專利名稱：百草枯抗性基因及維管束和毛狀體特異性啟動子的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及賦予百草枯抗性的百草枯抗性基因以及維管束和毛狀體特異性啟動子。
背景技術(shù)：
植物經(jīng)常暴露于多種環(huán)境壓力，包括高溫和低溫、干旱、強(qiáng)光、鹽、大氣污染氣體、致病性微生物等。因此，如果開發(fā)可在這些環(huán)境壓力下充分生長的有用植物如作物，在由于環(huán)境壓力甚至在當(dāng)前不能生長作物等的地區(qū)進(jìn)行糧食生產(chǎn)是可能的，并且未來預(yù)測的嚴(yán)重糧食危機(jī)的可能性將會增加。因此，在全球范圍，對這種環(huán)境壓力具有提高抗性的植物的生產(chǎn)正在進(jìn)行中。例如，通過遺傳重組技術(shù)，已產(chǎn)生了賦予寒冷抗性(Nature，356，710-703，1992；Plant Physiol.，105，601-605，1994)、干旱抗性(Plant Physiol.，107，125-130，1995；Nature，379，683-684，1996；Nature Biotech.，17，287-291，1999)、鹽抗性(Science，259，508-510，1993；Biotechnology，14，177-180，1996；Plant J.，12，133-142，1997)、大氣污染抗性(Plant CellPhysiol.，34，129-135，1993；Biotechnology，12，165-168，1994)、病害抗性(化學(xué)和生物體(Chemistry and Organisms)，37，295-305，385-392，1999)等的植物。此外，通過遺傳重組技術(shù)賦予對農(nóng)業(yè)化學(xué)品抗性的一些植物實際上也在使用(Nature，317，741-744，1985；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，391-395，1988；EMBO J.，6，2513-2518，1987；EMBO J.，7，1241-1248，1988)。
這些環(huán)境壓力與體內(nèi)產(chǎn)生活性氧類(超氧化物自由基(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(OH-)密切相關(guān)?；钚匝躅愅ㄟ^呼吸作用、光合作用、環(huán)境壓力等產(chǎn)生，并通過對蛋白質(zhì)、核酸、膜結(jié)構(gòu)等的過度氧化而對細(xì)胞產(chǎn)生致命傷害。也報道，通過遺傳重組技術(shù)產(chǎn)生的活性氧抗性植物顯示對上述環(huán)境壓力的抗性增強(qiáng)(Plant Physiol.，111，1177-1181，1996；FEBS Letters，428，47-51，1998)。
為產(chǎn)生活性氧抗性植物，主要采用將清除活性氧類的酶(超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等)的基因?qū)胫参锏姆椒ā?br>
百草枯是非選擇性和強(qiáng)效的除草劑，通過在光系統(tǒng)中連續(xù)產(chǎn)生活性氧，它可殺死所有植物。因此，百草枯抗性可用作對活性氧抗性的指標(biāo)，并分析植物中關(guān)于百草枯抗性的機(jī)制(Pestic.Biochem.Physiol.，26，22-28，1986；Theor.Appl.Genet.75，850-856，1988；以及Plant Physiol.，91，1174-1178，1989)。
同時，已公開了細(xì)胞凋亡抑制基因(日本特開平10-309142、特開2000-23583和特開2002-300822)、編碼與醛糖還原酶同源的蛋白質(zhì)的基因(日本特表2001-523466)以及編碼鐵結(jié)合蛋白質(zhì)(鐵蛋白)的基因(日本特表2001-519671)為賦予百草枯抗性的基因。此外，在日本特開2002-281979和2001-95585中，公開了來源于百草枯抗性愈傷組織的過氧化物酶為可賦予百草枯抗性的基因。
據(jù)認(rèn)為，如果分離對百草枯賦予強(qiáng)大抗性的百草枯抗性基因，將有利于開發(fā)對活性氧具有高抗性的植物，其中這些活性氧在多種環(huán)境壓力條件下(高溫和低溫、干旱、強(qiáng)光、鹽、大氣污染氣體、致病性微生物等)產(chǎn)生。然而，最近顯示，活性氧作為植物調(diào)節(jié)生長和壓力反應(yīng)的分子，扮演了重要的角色。因此，為避免影響重要特征如作物產(chǎn)量，增加植物對壓力如百草枯的抗性同時不影響植物依賴于活性氧的生長和生理防御機(jī)制是極為重要的。
維管束是通過羊齒類和種子植物如莖、葉和根的每一器官分化成的束中組織系統(tǒng)。木質(zhì)部和韌皮部是維管束的組成部分，并且它們作為導(dǎo)管運(yùn)輸水和內(nèi)部物質(zhì)至植物體。此外，在維管束中發(fā)現(xiàn)了包括維管束間形成層和維管束內(nèi)形成層的維管束形成層。維管束形成層是細(xì)胞增殖的位置，因此是植物生長極為重要的位置。因此，維管束是植物有關(guān)運(yùn)輸水份和內(nèi)部物質(zhì)以及細(xì)胞增殖的場所。因此，如果可將參與運(yùn)輸水份或內(nèi)部物質(zhì)或細(xì)胞增殖的基因?qū)胫参铮⒃诰S管束中特異性表達(dá)，這將使植物調(diào)節(jié)水份或內(nèi)部物質(zhì)的運(yùn)輸或細(xì)胞增殖成為可能。
另外，從植物病害的觀點(diǎn)看，維管束是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和轉(zhuǎn)移的位置。當(dāng)植物病毒感染植物時，植物病毒遷移長距離，從一片葉子移至其上面的葉子，因此，維管束也是導(dǎo)致植物全株感染的遷移位置。因此，如果可將參與真菌或植物病毒增殖或遷移的基因?qū)胫参铮⒃诰S管束中特異性表達(dá)，植物可得到保護(hù)而免于真菌或植物病毒的感染。
