專利名稱：一種建立由自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎動物模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬肝臟免疫學(xué)和實驗動物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立由自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)介導(dǎo)的肝炎動物模型的方法。
背景技術(shù)：
肝炎是嚴(yán)重危害人民生命健康且死亡率較高的一種疾病，病因主要包括病毒感染、過度酒精攝入和服入化學(xué)毒物等造成肝臟實質(zhì)細(xì)胞的破壞，其致病機制復(fù)雜。其中肝臟免疫損傷備受關(guān)注，特別是肝臟淋巴細(xì)胞參與的病理損傷已經(jīng)成為多種肝炎發(fā)病機制中至關(guān)重要的事件。研究淋巴細(xì)胞如何參與肝臟損傷將有助于了解肝炎的致病機制，將促進肝臟疾病的預(yù)防及治療。由于人體肝臟標(biāo)本的缺乏以及體外研究的局限性，建立系列由免疫細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型模擬人類肝臟疾病將是首選方法。美國《臨床調(diào)查雜志》(Journal of Clinical Investigation，1992；90196-203)報道了由刀豆蛋白(concanavalin A)誘導(dǎo)的肝炎模型，該模型是將刀豆蛋白以15微克/克體重(μg/g.wt)靜脈注射BALB/c小鼠(中文簡稱小白鼠)，所致的肝臟損傷是T細(xì)胞依賴的。美國《美國國家科學(xué)院進展》(Proceedings of the National Academy of Sciences.U S A.2000；975498-5503)報道了自然殺傷T細(xì)胞(NKT細(xì)胞)通過Fas配體(FasL)介導(dǎo)的細(xì)胞毒活性參與刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型；美國《美國病理學(xué)雜志》(American Journal of Pathology.2000；1571671-1683)報道了巨噬細(xì)胞[肝臟內(nèi)稱作枯否氏(Kupffer)細(xì)胞]通過分泌腫瘤壞死因子(TNF)參與刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型。除了刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型外，美國《美國國家科學(xué)院進展》(1979；765939-5943)報道的半乳糖胺/脂多糖(Galactosamine/lipopolysaccharide)聯(lián)合誘導(dǎo)的肝臟損傷也是常用的肝炎模型，美國《美國生理學(xué)雜志-胃腸道和肝臟生理學(xué)分冊》(American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology.2001；280G720-8)報道該模型是枯否氏細(xì)胞依賴的。綜上所述，到目前為止，T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和枯否氏細(xì)胞在已經(jīng)報道的肝炎模型中的作用已經(jīng)得到清楚地闡明，而NK細(xì)胞在這些肝炎模型中的確切作用尚未見報道。
雖然美國《免疫學(xué)雜志》(Journal of Immunology，1983；1311531-1538)和美國《白細(xì)胞生物學(xué)雜志》(Journal of Leukocyte Biology，2004；76743-59)分別報道了NK細(xì)胞在小鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝臟實質(zhì)細(xì)胞損傷中的發(fā)揮重要作用，但是由于缺乏人體肝臟標(biāo)本以及MCMV和HCV感染模型建立的繁瑣，安全因素等限制，特別是由于缺乏合適的由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型，NK細(xì)胞在肝臟損傷中的詳細(xì)致病機制仍未獲得很大進展。因此，為了更好、更方便地研究NK細(xì)胞在肝炎免疫損傷中的作用，以及篩選有價值的護肝藥物、療效觀察研究，有必要建立由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎動物模型，但迄今未見有關(guān)于由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型的報的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種建立由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎動物模型的方法，以建立一種由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型，克服現(xiàn)有免疫細(xì)胞相關(guān)的肝炎模型中沒有NK細(xì)胞參與的不足?？捎糜诟闻KNK細(xì)胞在肝炎致病機制中的作用研究以及護肝藥物的篩選和療效觀察。
