13 ，其中，組合E12E13是最優(yōu)選的。
在這種情況下，特別優(yōu)選的是， 酶E^為甲基丙二酸半醛脫氫酶(EC 1.2.1. 27)，和 酶E^為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3-羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC 1. 1. 1. 35)。優(yōu)選地，酶E13的合適的基因選自aldh6al、 cgl7896、 t22cl2. 10、 ald6、 putAl、 mmsA、mmsA—l、mmsA—2、mmsA—3、mmsA—4、msdA、 iolA禾口 iolAB，其中，mmsA是特另U優(yōu)選的。
優(yōu)選地，酶E^的合適的基因?yàn)橐呀?jīng)在上文中在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化 形式的第一個(gè)特別的實(shí)施方案方面被提及的那些。 酶E^和E^的上述基因的核苷酸序列尤其還可以從KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。
此外，在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式方面，優(yōu)選的是使用這樣的細(xì)胞，所 述細(xì)胞能夠特別良好地通過(guò)絲氨酸循環(huán)來(lái)利用C「碳源。在此，開頭已經(jīng)提及的甲基營(yíng)養(yǎng) 微生物和甲烷營(yíng)養(yǎng)微生物仍是特別優(yōu)選的。 依照根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第二種變化形式，除了增加的酶E工的活性外，所述細(xì)胞
還具有增加的下述酶E14、 E15和E1Q至E12中至少一種酶的活性-酶Ew，其催化P-丙氨酸轉(zhuǎn)化為P-丙氨酰輔酶A，-酶￡15，其催化P-丙氨酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙烯酰輔酶A，-酶E1Q，其催化甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸，-酶En，其催化甲基丙二酸轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛，-酶Ew其催化甲基丙二酸半醛轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。 在此，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的細(xì)胞為這樣的細(xì)胞，在所述細(xì)胞中除了酶^的活性
外，下列酶或酶組合的活性也是增加的EM、Ew、Ei。、En、E『EME^EME,EMEn、EME『EwE,
Ei5En、EA、EioEn、E^2、EnE。和E14E15E10EUE12。在此，原則上可以使用已經(jīng)能夠形成特別
大量的丙烯酰輔酶A的細(xì)胞。 在這種情況下，特別優(yōu)選的是， 酶E14為輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC 2. 8. 3. 1)或輔酶A合成酶，優(yōu)選地輔酶A轉(zhuǎn)移酶， 酶E15為13 -丙氨酰輔酶A銨裂合酶(EC 4. 3. 1. 6)， 酶Ew為甲基丙二酰輔酶A水解酶(EC 3.1.2.17)， 酶En為醛脫氫酶(EC 1. 2. 1. 3)或醛氧化酶(EC 1. 2. 3. 1)，禾口 酶E^為3-羥基異丁酸脫氫酶(EC 1.1.1.31)或3_羥基酰基輔酶A脫氫酶(EC
1. 1. 1. 35)。 優(yōu)選的具有輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的酶E14為來(lái)自埃氏巨球菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸梭菌(Clostridium propionicum)、克氏梭菌(Clostridium kluyveri)的 那些，以及來(lái)自大腸桿菌的那些。作為編碼輔酶A轉(zhuǎn)移酶的DNA序列的實(shí)例，在此可提及在 WO-A-03/062173中標(biāo)稱為SEQ ID NO :24的來(lái)自埃氏巨球菌的序列。其他優(yōu)選的酶為那些 在WO-A-03/062173中所描述的輔酶A轉(zhuǎn)移酶的變體。 具有13 -丙氨酰輔酶A銨裂合酶活性的合適的酶E15例如為來(lái)自丙酸梭菌的那 些。編碼這樣的酶的DNA序列可以例如從丙酸梭菌中獲得，如在WO-A-03/062173的實(shí)施 例10中所描述的那樣。編碼來(lái)自丙酸梭菌的P-丙氨酰輔酶A銨裂合酶的DNA序列在 WO-A-03/062173中被指定為SEQ ID NO :22。 酶E1Q至E12的合適的基因已經(jīng)在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式方面提及 了，在此，在第二種變化形式方面也優(yōu)選的是，上文所描述的來(lái)自Sulfolobus tokodaii的 基因是特別優(yōu)選地作為酶En的基因。 此外，在根據(jù)本發(fā)明的方法的第二種變化形式方面，如果除了酶EJ勺活性、酶E2至 E8中一種或多種酶的活性以及酶E14、 E15和E9至E12中一種或多種酶的活性提高外，所述細(xì) 胞還具有下列特性中的至少一種特性，優(yōu)選地兩種特性，那么這可以是有利的
-相比于其野生型而言增加的酶E16a或酶E16b (然而優(yōu)選的是E16a)的活性，所述酶 E16a催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，所述酶E16b催化磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，以及
-增加的酶Eu的活性，所述酶En催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化為P-丙氨酸。
酶E^優(yōu)選地為羧化酶，特別優(yōu)選地為催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸的丙酮 酸羧化酶(EC-編號(hào)6.4. 1. 1)。在這方面特別優(yōu)選的丙酮酸羧化酶為在"A novel methodology employing Corynebacteriumglutamicum genome information to generate a new L_lysine_producing mutant. 〃 ， Ohnishi J等 人，Applied Microbiology andBiotechnology, Vol. 58 (2)，第217-223頁(yè)(2002)中所描述的那些突變體。在該突變 中，第458位處的氨基酸脯氨酸被絲氨酸替代。該出版物關(guān)于制備丙酮酸羧化酶突變體的 可能性的公開內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開內(nèi)容的一部分。