毛狀體是發(fā)現(xiàn)于植物體的葉、莖、萼片等表面存在的毛狀突起物。毛狀體參與植物體表面的分泌和排泄。例如，據(jù)報道，當(dāng)植物暴露于重金屬(鎘)壓力時，葉表面的毛狀體數(shù)量增加，并且包含鎘或鈣的晶體粘附于葉表面，換言之，通過毛狀體排泄鎘(Planta，213(1)，45-50，2001年5月)。毛狀體也是侵入植物的絲狀真菌、細(xì)菌、昆蟲等最初接觸的位置。此外，作為對病害和昆蟲傷害的防御，例如具有抗微生物活性和阻礙攝入的液體從薔微科玫瑰的腺毛或腺狀突起物中分泌。因此，如果將與重金屬等排泄有關(guān)的基因、或與分泌具有抗微生物活性或阻礙攝入的液體有關(guān)的基因作為外源基因?qū)胫参锊⒃诿珷铙w中特導(dǎo)表達(dá)，則重金屬可有效地從植物中排泄，或植物可有效地得到保護(hù)而免于絲狀真菌、細(xì)菌或昆蟲侵入植物。
如上所述，希望特異性基因可在維管束或毛狀體中進(jìn)行表達(dá)。作為進(jìn)行特異性基因表達(dá)的方法，可考慮涉及到使用在維管束或毛狀體中顯示特異啟動子活性的啟動子的方法。然而，目前尚未在維管束和毛狀體中鑒定出均特異性顯示啟動子活性的啟動子。
發(fā)明概述本發(fā)明的主題是，通過確認(rèn)和分析鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的基因，提供例如百草枯抗性基因以及提供維管束和毛狀體特異性啟動子。
本發(fā)明通過提供下述幾點(diǎn)完成上述主題(1)編碼下述(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因(a)由SEQ ID NO2代表的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)與SEQ ID NO2代表的氨基酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成、且賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)；(2)由上述(1)的基因編碼的賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)；(3)包含上述(1)的基因的重組載體；(4)根據(jù)(3)的重組載體，其中重組載體還包含外源基因或外源DNA片段；(5)具有上述(3)或(4)的重組載體的轉(zhuǎn)化體；(6)具有上述(3)或(4)的重組載體、并具有百草枯抗性的植物體；(7)篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將上述(4)的重組載體導(dǎo)入植物，并以百草枯抗性指標(biāo)為基礎(chǔ)篩選轉(zhuǎn)基因植物；(8)包含下述(a)、(b)或(c)的DNA的維管束和毛狀體特異啟動子(a)由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA；(b)與SEQ ID NO3代表的核苷酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、并作為維管束和毛狀體特異啟動子發(fā)揮功能的DNA；以及(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA雜交、并作為維管束和毛狀體特異啟動子發(fā)揮功能的DNA；(9)包含上述(8)的維管束和毛狀體特異啟動子的重組載體；(10)根據(jù)(9)的重組載體，其中重組載體包含維管束和毛狀體特異啟動子下游的外源基因或外源DNA片段；(11)根據(jù)(10)的重組載體，其中外源基因是上述(1)所述的基因；以及(12)具有上述(9)-(11)中任何一項所述的重組載體的轉(zhuǎn)基因植物。
附圖簡述
圖1.是來源于AtMVR基因轉(zhuǎn)化體的cDNA的電泳照片；圖2A.是顯示AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體在圖2B和2C中的位置簡圖。圖2B是顯示AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體在無百草枯的1/2MS培養(yǎng)基中生長的照片。圖2C是顯示AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體在含有百草枯的1/2 MS培養(yǎng)基中生長的照片。
圖3.是包含GUS基因和AtMVR啟動子的完整轉(zhuǎn)化體用GUS通過組織化學(xué)染色的顯微照片；圖4.是包含GUS基因和AtMVR啟動子的轉(zhuǎn)化體的葉用GUS通過組織化學(xué)染色的顯微照片；圖5.是包含GUS基因和AtMVR啟動子的轉(zhuǎn)化體的根用GUS通過組織化學(xué)染色的顯微照片；優(yōu)選實施方案的詳述下面詳細(xì)描述本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明的基因是編碼下述(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因(a)由SEQ ID NO2代表的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，以及(b)相對于SEQ ID NO2代表的氨基酸序列，由具有替代、缺失或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成、且賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)；編碼上述(a)所述的蛋白質(zhì)的基因是編碼由SEQ ID NO2代表的氨基酸序列組成的賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)的基因(以后稱其為AtMVR基因)。
本發(fā)明人基于AtMVR基因的核苷酸序列，在包括鼠耳芥的全部核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫(例如GenBank、EMBL、DDBJ、tairArabidopsis信息源)中進(jìn)行搜索，并在鼠耳芥基因組發(fā)現(xiàn)13個與AtMVR基因同源的基因(AtMVR 3-1至AtMVR 3-13)。任何一個AtMVR同源基因的核苷酸序列和通過相關(guān)AtMVR同源基因編碼的預(yù)測氨基酸序列通過下面表1中所列出的序列號表示。表1也列出AtMVR和每一AtMVR同源基因之間的同源性分析結(jié)果。利用BLAST P，在氨基酸水平上實施同源性分析。氨基酸的分類基于其側(cè)鏈的化學(xué)特征。在BLOSUM62氨基酸替代矩陣(Proc.Natl.Acad.Sci.，89，10915-10919，1992)中，氨基酸分為帶有巰基的氨基酸(C)；低分子量的親水氨基酸(S，T，P，A，G)；酸性氨基酸(N，D，E，Q)；堿性氨基酸(H，R，K)；低分子量疏水氨基酸(M，I，L，V)和芳香族氨基酸(F，Y，W)。在表1中，術(shù)語“同一性”在氨基酸方面指100％一致性，術(shù)語“陽性率”指當(dāng)在BLOSUM62氨基酸替代矩陣中具有陽性分值的氨基酸添加至那些具有100％一致性的氨基酸時的數(shù)值(見Bioinfomatics(日本)，Okazaki Y. & Bono H.編輯(Medical Science International出版)。