本發(fā)明建立由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎動物模型的方法，其特征在于包括以下步驟1、小鼠的準(zhǔn)備從純系BALB/c小鼠、純系C57BL/6J小鼠(中文簡稱B6小鼠)、純系嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠、純系BALB/c背景的裸鼠(nude mice)或純系BALB/c背景的分化抗原(CD)1d缺陷小鼠中選擇至少一組小鼠；2、聚肌胞(Polyinosinic-Polycytidylic Acid，簡稱Poly IC)的準(zhǔn)備用無菌PH7.0磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)配制終濃度為1毫克/毫升(mg/ml)的Poly IC溶液，封裝備用，-20℃保存；3、對不同品系小鼠進行Poly IC腹腔或靜脈注射將步驟2中所配制的1mg/ml PolyIC溶液，對每種品系小鼠分別進行腹腔注射或靜脈注射Poly IC溶液，每克小鼠體重劑量范圍為7.5-20μg；4、不同品系小鼠Poly IC注射后的處理摘取Poly IC注射后12-24小時小鼠的眼球，收集血液后分離血清，做血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)檢測；同時收集小鼠肝臟標(biāo)本，做蘇木精/伊紅(H&E)染色后，顯微鏡觀察肝臟組織學(xué)變化若血清ALT和AST升高至60-200國際單位/升(IU/L)，肝臟組織學(xué)出現(xiàn)肝細(xì)胞點狀壞死，局部炎性細(xì)胞浸潤，則肝炎模型建立成功；若無上述現(xiàn)象則肝炎模型未建立成功。
本發(fā)明方法中一般采用6-8周BALB/c或C57BL/6J小鼠，因大于8周的小鼠肝臟損傷不明顯。
本發(fā)明中的Poly IC注射途徑可以采用腹腔注射，也可以采用靜脈注射，在相同劑量下兩者肝臟損傷無顯著差異，但采用腹腔注射較方便。
本發(fā)明方法中常采用的兩種品系BALB/c和C57BL/6J小鼠，在相同劑量Poly IC、相同注射途徑時，C57BL/6J小鼠肝臟損傷程度較BALB/c小鼠損傷程度為重。
肝臟損傷的嚴(yán)重程度與Poly IC注射所用劑量有關(guān)，C57BL/6J小鼠接受7.5μg/g.wtPoly IC腹腔注射時，肝臟損傷較輕；C57BL/6J小鼠接受30μg/g.wt Poly IC腹腔注射時肝臟損傷較重，且死亡率增加；一般以Poly IC 20μg/g.wt注射C57BL/6J小鼠為最佳，小鼠死亡率小于5％。
在刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型中，注射刀豆蛋白可以誘導(dǎo)BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠產(chǎn)生肝臟損傷，因為SCID小鼠和裸鼠缺乏T細(xì)胞，CD1d缺陷小鼠存在NKT細(xì)胞功能缺陷，所以刀豆蛋白不能誘導(dǎo)SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠產(chǎn)生肝臟損傷，而本發(fā)明中注射Poly IC不但可以誘導(dǎo)BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠產(chǎn)生肝臟損傷，而且可以誘導(dǎo)SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠產(chǎn)生肝臟損傷。
由于本發(fā)明采用的Poly IC是一種人工合成的雙鏈核糖核酸(RNA)，能夠刺激、活化NK細(xì)胞分泌干擾素。本發(fā)明的理論前提就是用大劑量Poly IC過度活化NK細(xì)胞，從而破壞肝臟實質(zhì)細(xì)胞；而在刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型中所使用的刀豆蛋白為T細(xì)胞刺激劑，主要是活化肝臟T細(xì)胞；在脂多糖誘導(dǎo)的肝炎模型中所使用的脂多糖可與枯否氏細(xì)胞表面的Toll樣受體4(toll-like receptor 4，縮寫TLR4)結(jié)合，活化枯否氏細(xì)胞。