酶En優(yōu)選地為脫羧酶，特別優(yōu)選地為谷氨酸脫羧酶或天冬氨酸脫羧酶，其中l(wèi)-天 冬氨酸-l-脫羧酶(EC-編號(hào)4. 1. 1. 11)是最優(yōu)選的，其由panD基因編碼。天冬氨酸脫羧酶 催化天冬氨酸轉(zhuǎn)化為P-丙氨酸。尤其已從大腸桿菌中(FEMS Microbiology Letters, 143， 第247-252頁(yè)(1996)， 〃 Photorhabdus luminescens subsp丄a咖ondii， Mycobacterium bovis subsp.Bovis〃 )以及從眾多的其他微生物中克隆出了天冬氨酸脫羧酶的基因 (panD基因)，并進(jìn)行了測(cè)序。特別地，來(lái)自谷氨酸棒桿菌的panD基因的核苷酸序列在 DE-A-19855313中進(jìn)行了描述。原則上，可以使用具有任何想得到的來(lái)源的panD基因，不 論來(lái)自細(xì)菌、來(lái)自酵母還是來(lái)自真菌都是無(wú)關(guān)緊要的。此外，還可以使用panD基因的所有 等位基因，特別是還有由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性或通過(guò)功能中性有義突變而產(chǎn)生的那些等位基 因。除了來(lái)自谷氨酸棒桿菌的天冬氨酸脫羧酶外，根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的天冬氨酸脫羧酶 還為大腸桿菌突變體DV9(Vallari和Rock Journal of Bacteriology, 164，第136-142頁(yè) (1985))。該出版物關(guān)于上述突變體的公開內(nèi)容在此引入作為參考，并且構(gòu)成本發(fā)明公開內(nèi) 容的一部分。 用于制備經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的方法為解決開頭所述的任務(wù)作出了進(jìn)一步的 貢獻(xiàn)，所述方法包括提高細(xì)胞中酶E工的活性的步驟，所述酶E工由如開頭所定義的根據(jù)組a) 至h)之一的DNA序列編碼，或者所述酶E工具有帶有SEQ ID NO :02的氨基酸序列，或與根 據(jù)SEQ IDN0 :02的氨基酸序列享有至少50%，優(yōu)選地至少55%，更優(yōu)選地至少60%，更加 優(yōu)選地至少65%和最優(yōu)選地至少70%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，酶^的活性的提高 通過(guò)下列方式來(lái)實(shí)現(xiàn)將根據(jù)組a)至h)之一，優(yōu)選地組a)至f)之一的DNA序列作為外源 DNA序列引入細(xì)胞中，然后起始由該DNA序列所編碼的多肽的表達(dá)。 任選地，所述方法進(jìn)一步包括提高細(xì)胞中活性E2至En中的一種或多種活性，特別 是還有提高酶En的活性，所述酶En由如開頭所定義的根據(jù)組A)至H)之一的DNA序列編 碼，或者所述酶En具有帶有SEQID N0:04的氨基酸序列，或與根據(jù)SEQ ID NO :04的氨基 酸序列享有至少50%，優(yōu)選地至少55%，更優(yōu)選地至少60%，更加優(yōu)選地至少65%和最優(yōu) 選地至少70%同一性的氨基酸序列。 經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞也為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢獻(xiàn)，所述細(xì)胞是通過(guò)上 面所描述的方法而獲得的。 此外，上面所描述的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的用途也為解決開頭所述的任務(wù)作出了貢
獻(xiàn)，所述用途為用于制備乙基丙二酰輔酶A或甲基丙二酰輔酶A(其優(yōu)選地作為用于制備
3_羥基異丁酸的中間產(chǎn)物)，或者直接用于制備3-羥基異丁酸或其衍生物。 此外，用于制備3-羥基異丁酸或其衍生物的方法也為解決開頭所述的任務(wù)作出
了貢獻(xiàn)，所述方法包括下列步驟
-在從碳源形成3_羥基異丁酸的條件下，使上面所描述的根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞與包 含碳源例如碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、脂質(zhì)丄_纈氨酸或L-谷氨酸的培養(yǎng)基 相接觸；-純化如此獲得的3-羥基異丁酸或其衍生物。 可以以分批方法(分批培養(yǎng))或補(bǔ)料分批方法(給料方法)或重復(fù)補(bǔ)料分批方法 (重復(fù)給料方法)，使根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞連續(xù)地或不連續(xù)地與培養(yǎng)基相 接觸并因此進(jìn)行培養(yǎng)，以便產(chǎn)生上述的產(chǎn)物。還可以考慮半連續(xù)的方法，如在GB-A-1009370 中所描述的。關(guān)于已知的培養(yǎng)方法的概括描述在Chmiel的教科書("Bioprozesstechnik 1. Einf他r皿g in dieBioverfahrenstechnik 〃 (Gustav Fischer Verlag， Stuttgart， 1991))或Storhas的教禾斗書(〃 Bioreaktoren皿d periphereEinricht皿gen〃 ， Vieweg Verlag， Braunschweig/Wiesbaden，1994)中。 待使用的培養(yǎng)基必須以合適的方式滿足各菌株的要求。關(guān)于各種微生物的培養(yǎng) 基的描述包含在American Society for Bacteriology的手冊(cè)〃 Maruml of Methods for General Bacteriology" (WashingtonD. C. ， USA， 1981)中。 作為碳源，可以使用碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉 和纖維素，油和脂肪例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸和 亞油酸，醇類例如甘油和甲醇，烴類例如甲烷，氨基酸例如L-谷氨酸或L-纈氨酸，或者有機(jī) 酸例如乙酸。這些物質(zhì)可以單獨(dú)地或者作為混合物來(lái)進(jìn)行使用。特別優(yōu)選的是使用碳水 化合物，特別是單糖、寡糖或多糖(如在US 6， 01， 494和US 6，136，576中所描述的)，使用 C「糖，或者使用甘油。 再則，特別地，當(dāng)使用能夠通過(guò)絲氨酸循環(huán)來(lái)利用Q-碳源的這樣的細(xì)胞作為細(xì)胞 時(shí)，優(yōu)選的是，向培養(yǎng)基中添加諸如甲醇或甲烷的碳源。 作為氮源，可以使用有機(jī)含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米 漿、大豆粉和尿素，或者無(wú)機(jī)化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮 源可以單獨(dú)地或者作為混合物來(lái)進(jìn)行使用。 