*與AtMVR3-11的比較顯示的是與AtMVR3-11部分序列比較的同源性結(jié)果。
如表1所示，AtMVR與13個AtMVR同源基因的同源性在同一性上為22-57％，陽性率上為41-70％。這些AtMVR同源基因認(rèn)為與AtMVR基因一樣，可賦予百草枯抗性。
此外，AtMVR基因與衰老相關(guān)蛋白質(zhì)DSA5(GenBank登錄號AF082030)(Plant Molecular Biology 40，237-248，1999)具有同源性。利用BLAST X的同源性分析結(jié)果顯示，在氨基酸水平上，AtMVR基因編碼的蛋白質(zhì)與DSA5編碼的蛋白質(zhì)具有89％的同一性。據(jù)報道，DSA5是百合花花瓣衰老時表達(dá)的基因(萱草屬(Hemerocallis)雜交品系)(PlantMolecular Biology 40，237-248，1999)。然而，由于DSA5編碼的蛋白質(zhì)與任何公知的蛋白質(zhì)無同源性，仍不清楚該蛋白質(zhì)具有何種功能。因此，AtMVR基因是賦予百草枯抗性的新基因。
如此處所使用的，術(shù)語“百草枯抗性”指對百草枯具有抗性。更為特別地，術(shù)語“百草枯抗性植物”指，為從百草枯獲得給定的效果，比非抗性植物需要更大量百草枯的植物。百草枯是非選擇的和強(qiáng)效的除草劑，百草枯是通過在光化學(xué)系統(tǒng)中連續(xù)產(chǎn)生活性氧而殺死所有植物。通過檢查導(dǎo)入該基因的轉(zhuǎn)化體是否可在百草枯中生長，可確定AtMVR基因是否為可賦予百草枯抗性的百草枯抗性基因。
編碼上述(b)所述蛋白質(zhì)的基因是編碼這些蛋白質(zhì)的基因，這些蛋白質(zhì)的序列與SEQ ID NO2代表的氨基酸序列比較，由具有替代、缺失或添加一個或多個氨基酸(例如1-10或1-5個)的氨基酸序列組成、并且賦予百草枯抗性。
一旦確定本發(fā)明基因的核苷酸序列，然后通過化學(xué)合成、或使用已克隆的克隆作為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(此后指“PCR”)、或使用具有所述核苷酸序列的DNA片段作為探針進(jìn)行雜交，從而獲得根據(jù)本發(fā)明的基因是可能的。此外，可通過如定點(diǎn)誘變技術(shù)而合成與突變前具有相同功能的本發(fā)明基因的突變體。
在根據(jù)本發(fā)明的基因中引入突變的方法的實例包括公知的方法，如Kunkel法或缺口雙鏈體法或與根據(jù)這些方法的方法。例如，引入突變可利用通過定點(diǎn)誘變引入突變的試劑盒(例如Mutant-K(TAKARA，Inc.制造)、或Mutant-G(TAKARA，Inc制造)、或利用TAKARA.Inc制造的LA PCR體外誘變系列試劑盒進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)是根據(jù)本發(fā)明的基因編碼的蛋白質(zhì)。例如，將根據(jù)本發(fā)明的基因整合入來源于大腸桿菌等的載體，然后用獲得的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。此后，通過提取大腸桿菌中合成的蛋白質(zhì)可獲得根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的重組載體是包含根據(jù)本發(fā)明的基因的重組載體。通過將根據(jù)本發(fā)明的基因插入合適的載體可獲得根據(jù)本發(fā)明的重組載體。用于插入根據(jù)本發(fā)明的基因的載體不受到特別限制，只要該載體可在宿主中復(fù)制，并且其實例包括質(zhì)粒、穿梭載體和輔助質(zhì)粒。另外，當(dāng)載體自身不能復(fù)制時，可使用通過如插入宿主染色體而可復(fù)制的DNA片段。
質(zhì)粒DNA的實例包括來源于大腸桿菌的質(zhì)粒(pBI221等，例如，pET系統(tǒng)如pET30b、pBR系統(tǒng)如pBR322和pBR325、pUC系統(tǒng)如pUC118、pUC119、pUC18和pUC19、pBluescript和pBI221)、來源于枯草芽胞桿菌的質(zhì)粒(例如pUB110和pTP5)、來源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的二元質(zhì)粒(例如來源于pBIN19、pBI101或pBI121的pBI系統(tǒng))、來源于酵母的質(zhì)粒(例如YEp系統(tǒng)如YEp13、或YCp系統(tǒng)如YCp50)等。噬菌體DNA的實例包括λ噬菌體(Charon 4A，Charon 21A，EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，λZAP等)。此外，也可使用動物病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒或痘苗病毒載體、植物病毒載體如花椰菜花葉病毒、或昆蟲病毒載體如桿狀病毒載體。
為將根據(jù)本發(fā)明的基因插入載體，使用這種方法，該方法首先將根據(jù)本發(fā)明的基因的cDNA利用合適的限制性酶切割，然后插入合適載體DNA的限制性酶位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)，并連入載體。此外，還可使用這種方法，該方法中分別提供載體和根據(jù)本發(fā)明基因cDNA的一部分的同源區(qū)，并且載體和cDNA通過利用PCR等體外方法或利用酵母等體內(nèi)方法連接。