從所誘導(dǎo)的肝炎模型的性質(zhì)來看，由于本發(fā)明中所采用的Poly IC是病毒模擬物，其刺激機體產(chǎn)生的反應(yīng)類似于病毒感染反應(yīng)，結(jié)合所誘導(dǎo)的肝臟組織病理損傷特點，PolyIC誘導(dǎo)肝臟損傷類似人類病毒性肝炎，由于Poly IC誘導(dǎo)的肝臟損傷是由于自身過度活化的NK細(xì)胞破壞了肝臟實質(zhì)細(xì)胞，所以這種損傷又具有自身免疫性肝炎的特點；刀豆蛋白誘導(dǎo)的肝炎模型類似人類自身免疫性肝炎，具有爆發(fā)性肝炎特征；脂多糖誘導(dǎo)的肝炎模型類似人類膿毒性肝炎(septic hepatitis)。從肝臟損傷嚴(yán)重程度來看，刀豆蛋白和脂多糖誘導(dǎo)的肝臟損傷病理損傷表現(xiàn)為大片狀壞死(massive necrosis)，而Poly IC誘導(dǎo)的肝臟損傷病理損傷表現(xiàn)為點狀壞死(spotty necrosis)；在刀豆蛋白和脂多糖誘導(dǎo)的肝炎模型中血清轉(zhuǎn)氨酶峰值為3000-5000IU/L，而在Poly IC誘導(dǎo)的肝炎模型中血清轉(zhuǎn)氨酶峰值為100-200IU/L。
在所述的不同純系小鼠組別中，Poly IC注射后12-24小時，動物納食差，毛發(fā)豎直、粘連；血清轉(zhuǎn)氨酶升高，肝臟組織學(xué)出現(xiàn)肝細(xì)胞點狀壞死，局部淋巴細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)NK細(xì)胞比例及絕對數(shù)增加，由此可獲得由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎小鼠模型。
本發(fā)明建立的由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎動物模型重復(fù)性好，臨床癥狀明顯，所用小鼠遺傳背景清楚，而且操作方法方便、安全，適合大規(guī)模動物實驗，可用于護肝藥物的篩選及療效觀察。本發(fā)明中所述的Poly IC誘導(dǎo)的肝炎是由NK細(xì)胞介導(dǎo)的，克服了現(xiàn)有常見免疫細(xì)胞相關(guān)的肝炎模型沒有NK細(xì)胞參與的不足，填補了國內(nèi)外空白。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述。
實施例1本實施例建立由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型的方法，包括以下步驟1、不同純系小鼠的準(zhǔn)備至少選擇一組BALB/c純系小鼠，一組C57BL/6J純系小鼠，一組純系BALB/c背景的SCID小鼠，一組純系BALB/c背景的裸鼠，一組純系BALB/c背景的CD1d缺陷小鼠，一組NK細(xì)胞清除的C57BL/6J純系小鼠。除比較Poly IC對不同年齡小鼠肝臟損傷的影響外，小鼠周齡均為6-8周，因為這個年齡建立的模型癥狀反應(yīng)穩(wěn)定，易于模擬人類疾病狀況；除做性別差異比較試驗外，其它所有實驗均使用雌性小鼠；小鼠均為清潔級(SPF級)；飼養(yǎng)在專人看護的無病原體的動物飼養(yǎng)間內(nèi)，飼料和水均要滅菌處理，防止病毒感染而產(chǎn)生假象；飼養(yǎng)溫度22℃，濕度55％，12小時白/晝節(jié)律。所有實驗均符合《(中國科技大學(xué)實驗動物管理條例》。
2、Poly IC的準(zhǔn)備選用購自美國Sigma公司的Polyinosinic-Polycytidylic Acid，用無菌PH7.0磷酸鹽緩沖溶液配制成終濃度為1mg/ml，封裝備用，-20℃保存。
3、檢測C57BL/6J和BALB/c小鼠接受不同劑量Poly IC刺激后血清ALT和AST及肝臟組織病理學(xué)改變對BALB/c和C57BL/6J小鼠進行四種劑量(5.0μg/g.wt、7.5μg/g.wt、20μg/g.wt和30μg/g.wt)Poly IC腹腔注射，分別在Poly IC注射后0、12、18、24和48小時后，摘取小鼠眼球，收集血液分離血清后做血清ALT和AST檢測，同時收集小鼠肝臟標(biāo)本做H&E染色，每種劑量和時間點至少5只小鼠，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
血清轉(zhuǎn)氨酶測定方法(改良賴氏法)如下(1)、取96孔板，每個樣品孔加5微升(μl)小鼠血清和25μl ALT或AST基質(zhì)液，空白孔只加5μl生理鹽水，充分混勻，37℃水浴30分鐘。樣品孔、系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線孔和空白孔均做三個平行實驗孔，系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線孔按下表加樣01 2 3 4 5標(biāo)準(zhǔn)液(μl)02.5 5.0 7.5 10.0 12.5生理鹽水(μl) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0基質(zhì)液(μl)25 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5(2)、每孔加25μl 2，4-二硝基苯肼，充分混勻后空白孔加入25μl ALT基質(zhì)液，充分混勻后，37℃水浴20分鐘；(3)、每孔加入250μl 0.4摩爾/升氫氧化鈉(NaOH)終止反應(yīng)后，在酶標(biāo)儀上490納米波長測吸光值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清樣品轉(zhuǎn)氨酶單位。