作為磷源，可以使用磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或者相應(yīng)的含鈉鹽。此外，培 養(yǎng)基還必須包含金屬鹽例如硫酸鎂或硫酸鐵，它們是生長(zhǎng)所必需的。最后，除了上面所述的 物質(zhì)外，還可以使用必需的生長(zhǎng)物質(zhì)例如氨基酸和維生素。另外，可以向培養(yǎng)基中添加合適 的前體。所述材料可以以單次添加的形式補(bǔ)充給培養(yǎng)物或者在培養(yǎng)期間以合適的方式供料 給培養(yǎng)物。 關(guān)于培養(yǎng)物的pH控制，可以以合適的方式使用堿性化合物例如氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氨或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。為了控制泡沫形成，可以使用防沫劑例如 脂肪酸聚乙二醇酯。為了維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性，可以向培養(yǎng)基中添加合適的具有選擇作用的 物質(zhì)例如抗生素。為了維持有氧條件，向培養(yǎng)物中輸入氧或含氧氣體混合物例如空氣。
培養(yǎng)溫度通常高于20。C，優(yōu)選地高于3(TC，它還可以高于4(rC，其中不超過(guò)95。C， 特別優(yōu)選地不超過(guò)9(TC和最優(yōu)選地不超過(guò)8(TC的培養(yǎng)溫度是有利的。
3-羥基異丁酸的純化可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何純化方法來(lái)進(jìn)行。因 而，為了首先將細(xì)胞與培養(yǎng)基分開，可以例如使用沉降、過(guò)濾或離心方法。可以通過(guò)萃取、蒸 餾或離子交換從去除了細(xì)胞的含3-羥基異丁酸的培養(yǎng)基中分離出3-羥基異丁酸。
依照根據(jù)本發(fā)明的方法的一個(gè)特別的實(shí)施方案，連續(xù)地從營(yíng)養(yǎng)液中純化出3_羥 基異丁酸，其中，在這方面進(jìn)一步優(yōu)選的是，也連續(xù)地進(jìn)行發(fā)酵，從而下列整個(gè)過(guò)程可以連 續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)物的酶促轉(zhuǎn)化，從而形成3-羥基異丁酸；以及從培養(yǎng)基中純化出3-羥基異 丁酸。為了從培養(yǎng)基中連續(xù)地純化出3-羥基異丁酸，將培養(yǎng)基連續(xù)地引導(dǎo)通過(guò)用于分離在 發(fā)酵中所使用的細(xì)胞的裝置，優(yōu)選地通過(guò)具有20至200kDa的排阻大小的過(guò)濾器，在其中發(fā) 生固/液分離。還可以設(shè)想使用離心機(jī)、合適的沉降裝置或這些裝置的組合，其中特別優(yōu)選 的是，首先通過(guò)沉降來(lái)分離出至少一部分細(xì)胞，隨后將從中部分地去除了細(xì)胞的培養(yǎng)基輸 送至超濾或離心裝置。 在分離出細(xì)胞之后，將在其3-羥基異丁酸比例方面經(jīng)富集的發(fā)酵產(chǎn)品輸送至優(yōu) 選地多步驟的分離設(shè)備。在該分離設(shè)備中，設(shè)置有多個(gè)相繼銜接的分離階段，從這些分離階 段中各自匯出被引回至第二個(gè)發(fā)酵罐的回輸管路。此外，從各個(gè)分離階段中引出排出管路。 單個(gè)分離階段可以根據(jù)電滲析、反滲透、超濾或納米過(guò)濾的原理進(jìn)行工作。通常，在單個(gè)分 離階段中涉及膜分離設(shè)備。基于發(fā)酵副產(chǎn)物和底物殘留物的類型和規(guī)模來(lái)選擇單個(gè)分離階 段。 現(xiàn)在，借助于非限制性的附圖和實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。

圖1顯示了由來(lái)自類球紅細(xì)菌的巴豆酰輔酶A還原酶/羧化酶催化的反應(yīng)。 圖2顯示了類球紅細(xì)菌中的乙基丙二酰輔酶A代謝途徑。 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式的一個(gè)特別的實(shí)施方案，其中巴 豆酰輔酶A還原酶/羧化酶催化巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A，并且其中隨后形成 的丙酰輔酶A經(jīng)由甲基丙二酸和甲基丙二酸半醛而轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第一種變化形式的另一個(gè)特別的實(shí)施方案，其中 巴豆酰輔酶A還原酶/羧化酶催化巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙基丙二酰輔酶A，并且其中隨后形 成的丙酰輔酶A經(jīng)由甲基丙二酸半醛而轉(zhuǎn)化為3-羥基異丁酸。 圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的第二種變化形式的一個(gè)特別的實(shí)施方案，其中巴 豆酰輔酶A還原酶/羧化酶催化丙烯酰輔酶A轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰輔酶A。
圖6顯示了在實(shí)施例2中所使用的表達(dá)質(zhì)粒的載體圖譜。
實(shí)施例 1.從類球紅細(xì)菌中分離基因組DNA 為了分離根據(jù)本發(fā)明的DNA，首先根據(jù)F.M.Ausubel等人，〃 Current Protocols in Molecular Biology" ， John Wiley and Sons, New York, 1987，從類球紅細(xì)菌中分離出 染色體DNA。在該DNA中鑒定出同源核酸序列，該同源核酸序列編碼與來(lái)自扭脫甲基桿菌的 巴豆酰輔酶A還原酶基因(ccr基因)78%同一，與來(lái)自山丘鏈霉菌的ccr基因41 %同一， 和與來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌的ccr基因39X同一的蛋白質(zhì)。通過(guò)使用合成的多核苷酸5' -GGA GGCAACCATGGCCCTCGA-CGTGCAGAG-3'(正向引物；在起始密碼子處的Ncol切割位點(diǎn)用下劃 線標(biāo)出)禾卩5' -GAGACTTGCGGATCCCTC-CGATCAGGC-CTTGC-3'(反向引物；在終止密碼子后 的BamHI切割位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)以及作為模板的來(lái)自類球紅細(xì)菌的分離的DNA，借助于 PCR來(lái)擴(kuò)增ccr基因(Mullis等人，ColdSpring Harbor Symp. Quant. Biol. ， 51，第263-273 頁(yè)，1986)。使用制備性PCR，其中采用Pfu聚合酶(Pfunds， Genaxxon) 。 Pfu聚合酶包含 3' -5'外切核酸酶("校正")功能。在此，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)為95t: 45秒，55°C 30秒，和72°C 3分鐘。在循環(huán)變溫器(Biometra，G6t t ingen )上進(jìn)行PCR。