根據(jù)本發(fā)明的重組載體也可包括除了本發(fā)明基因外的外源基因或外源DNA片段。將外源基因或外源DNA片段插入載體的方法與將根據(jù)本發(fā)明的DNA片段插入載體一樣。任何基因或DNA片段可作為外源基因或外源DNA片段。因此，根據(jù)本發(fā)明的基因可作為選擇性標(biāo)志基因以顯示百草枯抗性，例如，如卡那霉素或潮霉素等抗生素抗性基因一樣。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是具有根據(jù)本發(fā)明的重組載體的轉(zhuǎn)化體。通過將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入宿主可獲得根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。宿主不特別受到限制，只要它可表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的基因，然而植物是優(yōu)選的。當(dāng)宿主是植物時，按下述方法獲得轉(zhuǎn)基因植物是可能的。
在本發(fā)明中，欲轉(zhuǎn)化的“植物”可以是任何一種完整的植物、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根或種子)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織或木質(zhì)部)或植物培養(yǎng)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化中可使用的植物的實例包括但不限制于屬于禾本科(Poaceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)或豆科(Leguminosae)植物(見下面)。
禾本科稻(Oryza sativa)，玉蜀黍(Zea mays)蕓苔科鼠耳芥茄科煙草(Nicotiana tabacum)豆科大豆(Glycine max)通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法如，例如電穿孔法、農(nóng)桿菌法、粒子槍法或PEG法，可將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入植物。
例如，當(dāng)使用電穿孔法時，通過利用裝備有脈沖控制器的電穿孔儀器，在電壓500-1600伏特、25-1000微法拉第、20-30毫秒的條件下，將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入宿主。
當(dāng)使用粒子槍方法時，可使用未經(jīng)任何處理的完整植物、植物器官或植物組織自身，可制備其切片并然后使用它，或制備原生質(zhì)體并使用它。然后利用基因轉(zhuǎn)移設(shè)備(例如Bio-Rad Inc制造的PDS-1000/He)處理已制備的樣品。雖然處理條件隨著使用的植物或樣品而不同，但處理一般在壓力約450-2000psi和距離約3-12厘米的條件下實施。
使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒的方法是利用了以下特征，當(dāng)屬于農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌感染植物時，細(xì)菌所擁有的質(zhì)粒DNA的一部分轉(zhuǎn)移至植物的基因組。因此，這種方法可用于將根據(jù)本發(fā)明的基因?qū)胫参锼拗?。在屬于農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌中，當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物時，它可導(dǎo)致形成稱為“冠癭”的腫瘤。此外，當(dāng)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物時，它刺激產(chǎn)生毛細(xì)根。這些是通過將Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒中稱為“T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)區(qū)”的區(qū)域在感染時轉(zhuǎn)移至植物，并整合進(jìn)植物的基因組而導(dǎo)致的。因此，首先將欲整合進(jìn)植物基因組的DNA插入Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，然后通過利用農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌感染植物宿主，將DNA整合進(jìn)植物基因組。
將農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌轉(zhuǎn)化植物宿主的方法的實例包括上述的電穿孔法、基因槍和PEG方法，以及植物原位(in planta)轉(zhuǎn)化法。植株原位轉(zhuǎn)化法的實例包括直接農(nóng)桿菌接種法和滲入法。
可使用轉(zhuǎn)化時獲得的腫瘤組織或芽、毛細(xì)根等，而不對細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或器官培養(yǎng)物作任何處理。備選的是，利用常規(guī)植物組織培養(yǎng)法，通過施用合適濃度的植物激素(生長素、促細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素內(nèi)酯等)，它可在植物體中再生。
通過使用植物病毒作為載體，也可將根據(jù)本發(fā)明的基因?qū)胫参?。可使用的植物病毒的實例包括花椰菜花葉病毒。首先，將病毒基因組插入來源于大腸桿菌等的載體，以產(chǎn)生重組體，然后將根據(jù)本發(fā)明的基因插入病毒基因組。隨后，利用限制性酶將按這種方法修飾的病毒基因組切下，然后通過將病毒基因組接種植物宿主，而將根據(jù)本發(fā)明的基因?qū)胫参锼拗鳌?br>
除了按上面所述導(dǎo)入植物宿主中外，也可將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入細(xì)菌，這些細(xì)菌包括屬于埃希氏菌屬如大腸桿菌、芽胞桿菌屬如枯草芽胞桿菌或假單胞菌屬如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、以及酵母如釀酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、動物細(xì)胞如COS細(xì)胞或CHO細(xì)胞、和昆蟲細(xì)胞如Sf9。當(dāng)使用細(xì)菌如大腸桿菌或酵母等作為宿主時，優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明的重組載體可在細(xì)菌中自主復(fù)制，并且該重組載體包含啟動子、核糖體結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和根據(jù)本發(fā)明的基因。它也可包含調(diào)節(jié)啟動子的基因。