H&E染色具體步驟如下(1)、將石蠟包埋后肝臟組織塊切成厚度為5um切片，脫蠟后，浸入PBS中水化5分鐘；(2)、將該切片浸入蘇木精液中染色10-30分鐘后取出，用自來水沖洗，浮色2分鐘；(3)、將該切片浸入0.1％鹽酸酒精中分色數(shù)秒鐘；再用自來水沖洗反藍(lán)，直到切片顏色變藍(lán)；(4)、將該切片浸入1％伊紅進行復(fù)染30秒-2分鐘，水洗數(shù)秒除去殘余染料；(5)、按順序?qū)⒃撉衅?jīng)過70％、80％、90％、95％的酒精脫色和分化伊紅顏色各1-2分鐘；(6)、將該切片浸入100％酒精脫色15分鐘，中間更換一次；(7)、將該切片浸入100％酒精+二甲苯(1∶1)中透明5-10分鐘，再經(jīng)過二甲苯I透明2-5分鐘，二甲苯II透明5分鐘；
(8)、用中性樹膠進行封固后，顯微鏡下隨機選擇10個低倍視野觀察點狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤情況。
結(jié)果C57BL/6J和BALB/c小鼠接受5.0μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12-48小時，血清ALT和AST均小于正常值28IU/L，H&E染色未見肝細(xì)胞壞死。
C57BL/6J和BALB/c小鼠接受7.5μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12小時，血清ALT和AST分別輕度升高至49±5IU/L和51±6IU/L，注射后24小時ALT和AST達到高峰，分別為85±9IU/L和68±7IU/L；注射后48小時血清ALT和AST恢復(fù)正常；PolyIC腹腔注射后12-24小時，H&E染色顯示可見少量肝細(xì)胞點狀壞死和炎性細(xì)胞浸潤。
C57BL/6J小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12小時血清ALT和AST分別升高至85±7IU/L和69±6IU/L；注射后24小時，血清ALT和AST達到高峰，分別升高至170±15IU/L和110±12IU/L；BALB/c小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后18小時血清ALT達到高峰，為160±18IU/L；Poly IC腹腔注射后24小時血清AST達到高峰，為95±7IU/L；C57BL/6J和BALB/c小鼠Poly IC腹腔注射后48小時血清ALT和AST恢復(fù)正常；C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12-24小時，H&E染色顯示有明顯的肝細(xì)胞點狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤，C57BL/6J小鼠病理損傷較BALB/c小鼠為重，該劑量兩種小鼠死亡率均小于5％。
C57BL/6J和BALB/c小鼠接受30μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12小時死亡率15-30％。
由于30μg/g.wt小鼠死亡率較高，所以，本發(fā)明方法中Poly IC所用劑量應(yīng)該在7.5-20μg/g.wt范圍；肝臟損傷呈劑量依賴性，相同劑量Poly IC腹腔注射時，C57BL/6J小鼠肝臟損傷較BALB/c小鼠為重；雌性和雄性小鼠對Poly IC所誘導(dǎo)的肝臟損傷無顯著差別。所以，本發(fā)明中建立由NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎模型的Poly IC最適注射劑量為20μg/g.wt，最佳觀察時間為Poly IC注射后24小時。本發(fā)明中的Poly IC注射途徑可以采用腹腔注射，也可以采用靜脈注射，在相同劑量下兩者肝臟損傷無顯著差異，但采用腹腔注射較方便。
4、檢測不同周齡C57BL/6J小鼠接受Poly IC刺激后血清ALT和AST選擇6-8周和8-10周兩種周齡C57BL/6J小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射，結(jié)果Poly IC注射后24小時，6-8周C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分別為170±8IU/L和110±12IU/L，而8-10周C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分別為50±7IU/L和70±8IU/L。6-8周C57BL/6J小鼠建立的模型癥狀反應(yīng)穩(wěn)定，易于模擬人類疾病狀況，所以最佳小鼠周齡為6-8周。