2.制備表汰載體 分離在實(shí)施例1中獲得的PCR產(chǎn)物，并如在Kovach等人，〃 Fournew derivatives of the broad_host_range cloning vector pBBRlMCScarrying different antibiotic-resistance cassettes" ， Gene， 166，第175-176頁(yè)(1995)中所描述的，克隆 入pBBRlMCS-2表達(dá)載體中。為此，將在實(shí)施例1中于純化后獲得的DNA片段和表達(dá)載體 pBBRlMCS-2用酶Xho11和HindIII進(jìn)行限制酶切消化，然后進(jìn)行連接。然后，用該表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化感受態(tài)類球紅細(xì)菌細(xì)胞。
3. CCR的表汰和純化 為了在大腸桿菌中異源表達(dá)CCR以及純化CCR，將所述基因克隆入表達(dá)載體pET3d 中，從而獲得質(zhì)粒pTE13 :通過(guò)使用寡核苷酸ccr-fw (5' -GGAGGCAACCATGGCCCTCGACGTGCAG AG-3' ;NcoI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)和ccr-rev (5' -GAGACTTGCGGATCCCTCCGATCAGGCCTT GC-3' ;BamHI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)經(jīng)PCR來(lái)擴(kuò)增類球紅細(xì)菌ccr基因，其中使用類球 紅細(xì)菌菌株2. 4. 1 (DSMZ 158)的染色體DNA作為模板。將該P(yáng)CR產(chǎn)物作為NcoI/BamHI片 段連接到用NcoI/BamHI切割的載體pET 3d (Merck， Deutschland)中，從而獲得質(zhì)粒pTE13。 用pTE13轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞，并在200升的發(fā)酵罐(80升/分鐘的空氣 流；攪拌器轉(zhuǎn)速300rpm)中于37"C在含有100 y g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。 在00578 = 0. 75時(shí)，用0. 5mM異丙基硫代吡喃半乳糖糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)。將細(xì)胞培養(yǎng)3. 5 小時(shí)，然后收獲細(xì)胞并貯存在液氮中直至進(jìn)一步處理。 酶的純化在4°C下通過(guò)DEAE色譜法和親和層析以兩步來(lái)進(jìn)行。將9g冷凍的大腸桿 菌細(xì)胞重懸浮在兩倍體積的補(bǔ)充有O. lmg/1 DNA酶I的緩沖液A(20mM TriS-HCl，pH 7.9) 中。借助于在137MPa下兩次通過(guò)弗氏壓碎器來(lái)使懸浮液變碎，然后在100， 000g下離心1小 時(shí)。將15ml上清液(1. 6g總蛋白質(zhì))以2. 5ml/分鐘的流速加載至30ml DEAE-S印harose Fast Flow柱(Amersham Biosciences)(事先用60ml緩沖液A進(jìn)行平衡)上。然后，用90ml 緩沖液A洗滌所述柱，接著用135ml含有50mM KCl的緩沖液A進(jìn)行洗滌。195ml的總體積， 用在緩沖液A中的lOOmM KC1來(lái)洗脫下活性。匯集活性級(jí)分，脫鹽，并經(jīng)Amicon預(yù)10膜 (Millipore， Bedford, MA)通過(guò)超濾而濃縮至20ml的體積。將1. 5ml如此獲得的濃縮液 (17mg總蛋白質(zhì))以0. 5ml/分鐘的流速加載至10ml Cibacron blue 3GAAgarose 3000CL 柱(Sigma-Aldrich)上，該柱事先已用20ml緩沖液A進(jìn)行了平衡。該柱用22ml緩沖液A 洗滌兩次，接著用37ml含有l(wèi)OOmM KCl的緩沖液A和37ml含有200mM KCl的緩沖液A進(jìn) 行洗滌。以30ml的總體積，用在緩沖液A中的500mM KCl洗脫下活性。匯集活性級(jí)分，脫 鹽，并經(jīng)Amicon YM 10膜(Millipore， Bedford, MA)通過(guò)超濾而濃縮至1. 5ml的體積。將 蛋白質(zhì)(7. 5mg)在50^甘油中貯存于-2(TC。
4. CCR的活性的檢測(cè) 通過(guò)在360nm處監(jiān)測(cè)依賴于巴豆酰_CoA的NADPH的氧化，采用分光光度法來(lái)測(cè) 定CCR的活性。(e NADra = 3400M—^m—0 。使用壁層厚度為0. 1cm的比色杯。反應(yīng)混合物 (0. 2ml)包含lOOmM Tris-HCl (pH 7. 9) 、4mM NADPH、2mM巴豆酰-CoA和1-5 ii g純化的CCR。 通過(guò)添加33mM KHC03或NaHC03來(lái)起動(dòng)反應(yīng)。關(guān)于在實(shí)施例3中所獲得的酶的巴豆酰_CoA 轉(zhuǎn)化所測(cè)得的比活性為103U mg—、巴豆酰-CoA)。通過(guò)改變NaHC03(0 . 4—66 . 6mM)或巴豆
20酰-CoA(O. 125-2. 0mM)的濃度來(lái)測(cè)定巴豆酰_CoA和NaHC03的Km值。通過(guò)將[14C]碳酸氫 鹽摻入(酸穩(wěn)定的)乙基丙二酰-CoA中來(lái)測(cè)定NADPH的Km值。反應(yīng)混合物(0. 33ml)包 含lOOmM Tris-HCl (pH 7. 9) 、3mM巴豆酰-CoA、3mMNaHC03、64kBq ml,aH"C03和7 ii g純化 的CCR。通過(guò)添加NADPH(O. 125-5mM)來(lái)起動(dòng)反應(yīng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)處，通過(guò)將50 反應(yīng) 混合物轉(zhuǎn)移到50iU 1.5M HC1(^中來(lái)終止反應(yīng)。將樣品搖動(dòng)過(guò)夜以除去未摻入的14C02， 并且通過(guò)閃爍測(cè)量法來(lái)測(cè)定摻入的"C的量?？梢詼y(cè)得下列Km值巴豆酰-CoA(0.4mM); NADPH(0. 7mM) ;HC03—(l線pH 7. 9);乙基丙二酰-CoA(O. 2mM)。 此外，還用丙烯酰-CoA代替巴豆酰-CoA作為底物來(lái)測(cè)定了 CCR的活性。在此，CCR 催化下面的反應(yīng) 丙烯酰_CoA+NADra+C02 — (2S)-甲基丙二酰-CoA—+NADP+。 測(cè)試混合物(0. 12ml)包含80mM Tris 'HC1 (pH 7. 8) 、30mMNaHC03、4. 3mM NADPH禾口 5-10 ii g重組CCR。通過(guò)添加1. 3mM丙烯酰-CoA來(lái)起動(dòng)反應(yīng)。在360nm和3(TC下在0. lcm 厚的比色杯中測(cè)量吸收的變化。 關(guān)于丙烯酰-CoA的轉(zhuǎn)化，測(cè)得了大約45U mg—1的比活性。 在放射性測(cè)試中測(cè)量丙烯酰-CoA的表觀Km值，其中對(duì)14C02向丙烯酰-CoA中的摻 入進(jìn)行定量。在此，使丙烯酰-CoA的量發(fā)生變化，并通過(guò)閃爍法來(lái)測(cè)定相對(duì)的摻入速率。