將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入細(xì)菌的方法不受到特別限制，只要它是可將DNA導(dǎo)入細(xì)菌的方法，例如可提到的是使用鈣離子的方法或電穿孔法。
將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入酵母的方法不受到特別限制，只要它是可將DNA導(dǎo)入酵母的方法，例如可提到的是電穿孔法、原生質(zhì)體法和醋酸鋰法。
當(dāng)使用動物細(xì)胞作為宿主時，可使用猴細(xì)胞COS-7、Vero、中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)、小鼠L-細(xì)胞等。將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入動物細(xì)胞的方法不受到特別限制，只要它是可將DNA導(dǎo)入動物細(xì)胞的方法，例如可提到的是電穿孔法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體法。
當(dāng)使用昆蟲細(xì)胞作為宿主時，可使用Sf9細(xì)胞等。將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞的方法不受到特別限制，只要它是可將DNA導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞的方法，例如可提到的是磷酸鈣法、脂質(zhì)體法和電穿孔法。
通過使用PCR法、Southern雜交方法、Northern雜交方法等，可確定根據(jù)本發(fā)明的基因是否已整合進(jìn)宿主。例如，從轉(zhuǎn)化體制備DNA和設(shè)計DNA特異引物后，可實施PCR。下一步，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等，然后將其產(chǎn)物用溴化乙錠、SYBRGreen溶液等染色。此后，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為單一條帶，確定轉(zhuǎn)化是否已發(fā)生。也可使用已預(yù)先標(biāo)記熒光染料等的引物實施PCR后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。另外，可應(yīng)用將擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合至微孔板等的固相上以通過熒光或酶反應(yīng)等確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。
根據(jù)本發(fā)明的植物體是具有包含本發(fā)明基因的重組載體并具有百草枯抗性的植物體。如此處所使用的，術(shù)語“植物體”指用包含根據(jù)本發(fā)明的基因的重組載體轉(zhuǎn)化的完整植物。通過將上述重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞等，并從獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中再生轉(zhuǎn)基因植物體，可獲得根據(jù)本發(fā)明的植物體。作為再生方法，可應(yīng)用這種方法，該方法將愈傷組織形成中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基，并允許不定胚形成以獲得完全植物體，其中該培養(yǎng)基已改變了激素的類型和濃度，并允許培養(yǎng)。使用的培養(yǎng)基的實例包括LS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基。通過類似于上述方法的方法，可將重組載體導(dǎo)入植物細(xì)胞等。
在根據(jù)本發(fā)明的植物體中，本發(fā)明基因編碼的賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)在完整植物體中過量表達(dá)。因此，根據(jù)本發(fā)明的植物體具有對百草枯的抗性。
篩選根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的方法是將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入植物，并以百草枯抗性作為指標(biāo)來篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法。轉(zhuǎn)化可通過應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的基因為選擇性標(biāo)記基因以顯示百草枯抗性而得到證實。篩選方法的實例包括將通過根據(jù)本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的植物在含百草枯的培養(yǎng)基中生長，并且基于植物的生、死和生長變化而實施篩選的方法。用于篩選的百草枯的濃度隨植物的種類和大小等而不同，然而，例如當(dāng)將鼠耳芥作為宿主，百草枯在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選為0.1-3.0μM，更為優(yōu)選的為1.0-3.0μM，以及最為優(yōu)選的為3.0μM。非轉(zhuǎn)基因植物，即野生型植物，發(fā)展為萎黃病并死于含百草枯的培養(yǎng)基中。相反，用根據(jù)本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的植物甚至在含百草枯的培養(yǎng)基中保持綠色。因此，在非轉(zhuǎn)基因植物和用根據(jù)本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的植物之間，可證實它們在含百草枯培養(yǎng)基中生長的明顯差異。