5、觀察C57BL/6J小鼠Poly IC刺激后肝臟NK細(xì)胞比例、絕對數(shù)變化及活化情況按Poly IC 20μg/g.wt腹腔注射C57BL/6J小鼠，注射后0，12，24和48小時，每個時間點處死5只小鼠后分別分離肝臟淋巴細(xì)胞，具體步驟如下
(1)、小鼠摘眼球放血后脫臼處死，摘取肝臟；(2)、剪碎肝臟組織，200目不銹鋼篩網(wǎng)研磨過濾，1×PBS溶液沖洗，轉(zhuǎn)至50ml離心管中；冰浴自然沉降10-20分鐘，待自然沉降物界面明顯后吸取上層液體，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后棄上清；(3)、用2ml40％Percoll溶液重懸沉淀，輕輕加于2ml70％Percoll溶液上，2400轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘后吸取兩層Percoll溶液界面的白細(xì)胞層至20ml離心管中，加1×PBS溶液10ml后，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集細(xì)胞，1×PBS溶液洗2次。
(4)、收集得到的細(xì)胞即肝臟淋巴細(xì)胞，3％冰醋酸稀釋后顯微鏡下計數(shù)。
流式細(xì)胞術(shù)法檢測上述分離的肝臟淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞比例數(shù)及NK細(xì)胞表面活化分子CD25和CD69的表達，具體步驟如下分離的淋巴細(xì)胞用正常大鼠血清封閉后，按1×106個細(xì)胞加入1μg異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的NK1.1、1μgCy5標(biāo)記的CD3和藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD25或CD69，4℃避光放置30分鐘后，用冷PBS溶液洗滌3次后，上機檢測，用WinMDI2.9軟件分析，得出肝臟NK細(xì)胞比例數(shù)，與總數(shù)相乘即得出肝臟NK細(xì)胞絕對數(shù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)表示。結(jié)果在正常C57BL/6J小鼠肝臟大約10.5％CD3-NK1.1+NK細(xì)胞，注射Poly IC顯著提高了肝臟NK細(xì)胞比例，Poly IC注射后12小時NK細(xì)胞比例為20.8％，峰值在24小時為39.2％，48小時下降至16.9％，肝臟NK細(xì)胞絕對數(shù)也由刺激前的0.6×105個細(xì)胞/肝臟升至Poly IC注射24小時的7×105個細(xì)胞/肝臟，可見Poly IC注射后可顯著增加肝臟內(nèi)NK細(xì)胞絕對數(shù)。
正常肝臟NK細(xì)胞和T細(xì)胞表面只有少數(shù)細(xì)胞表達CD69分子，比例小于5％，PolyIC刺激12小時后幾乎所有的NK細(xì)胞表面均表達CD69分子，在48小時仍維持較高水平，達80.71％；雖然T細(xì)胞也在24小時顯示較強的活化，比例達95％以上，但是48小時活化顯著下降至31％；肝臟NK細(xì)胞表面CD25分子在Poly IC刺激后也輕微升高至4.3％，而T細(xì)胞表面CD25分子則沒有升高。這些結(jié)果提示Poly IC刺激后NK細(xì)胞活化較T細(xì)胞持久。
6、觀察C57BL/6J小鼠清除NK細(xì)胞后注射Poly IC、刀豆蛋白或脂多糖后肝臟損傷變化情況由于目前國內(nèi)外沒有成功獲得NK細(xì)胞基因敲除小鼠，NK細(xì)胞清除的C57BL/6J小鼠被用于闡明NK細(xì)胞在上述Poly IC誘導(dǎo)的肝炎模型中的作用，具體方法為每只C57BL/6J小鼠靜脈注射50μgNK細(xì)胞特異性多克隆抗體抗唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂M1(asialoganglioside M1，縮寫AsGM1，日本W(wǎng)ako公司產(chǎn))，注射后24小時，分離肝臟淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測肝臟NK細(xì)胞比例，確定清除效果。結(jié)果AsGM1抗體注射后24小時肝內(nèi)NK細(xì)胞比例低于1.0％，可視為NK細(xì)胞清除的小鼠。