測(cè)試混合物(0. 12ml)包含80mM Tris 'HC1 (pH 7. 8) 、30mMNaHC03、lOOkBq H14C03、 5. 2mM NADPH和5-10ii g重組ccr。通過(guò)添加0. 07-2. 2mM丙烯酰-CoA來(lái)起動(dòng)反應(yīng)。在30°C 下，在不同的時(shí)間點(diǎn)后(10-120秒)，從反應(yīng)混合物中取出25 ill樣品，向其中摻500 ill 5% TCA，并在12小時(shí)的"振蕩"后(以除去未固定的14C02)在閃爍計(jì)數(shù)器中進(jìn)行測(cè)量。測(cè) 得Km(丙烯酰-CoA) :0. 47mM。 5.用于在大腸桿菌中產(chǎn)生3-HIB的重組代謝途徑 為了用重組大腸桿菌細(xì)胞將C源甘油轉(zhuǎn)化為3-HIB，將7種不同酶的基因克隆到一 系列表達(dá)載體中。為此采用Duet載體(Merck, Deutschland)。這是具有四種表達(dá)載體的 系統(tǒng)，這些表達(dá)載體都是彼此相容的，而且具有不同的抗生素抗性標(biāo)記。
具體而言，為了將甘油轉(zhuǎn)化為3-HIB，將編碼下列酶的基因克隆到表達(dá)載體中
1.來(lái)自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脫水酶(EC 4. 2. 1. 30) (GD)。該酶催化甘油的依賴于腺苷酰鈷胺素的脫水而形成3-HPA(3-羥基丙醛)。它由3個(gè) 亞基(GD-a、GD-e和GD-Y)組成，這些亞基在肺炎克雷伯氏菌中由處于一個(gè)操縱子中的 3個(gè)基因(gldA、 gldB和gldC)編碼。 2.來(lái)自肺炎克雷伯氏菌的再活化因子。由于甘油使依賴于腺苷酰鈷胺素的甘油脫 水酶失活，因此為了將甘油轉(zhuǎn)化為3-HPA，另外還需要再活化因子的活性。來(lái)自肺炎克雷伯 氏菌的用于甘油脫水酶的再活化因子由基因gdrA和gdrB編碼。 3.來(lái)自大腸桿菌的醛脫氫酶AldH。為了將3-HPA轉(zhuǎn)化為3-羥基丙酸(3-HP)，擴(kuò) 增大腸桿菌aldH基因。 4.來(lái)自橙色綠屈撓菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙酰-CoA合酶(Pes)(由 基因pcs編碼)。丙酰-CoA合酶催化3-HP轉(zhuǎn)化為丙酰-CoA。它為三功能酶，并且包含三個(gè) 功能結(jié)構(gòu)域。?；?CoA合成酶(ACS)結(jié)構(gòu)域催化3-HP激活為3-羥基丙酰-CoA。在這之 后，Pes的烯酰-CoA水合酶(ECH)結(jié)構(gòu)域催化脫水為丙烯酰-CoA。最后，Pes的烯酰-CoA還原酶(ECR)結(jié)構(gòu)域催化丙烯酰-CoA的依賴于NADra的還原而形成丙酰-CoA。然而，該反 應(yīng)對(duì)于所描述的計(jì)劃而言是不相關(guān)的，因?yàn)樵诖酥虚g產(chǎn)物丙烯酰-CoA會(huì)立即進(jìn)一步地被 下一個(gè)酶(巴豆酰-CoA羧化酶/還原酶，見(jiàn)下文)轉(zhuǎn)化。 5.來(lái)自類球紅細(xì)菌的巴豆酰-CoA羧化酶/還原酶(酶E》(Ccr)(由基因ccR編
碼)。Ccr的主要活性是將巴豆酰-CoA還原羧化為乙基丙二酰-CoA。然而，該酶顯示出寬
的底物特異性，并非常有效地將丙烯酰-CoA轉(zhuǎn)化為甲基丙二酰-CoA。6.來(lái)自Sulfolobus tokodaii的丙二酰-CoA還原酶(Mcr， E10禾P En)(由基因mcr
編碼)。Mcr優(yōu)先催化依賴于NADPH的丙二酰-CoA的還原而形成丙二酸半醛。然而，它還
顯示出以甲基丙二酰-CoA作為底物的副活性，并將其轉(zhuǎn)化為甲基丙二酸半醛。 7.來(lái)自嗜熱棲熱菌(Thermus thermophi lus)的3_羥基異丁酸脫氫酶(E12)
(3-HIB-DH)(由基因MmsB編碼)。該酶催化甲基丙二酸半醛依賴于NADffl地可逆地轉(zhuǎn)化為
3-羥基異丁酸(3-HIB)。 在下文中詳細(xì)地描述了用于上面所描述的酶的異源過(guò)表達(dá)的克隆策略。
用于過(guò)表達(dá)甘油脫水酶再活化因子(GDRF)的質(zhì)粒pACYCDuet-KpGDRF的構(gòu)建
首先，借助于PCR來(lái)擴(kuò)增基因gdrA(異名0RF4)和gdrB(異名0RF2b)，它們編碼肺 炎克雷伯氏菌GDRF的兩個(gè)亞基。使用肺炎克雷伯氏菌菌株DSM2026的染色體DNA作為模 板。 使用下面的寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增gdrA :orf4fw(5' -TGA AGA TCC TAGGAG GTT TM ACA TAT GCC GTT AAT AGC CGG GAT TG-3')和orf4Salrv (5' -TAT ATA GTC GAC TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG-3' ;SalI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。 使用下面的寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增gdrB :orf2bPcifw(5' -TAT ATA ACATGT CGC TTT
CAC CGC CAG GC-3' ;PciI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)和orf2brv(5' -CAT ATG TTT AAA
CCT CCT AGG ATC TTC AGT TTC TCT CACTTA ACG GCA GG-3')。 隨后，將所獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)交叉PCR(Crossover-PCR)而融合在一起。 為此，使用下面的寡核苷酸orf2bNcofw(5' -TAT ATA CCA TGGCGC TTT CAC CGC
CAG GC-3' ;NcoI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)和orf4Salrv(5' -TAT ATA GTC GAC TTA ATT