當(dāng)應(yīng)用抗生素抗性或除草劑抗性作為指標(biāo)時，因為在植物之間存在敏感性差異，在篩選時可觀察到假陽性。相反，百草枯是非選擇性并為強(qiáng)效的除草劑，百草枯可殺死所有植物。因此，在篩選根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物的方法中，在篩選時不會觀察到假陽性。此外，根據(jù)篩選本發(fā)明轉(zhuǎn)植物基因的方法，在生長的早期可有效確定抗性。
根據(jù)本發(fā)明的啟動子是包含下述(a)、(b)或(c)的DNA的維管束和毛狀體特異性啟動子(a)由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA；
(b)相對于SEQ ID NO3代表的核苷酸序列，由具有替代、缺失或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成，并可作為維管束和毛狀體特異啟動子發(fā)揮功能的DNA；以及(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成并可作為維管束和毛狀體特異啟動子發(fā)揮功能的DNA雜交。
上述(a)所述的維管束和毛狀體特異啟動子是發(fā)現(xiàn)于AtMVR基因5’上游非翻譯區(qū)的維管束和毛狀體特異啟動子，由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成。(a)中所述的啟動子可通過在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫中，基于AtMVR基因5’上游的約3000個核苷酸進(jìn)行搜索。
如此處所用，術(shù)語“維管束和毛狀體特異性啟動子”指顯示特異于植物維管束和毛狀體活性的啟動子。術(shù)語“維管束”指通過羊齒類和種子植物的每一器官如莖、葉和根中分化成的束中組織系統(tǒng)。木質(zhì)部和韌皮部是維管束的組成部分，并且它們作為導(dǎo)管運(yùn)輸水和內(nèi)部物質(zhì)至植物體而發(fā)揮功能。同時，術(shù)語“毛狀體”指存在于植物體的葉、莖或萼片等表面的毛狀突起物。毛狀體參與從植物體表面的分泌和排泄。
可根據(jù)常規(guī)方法確定維管束和毛狀體特異啟動子的活性。例如，構(gòu)建含有可操作地連接至啟動子下游的報告基因的表達(dá)載體。下一步，用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的植物。然后，將獲得的轉(zhuǎn)化體在預(yù)定的條件下培養(yǎng)，并且報告基因在維管束和毛狀體中的表達(dá)量可在mRNA或蛋白質(zhì)水平上測定，以在相應(yīng)條件下測量啟動子活性。此外，當(dāng)報告基因是β-葡糖醛酸酶(GUS)時，可通過觀察表達(dá)的GUS導(dǎo)致的組織化學(xué)染色而確定維管束和毛狀體中啟動子活性的特異性。
例如，作為使用GUS進(jìn)行組織化學(xué)染色的方法，提到將含5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)作為GUS底物的反應(yīng)混合物加至已導(dǎo)入GUS基因的轉(zhuǎn)化體的組織。當(dāng)GUS基因得到表達(dá)時，X-Gluc得到脫酯化以產(chǎn)生3-吲哚氧基衍生物單體，并且該單體與空氣氧化聚合形成藍(lán)色靛藍(lán)顏料。在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織中，該藍(lán)色顏料聚集顯示藍(lán)色。
此外，AtMVR基因5’上游特異的非翻譯區(qū)可易于通過實施PCR而獲得，其中該P(yáng)CR以從鼠耳芥提取的基因組作為模板，使用與該區(qū)域兩端核苷酸序列互補(bǔ)的引物。
根據(jù)本發(fā)明的啟動子可以是SEQ ID NO3代表的核苷酸序列，更為特別的是，5’上游完整的非翻譯區(qū)，或該啟動子可以是由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA的一部分，只要它顯示維管束和毛狀體特異啟動子的功能。
與SEQ ID NO3代表的核苷酸序列比較，上述(b)中所述的維管束和毛狀體特異啟動子由具有替代、缺失或添加一個或多個核苷酸(例如1-10或1-5個)、并發(fā)揮維管束和毛狀體特異啟動子功能的核苷酸序列組成。
上述(c)中所述的維管束和毛狀體特異啟動子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與由SEQID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA雜交，并發(fā)揮維管束和毛狀體特異啟動子特異供能。
如此處使用的一樣，術(shù)語“嚴(yán)謹(jǐn)條件”指，例如，當(dāng)使用標(biāo)記P-32的探針DNA時，在由5×SSC(0.75M NaCl，0.75M檸檬酸鈉)、5×Denhardt試劑(0.1％菲可，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％牛血清白蛋白)和0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)組成的雜交溶液中雜交，溫度45-68℃，優(yōu)選的為60-68℃。此外，在洗滌步驟，在由2×SSC和0.1％SDS組成的洗滌溶液中進(jìn)行洗滌，溫度為45-55℃，更為優(yōu)選的是由0.1×SSC和0.1％SDS組成的洗滌溶液，溫度為45-55℃。當(dāng)使用利用AlkPhos直接標(biāo)記組件試劑盒(Amersham Biotech)進(jìn)行酶促標(biāo)記的探針DNA時，可在含有試劑盒附帶的說明書中所述成分的雜交溶液(含有0.5M NaCl和4％封閉試劑)中實施雜交，溫度為55-75℃。此外，在洗滌步驟，根據(jù)試劑盒附帶的說明書中的指導(dǎo)，洗滌在初期洗滌溶液(含有2M尿素)中實施，溫度為55-75℃，并在二級洗滌溶液和室溫中實施。也可使用其它檢測技術(shù)，在這些情況下，條件為相關(guān)檢測技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)條件。
一旦確定根據(jù)本發(fā)明的啟動子的核苷酸序列，接下來可通過化學(xué)合成、或應(yīng)用克隆探針作為模板的PCR、或應(yīng)用具有核苷酸序列的DNA片段作為探針進(jìn)行雜交而獲得本發(fā)明的啟動子。此外，可通過如定點(diǎn)誘變技術(shù)而合成與突變前具有相同功能的本發(fā)明啟動子的突變體。