NK細(xì)胞清除的C57BL/6J小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后18小時，血清ALT和AST分別為60±5IU/L和70±6IU/L，而沒有清除NK細(xì)胞的C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分別為140±14IU/L和135±18IU/L；注射后24小時，NK細(xì)胞清除的C57BL/6J小鼠血清ALT和AST顯著下降至50±5IU/L和60±5IU/L，而沒有清除NK細(xì)胞的C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分別為170±8IU/L和110±12IU/L。由于清除小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞可以減輕肝臟損傷程度，說明NK細(xì)胞是Poly IC誘導(dǎo)的肝炎模型中的主要效應(yīng)細(xì)胞。
在對照組中，NK細(xì)胞清除的C57BL/6J小鼠接受靜脈注射15μg/g.wt刀豆蛋白或腹腔注射10μg/g.wt脂多糖24小時后，小鼠肝臟均出現(xiàn)大片狀壞死，炎性細(xì)胞浸潤，血清ALT和AST顯著升高達3000-5000IU/L，說明NK細(xì)胞不是刀豆蛋白和脂多糖誘導(dǎo)的肝炎模型的效應(yīng)細(xì)胞。
7、觀察不同品系小鼠Poly IC刺激后血清ALT和AST變化情況為了排除其它免疫細(xì)胞在上述的肝炎模型中的作用，采用了以下幾種純系小鼠缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞但NK細(xì)胞正常的SCID小鼠、缺乏T細(xì)胞的裸鼠和NKT細(xì)胞缺陷的CD1d缺陷小鼠，每組至少3只。上述幾種小鼠分別接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后24小時，檢測血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST。結(jié)果為和BALB/c小鼠一樣，20μg/g.wt Poly IC同樣可以誘導(dǎo)SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠肝臟損傷，SCID小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射24小時后。這些結(jié)果進一步證實所建立的Poly IC誘導(dǎo)的肝炎模型是由NK細(xì)胞介導(dǎo)的。
權(quán)利要求
1.一種建立由自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎動物模型的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、從純系小白鼠、純系B6小鼠、純系嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病小鼠、純系裸鼠或純系分化抗原1d缺陷小鼠中選擇至少一組小鼠；(2)、用無菌PH7.0磷酸鹽緩沖溶液配制終濃度為1毫克/毫升的聚肌胞溶液，封裝備用，-20℃保存；(3)、對每種品系小鼠分別腹腔注射或靜脈注射上述聚肌胞溶液，每克體重劑量范圍為7.5-20μg；(4)、摘取聚肌胞注射后12-24小時小鼠的眼球，收集血液后分離血清，做血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶檢測；同時收集小鼠肝臟標(biāo)本，做蘇木精/伊紅染色后，顯微鏡觀察肝臟組織學(xué)變化血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高至60-200國際單位/升，肝臟組織學(xué)出現(xiàn)肝細(xì)胞點狀壞死，局部炎性細(xì)胞浸潤，則肝炎模型建立成功。
全文摘要
本發(fā)明建立由自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)介導(dǎo)的肝炎模型的方法，特征是選擇一種病毒模擬物聚肌胞(Poly IC)以7.5－20微克/克體重劑量，通過腹腔注射或靜脈注射6－8周齡純系BALB/c或C57BL/6J小鼠，Poly IC注射后12－24小時血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶顯著升高，肝臟組織學(xué)出現(xiàn)肝細(xì)胞點狀壞死，局部炎性細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)NK細(xì)胞比例及絕對數(shù)升高。該模型的建立為系統(tǒng)研究肝炎的發(fā)病機制以及篩選有價值的護肝藥物及療效觀察提供有力的工具。
文檔編號C12N5/06GK1624112SQ20041006562
公開日2005年6月8日 申請日期2004年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日
發(fā)明者田志剛, 董忠軍, 魏海明 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)