CGC CTG ACC GGC CAG-3' ;SalI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。 根據(jù)制造商的說(shuō)明書，借助于Qiagen， Hilden的QIAquick-PCR純化試 劑盒來(lái)純化PCR產(chǎn)物(2220bp)，并連接到載體pCR-Bluntll-TOPO中，從而獲得 pCR_BluntII_Topo_KpGDRF載體。根據(jù)制造商Invitrogen Corporation, Carlsbad (Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑盒)的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行連接以及隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中。
然后，通過(guò)用Pcil和Sail消化pCR-Bluntll-Topo-KpGDRF而將GDRF序列 從該載體中切出，并連接到用NcoI和Sal I切割的pACYC-Duet表達(dá)載體中，從而獲得 pACYCDuet-KpGDRF(6142bp)。 用于過(guò)表達(dá)肺炎克雷伯氏菌甘油脫水酶(GD)和大腸桿菌醛脫氫酶AldH的質(zhì)粒 pAS50_Ec_aldH的構(gòu)建 肺炎克雷伯氏菌GD的三個(gè)亞基天然地組織在一個(gè)操縱子中(基因gldA、 gldB和 gldC)。借助于PCR來(lái)擴(kuò)增它們，其中仍使用肺炎克雷伯氏菌DSM2026的染色體DNA作為模 板。
使用下面的寡核苷酸來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增KpGDNdefw(5' -TAT ATA CAT ATGAAA AGA TCA AAA CGA TTT GCA GTA CTG G-3' ;NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)和KpGDSalrv (5' -TAT ATA GTC GAC TTA GCT TCC TTT ACG CAGCTT ATG C-3' ;SalI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)。
將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到載體pCR-Bluntll-TOPO中，從而獲得pCR-Bluntll-Topo-KpGD 載體。根據(jù)制造商Invitrogen Corporation, Carlsbad (Zero Blunt TOPO PCR克隆試劑 盒)的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行連接以及隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細(xì)胞中。 用Xbal (通過(guò)Klenow補(bǔ)平而使成為平端)和Ndel從載體pCR-BluntII-Topo-KpGD 中切出GD編碼片段，并連接到用Ndel和EcoRV切割的pET-Duet表達(dá)載體中，從而獲得質(zhì) 粒pAS50(8161bp)。 隨后，擴(kuò)增大腸桿菌aldH基因。為此，使用大腸桿菌K12的染色體DNA作為模 板，使用寡核苷酸1228_ald_fp (5' -AAAACATATGAATTTTCATCATCTGGCTTACTGG-3' ;NdeI識(shí) 別序列用下劃線標(biāo)出)和1228_ald_rp(5' -AAAACATATGTATATTTCCTTCTTTCAGGCCTCCAGGC TTATCCAGATG-3' ;NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)作為PCR引物。在凝膠上來(lái)純化PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物，然后通過(guò)Ndel消化連接到質(zhì)粒pAS50的Ndel位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pAS50_Ec_ aldH(9666bp)。 用于過(guò)表達(dá)橙色綠屈撓菌丙酰-CoA合酶(Pes)以及類球紅細(xì)菌巴豆酰-CoA羧化 酶/還原酶(CCR)的質(zhì)粒pCDFDuet-l_Rs_ccR_Cau_pcs的構(gòu)建 從pTE13 (參見(jiàn)實(shí)施例3)中，將ccr基因再次作為NcoI/BamHI片段轉(zhuǎn)克隆到質(zhì)粒 pCDFDuet-l (Merck， Deutschland)的NcoI/BamHI切割位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pCDFDuet_l_ Rs_ccr。 然后，用寡核苷酸1228—Cau—pcs—fp(71) (5' -AAAACATATGATCGACACTGCGCCCCTTGC -3' ;NdeI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)和1228_Cau_pcs_rp (74) (5' -AAGACGTCCTACCGCTCGCC GGCCGTCC-3' ;AatII識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)通過(guò)PCR擴(kuò)增出橙色綠屈撓菌pes基因，其 中使用橙色綠屈撓菌菌株0K-70-fl(DSM 636)的染色體DNA作為模板。在通過(guò)凝膠提取進(jìn) 行純化后，通過(guò)Ndel/Aatll消化將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到經(jīng)相應(yīng)切割的載體pCDFDuet-l_Rs_ccr 中，從而獲得質(zhì)粒pCDFDuet-l_Rs_ccR_Cau_pcs (10472bp)。 用于過(guò)表達(dá)Sulfolobus tokodaii丙二酰-CoA還原酶(Mcr)以及嗜熱棲熱菌 3_羥基異丁酸脫氫酶(3-HIB-DH)的質(zhì)粒PCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg的構(gòu)建
首先，通過(guò)基因合成來(lái)制備在谷氨酸棒桿菌的密碼子使用方面經(jīng)適應(yīng)調(diào)整的 S. tokodaii基因mcr的變體(St_mcr_oCg)。在GeneArt公司(Deutschland)進(jìn)行合成， 并且以質(zhì)粒pGA4—匪CoAILST(SEQ IDNO :5)的形式提供人工基因St_mcr_oCg。使用pGA4_ MMCoAR_ST DNA作為PCR模板，以便用寡核苷酸1228_MMCoAR_fp (5' -AACCATGGGCCGCACCCT GAAGG-3' ;NcoI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)禾P 1228_MMCoAR_rp (5' -AAGGATCCTTACTTTTCGA TGTAGCCCTTTTCC-3' ;BamHI識(shí)別序列用下劃線標(biāo)出)來(lái)擴(kuò)增人工基因St_mcr_oCg。在通 過(guò)凝膠提取進(jìn)行純化后，用NcoI/BamHI消化擴(kuò)增產(chǎn)物，并連接到質(zhì)粒pCOLADuet_l (Merck, Deutschland)的相應(yīng)切割位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì)粒pCOLADuet_St_mcr_oCg。