將突變引入根據(jù)本發(fā)明的啟動子的方法的實例包括公知的方法，如Kunkel法、或缺口雙鏈體法、或根據(jù)這些方法的方法。例如，引入突變可使用通過定點(diǎn)誘變引入突變的試劑盒(例如Mutant-K或Mutant-G(均由TAKARA Inc制造))或可使用TAKARA Inc制造的LA PCR體外誘變系列試劑盒進(jìn)行。
通過將根據(jù)本發(fā)明的啟動子插入合適的載體可獲得包含本發(fā)明啟動子的本發(fā)明重組載體。用于插入本發(fā)明啟動子的載體不受到特別限制，只要它可在宿主內(nèi)復(fù)制，并且其實例包括質(zhì)粒、穿梭載體和輔助質(zhì)粒。另外，當(dāng)載體自身不能復(fù)制時，可使用通過如插入宿主染色體而可復(fù)制的DNA片段。
質(zhì)粒DNA的實例包括來源于大腸桿菌的質(zhì)粒(pBI221等，例如，pET系統(tǒng)如pET30b、pBR系統(tǒng)如pBR322和pBR325、pUC系統(tǒng)如pUC118、pUC119、pUC18和pUC19、pBluescript和pBI221)、來源于枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒(例如pUB110和pTP5)、來源于根癌農(nóng)桿菌的雙元質(zhì)粒(例如，來源于pBIN19、pBI101或pBI121的pBI系統(tǒng))、來源于酵母的質(zhì)粒(例如，YEp系統(tǒng)如YEp13、或YCp系統(tǒng)如YCp50)等。噬菌體DNA的實例包括λ噬菌體(Charon 4A、Charon 21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等)。此外，也可使用動物病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒或痘苗病毒載體、或昆蟲病毒載體如桿狀病毒載體。
為將根據(jù)本發(fā)明的啟動子插入載體，可使用這樣的方法，該方法首先用合適的限制性酶將純化的DNA切下，然后插入合適載體DNA的限制性酶位點(diǎn)或多克隆位點(diǎn)，并連接至載體。此外，也可使用這樣的方法，該方法中分別提供載體和本發(fā)明啟動子的一部分的同源區(qū)，并通過使用PCR等體外方法或使用酵母等體內(nèi)方法將載體和啟動子連接起來。
包含本發(fā)明啟動子的本發(fā)明重組載體可進(jìn)一步包括插入本發(fā)明啟動子下游的外源基因或外源DNA片段。插入外源基因或外源DNA片段的方法與將根據(jù)本發(fā)明的啟動子插入載體一樣。
在包含本發(fā)明啟動子的本發(fā)明重組載體中，欲插入本發(fā)明啟動子下游的外源基因的實例包括任何外源基因，具體的實例包括與運(yùn)輸水或內(nèi)部物質(zhì)有關(guān)、或細(xì)胞增殖有關(guān)的基因、與細(xì)菌或植物病毒增殖或運(yùn)輸有關(guān)的基因、與排泄重金屬等有關(guān)的基因、或與分泌具有抗微生物活性或阻礙攝入的液體有關(guān)的基因。更為特別的是，該基因可以是用于運(yùn)輸或泵吸的基因、編碼PR-蛋白質(zhì)的基因(發(fā)病相關(guān)的蛋白質(zhì))(幾丁質(zhì)酶、過氧化物酶等)、防衛(wèi)素家族基因、植物防御素合成基因或害蟲等的驅(qū)除信息素合成基因。作為外源基因進(jìn)一步的實施例可提及上述根據(jù)本發(fā)明的基因，AtMVR基因。
欲插入本發(fā)明啟動子下游的外源DNA片段實例包括RNA自身發(fā)揮功能的反義RNA或核酶。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是具有根據(jù)本發(fā)明的重組載體的轉(zhuǎn)基因植物，其中本發(fā)明重組載體包含本發(fā)明的啟動子。通過將根據(jù)本發(fā)明的重組載體導(dǎo)入植物，可獲得根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，其中本發(fā)明重組載體包含本發(fā)明的啟動子。轉(zhuǎn)基因植物可按下述方法獲得。
在本發(fā)明中，欲轉(zhuǎn)化的“植物”可以是任一完整的植物、具有維管束和/或毛狀體的植物器官(例如葉、花瓣、莖、根或種子)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織或木質(zhì)部)或植物培養(yǎng)細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化中可使用的植物的實例包括但不限制于屬于禾本科(Poaceae)、蕓苔科(Brassicaceae)、茄科(Solanaceae)或豆科(Leguminosae)植物(見下面)。
禾本科稻(Oryza sativa)，玉蜀黍(Zea mays)蕓苔科鼠耳芥茄科煙草(Nicotiana tabacum)豆科大豆(Glycine max)通過常規(guī)轉(zhuǎn)化方法如，例如電穿孔法、農(nóng)桿菌法、粒子槍法或PEG法，可將包含本發(fā)明啟動子的本發(fā)明重組載體導(dǎo)入植物。
例如，當(dāng)使用電穿孔法時，通過利用裝備有脈沖控制器的電穿孔儀器，在電壓500-1600伏特、25-1000微法拉第、20-30毫秒的條件下，將包含本發(fā)明啟動子的本發(fā)明重組載體導(dǎo)入宿主。
當(dāng)使用粒子槍方法時，可使用未經(jīng)任何處理的完整植物、植物器官或植物組織自身，可制備其切片并然后使用它，或制備原生質(zhì)體并使用它。然后利用基因轉(zhuǎn)移設(shè)備(例如Bio-Rad Inc制造的PDS-1000/He)處理已制備的樣品。雖然處理條件隨著使用的植物或樣品而不同，但處理一般在壓力約450-2000psi和距離約3-12厘米的條件下實施。