同樣地，通過(guò)基因合成(GeneArt， Deutschland)提供了在谷氨酸棒桿菌的密 碼子使用方面經(jīng)適應(yīng)調(diào)整的嗜熱棲熱菌基因MmsB(編碼3-HIB-DH)的變體，即以質(zhì)粒 pGA4_3HIBDH_TT(SEQ ID NO :6)的形式。使用pGA4_3HIBDH_TT作為PCR模板，以便用寡核苷酸1228_Tth_HIBDH_fp(5' -AAAACATATGGAAAAGGTGGCATTCATCG-3' ;NdeI識(shí)別序列用下 劃線標(biāo)出)禾卩1228_Tth_HIBDH_rp (5' -AAAAGATCTTTAGCGGATTTCCACACCGCC-3' ;Bgl11識(shí) 別序列用下劃線標(biāo)出)來(lái)擴(kuò)增人工基因Tth_HIBDH_oCg。在凝膠提取后，用Ndel/Bglll切 割擴(kuò)增產(chǎn)物，并連接到質(zhì)粒pCOLADuet_St_mcr_oCg的Ndel/Bglll切割位點(diǎn)中，從而獲得質(zhì) 粒pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg(5620bp)。 然后，根據(jù)制造商的方案，將4種質(zhì)粒pACYCDuet-KpGDRF、 pAS50_Ec_aldH、 pCDFDuet-l_Rs_ccR_Cau_pcs和pCOLADuet_St_mcr_oCg_Tth_HIBDH_oCg共轉(zhuǎn)化到商購(gòu)可 得的通過(guò)化學(xué)方法成為感受態(tài)的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Merck，Deutschland)中。在補(bǔ) 充有氨芐青霉素(25 g/ml)、氯霉素(17 g/ml)、卡那霉素(15 y g/ml)和鏈霉素(25 y g/ ml)的LB瓊脂上進(jìn)行選擇。
6. ^掘木干舯表汰戯立白勺i紹 將在實(shí)施例5中所描述的攜帶有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株在經(jīng)修飾的M9培養(yǎng)基 (6. 8g/l Na2HP04x 2H20 ;3g/l KH2P04 ;0. 5g/l NaCl ;lg/l NH4C1 ;1. 25g/l酵母提取物； 1% v/v甘油；15mg/1 CaCl2x2H20 ;250mg/1 MgS04x 7H20;l%v/v Gibco MEM維生素溶液； 41. 9g/l MOPS)中進(jìn)行培養(yǎng)。該培養(yǎng)基補(bǔ)充有氨芐青霉素(25 g/ml)、氯霉素(17 y g/ml)、 卡那霉素(15 g/ml)和鏈霉素(25 g/ml)。于37。C在溫控?fù)u床上進(jìn)行整個(gè)培養(yǎng)(預(yù)培養(yǎng) 和主培養(yǎng))。首先，將菌株在5ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。然后，從過(guò)夜培養(yǎng)物中，以1 : 20的 比例將20ml培養(yǎng)基接種到100ml的帶擋板的瓶中，并繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到大約0. 8的 0D6。。時(shí)，添加6 ii M鈷胺素和1 y M IPTG，并繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。在該時(shí)間點(diǎn)，取出2. 5ml細(xì)胞 懸浮液，并貯存于_201:直至進(jìn)行分析。 可以借助于離子色譜法(IC)和電導(dǎo)檢測(cè)來(lái)進(jìn)行3-HIB的檢測(cè)和定量。為此，在室 溫下解凍2. 5ml的樣品，并離心(10分鐘，13， 200rpm)。使用噴霧過(guò)濾器(Spritzenf ilter) (孔徑大小0. 44 ii m)來(lái)純化上清液。用具有自動(dòng)進(jìn)樣器的Metrohm Compact IC 761進(jìn)行 測(cè)量。流動(dòng)相8mM Na0H。柱Dionex AS15 4x250mm，前置柱AG15 4x50mm。柱溫25。C。 流速1. 4ml/分鐘。注射體積:10 iU。
權(quán)利要求
分離的DNA，其選自下列序列a)根據(jù)SEQ ID NO01的序列，b)無(wú)內(nèi)含子的序列，其衍生自根據(jù)a)的序列并且與根據(jù)SEQ ID NO01的序列編碼相同的蛋白質(zhì)或肽，c)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO02的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的序列，d)與根據(jù)a)至c)的序列至少80％同一的序列，e)與根據(jù)組a)至d)之一的序列的反義鏈雜交或者在考慮遺傳密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交的序列，f)根據(jù)組a)至e)之一的序列的衍生物，其通過(guò)一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、添加、倒位和/或刪除而獲得，g)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍之內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID NO01的序列，h)具有SEQ ID NO01的中性有義突變的序列，以及i)與根據(jù)組a)至h)之一的序列互補(bǔ)的序列。
2. 載體，其包含權(quán)利要求1中所定義的根據(jù)組a)至h)之一的DNA序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的用途。
4. 經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其通過(guò)用根據(jù)權(quán)利要求2的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而獲得。
5. 分離的多肽，其具有帶有SEQ ID N0:02的氨基酸序列，或者當(dāng)在SEQ ID NO :02中 刪除、插入、置換至多10個(gè)氨基酸或?qū)⒅炼?0個(gè)氨基酸附加至帶有SEQ ID NO :02的氨基 酸序列的C-或N-末端時(shí)而獲得的氨基酸序列。
6. 細(xì)胞，所述細(xì)胞相對(duì)于其野生型而言如此地經(jīng)基因工程改造，從而與其野生型相比 較，它能夠形成更多的3-羥基異丁酸或其衍生物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的酶E工的活 性，所述酶E工由權(quán)利要求1中所定義的根據(jù)組a)至h)之一的DNA序列編碼。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含具有權(quán)利要求1中所定義的根據(jù)組 a)至h)之一的DNA序列的外源DNA。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有相比于其野生型而言增加的酶Eu的 活性，所述酶En由根據(jù)組A)至H)之一的DNA序列編碼A) 根據(jù)SEQ ID NO :03的序列，B) 無(wú)內(nèi)含子的序列，其衍生自根據(jù)A)的序列并且與根據(jù)SEQ ID N0:03的序列編碼相 同的蛋白質(zhì)或肽，C) 編碼包含根據(jù)SEQ ID NO :04的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的序列，D) 與根據(jù)組A)至C)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組A)的序列至少80%同一的序列，E) 與根據(jù)組A)至D)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組A)的序列的反義鏈雜交或者在考慮遺傳 密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交的序列，F(xiàn)) 根據(jù)組A)至D)之一，特別優(yōu)選地根據(jù)組A)的序列的衍生物，其通過(guò)至少一個(gè)堿基 的置換、添加、倒位和/或刪除而獲得，G) 在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍之內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID NO :03的序列，或者H) 具有SEQ ID NO :03的中性有義突變的序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4和6-9中之一的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞屬于類球紅細(xì)菌這一種類。
11. 用于制備經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的方法，其包括提高細(xì)胞中酶EJ勺活性的步驟，所 述酶E工由權(quán)利要求1中所定義的根據(jù)組a)至h)之一的DNA序列編碼，或者所述酶E工具有 帶有SEQ ID NO :02的氨基酸序列，或與根據(jù)SEQ ID NO :02的氨基酸序列享有至少50%同 一性的氨基酸序列。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述方法另外還包括提高細(xì)胞中酶En的活性的步 驟，所述酶En由權(quán)利要求9中所定義的根據(jù)組A)至H)之一的DNA序列編碼，或者所述酶 En具有帶有SEQ ID N0:04的氨基酸序列，或與根據(jù)SEQ ID NO :04的氨基酸序列具有至少 50%同一性的氨基酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中所述細(xì)胞屬于類球紅細(xì)菌這一種類。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中E工或En活性的提高通過(guò)增加編碼這些酶的基 因的拷貝數(shù)，特別是通過(guò)分別增加權(quán)利要求1或9中所定義的核酸序列的拷貝數(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
15. 經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，其通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求11-14之一的方法而獲得。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞相比于其野生型而言具有增加的編碼酶E工 和任選地酶En的基因的拷貝數(shù)，特別是增加的權(quán)利要求1或9中所定義的核酸序列的拷貝 數(shù)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求4、6-10以及15和16中之一的細(xì)胞用于制備3-羥基異丁酸或其衍 生物的用途。
18. 用于制備3-羥基異丁酸或其衍生物的方法，其包括下列步驟 -在從碳源形成3-羥基異丁酸或其衍生物的條件下，使根據(jù)權(quán)利要求4、6-10、15和16中之一的細(xì)胞與包含碳源例如碳水化合物、甘油、二氧化碳、甲烷、甲醇、脂質(zhì)、L-纈氨酸或 L-谷氨酸的培養(yǎng)基相接觸；-純化如此獲得的3-羥基異丁酸或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的DNA，其選自下列序列a)根據(jù)SEQ ID NO01的序列，b)無(wú)內(nèi)含子的序列，其衍生自根據(jù)a)的序列并且與根據(jù)SEQID NO01的序列編碼相同的蛋白質(zhì)或肽，c)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO02的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或肽的序列，d)與根據(jù)a)至c)的序列至少80％同一的序列，e)與根據(jù)組a)至d)之一的序列的反義鏈雜交或者在考慮遺傳密碼簡(jiǎn)并性的情況下將能夠與之雜交的序列，f)根據(jù)組a)至e)之一的序列的衍生物，其通過(guò)一個(gè)或多個(gè)堿基的置換、添加、倒位和/或刪除而獲得，g)在遺傳密碼簡(jiǎn)并性范圍之內(nèi)相應(yīng)于SEQ ID NO01的序列，h)具有SEQ ID NO01的中性有義突變的序列，以及i)與根據(jù)組a)至h)之一的序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明還涉及載體，所述載體用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的用途，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，多肽，相對(duì)于其野生型而言經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，用于制備經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞的方法，通過(guò)所述方法獲得的經(jīng)基因工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞的用途，以及用于制備3-羥基異丁酸或其衍生物的方法。
文檔編號(hào)C12P7/40GK101720356SQ200880010552
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2008年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者A·馬克斯, B·艾爾伯, G·?？怂? M·波特, T·J·厄布 申請(qǐng)人:贏創(chuàng)德固賽有限責(zé)任公司;阿爾貝特-路德維希斯弗賴堡大學(xué)