使用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒的方法是利用了以下特征，當(dāng)屬于農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌感染植物時，細(xì)菌所擁有的質(zhì)粒DNA的一部分轉(zhuǎn)移至植物的基因組。因此，這種方法可用于將根據(jù)本發(fā)明的啟動子和外源基因或外源DNA片段導(dǎo)入植物宿主。在屬于農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌中，當(dāng)根癌農(nóng)桿菌感染植物時，它可導(dǎo)致形成稱為“冠癭”的腫瘤。此外，當(dāng)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物時，它刺激產(chǎn)生毛細(xì)根。這些是通過將Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒中稱為“T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)區(qū)”的區(qū)域在感染時轉(zhuǎn)移至植物，并整合進(jìn)植物的基因組而導(dǎo)致的。因此，首先將欲整合進(jìn)植物基因組的DNA插入Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒的T-DNA區(qū)，然后通過利用農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌感染植物宿主，將DNA整合進(jìn)植物基因組。
將農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌轉(zhuǎn)化植物宿主的方法的實例包括上述的電穿孔法、基因槍和PEG方法，以及植物原位(in planta)轉(zhuǎn)化法。植株原位轉(zhuǎn)化法的實例包括直接農(nóng)桿菌接種法和滲入法。
可使用轉(zhuǎn)化時獲得的腫瘤組織或芽、毛細(xì)根等，而不對細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或器官培養(yǎng)物作任何處理。備選的是，利用常規(guī)植物組織培養(yǎng)法，通過施用合適濃度的植物激素(生長素、促細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素內(nèi)酯等)，它可在植物體中再生。
此外，通過使用植物病毒作為載體，可將根據(jù)本發(fā)明的啟動子和外源基因或外源DNA片段導(dǎo)入植物。此處所使用的植物病毒的實例包括花椰菜花葉病毒。首先，將病毒基因組插入來源于大腸桿菌等的載體，以產(chǎn)生重組體，然后將根據(jù)本發(fā)明的啟動子和外源基因或外源DNA片段插入病毒基因組。隨后，使用限制性酶將用這種方法修飾的病毒基因組從重組體上切下，通過將病毒基因組接種植物宿主，將根據(jù)本發(fā)明的啟動子和外源基因或外源DNA片段導(dǎo)入植物宿主。
上述方法產(chǎn)生的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物可在使用本發(fā)明啟動子的維管束和毛狀體中特異表達(dá)外源基因或外源DNA片段。
維管束是與植物中運(yùn)輸水和內(nèi)部物質(zhì)以及細(xì)胞增殖有關(guān)的位置。因此，當(dāng)將與運(yùn)輸水或內(nèi)部物質(zhì)或細(xì)胞增殖有關(guān)的基因作為外源基因?qū)敫鶕?jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物時，可調(diào)節(jié)植物中水和內(nèi)部物質(zhì)的運(yùn)輸或細(xì)胞增殖。維管束也是感染茄科植物的枯萎病真菌增殖和轉(zhuǎn)移的位置。當(dāng)植物病毒感染植物時，植物病毒遷移很長距離，從一片葉子移至其上面的葉子，因此，維管束也是導(dǎo)致植物全株感染的遷移位置。因此，當(dāng)將與真菌或植物病毒增殖或遷移有關(guān)的基因作為外源基因?qū)敫鶕?jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物時，植物可得到保護(hù)而免受真菌或植物病毒的感染。
同時，毛狀體與植物體表面的分泌和排泄有關(guān)。例如，據(jù)報道，當(dāng)植物暴露于重金屬(鎘)壓力時，葉表面上的毛狀體數(shù)量增加，并且含有鎘或鈣的晶體粘附于葉表面，換言之，通過毛狀體排泄鎘(Planta，213(1)，45-50，2001年5月)。毛狀體也是侵入植物的絲狀真菌、細(xì)菌、昆蟲等最初接觸的位置。此外，作為對病害和昆蟲傷害的防御，例如具有抗微生物活性和阻礙攝入的液體從薔微科玫瑰的腺毛或腺狀突起物中分泌。因此，如果將與重金屬等排泄有關(guān)的基因、或與分泌具有抗微生物活性或阻礙攝入的液體有關(guān)的基因作為外源基因?qū)氡景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，重金屬可有效地從植物中排泄，或植物可有效地得到保護(hù)而免于絲狀真菌、細(xì)菌或昆蟲侵入植物。
此外，當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的基因作為外源基因?qū)敫鶕?jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物時，通過促進(jìn)植物體內(nèi)百草枯的運(yùn)輸和排泄等，可賦予對百草枯的抗性。
本發(fā)明將參照下述實施例進(jìn)行詳細(xì)闡述。然而，這些實施例不用于限制本發(fā)明的技術(shù)范圍。
分離百草枯抗性基因在該實施例中，將從Nottingham Arabidopsis StockCenter(http//nasc.nott.ac.uk/)獲得的Weigel T-DNA品系作為鼠耳芥的活化標(biāo)記品系。
(1)使用鼠耳芥的活化標(biāo)記品系(Weigel T-DNA品系)篩選可在含有百草枯的培養(yǎng)基中生長的克隆將Weigel T-DNA品系的種子無菌接種至含有3μM百草枯(甲基紫精，Sigma Chemicai Co制造)的1/2MS瓊脂(1％)培養(yǎng)基(2.3g/lMurashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical IndustriesLtd.制造)、1.5mg/l鹽酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l鹽酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％瓊脂)，并于22℃、光照射60μE/m2/s(每個循環(huán)為16小時光期間/8小時暗期間)下培養(yǎng)。培養(yǎng)后約10天，對在含有百草枯的培養(yǎng)基中生長的個體進(jìn)行篩選。
(2)通過TAIL-PCR方法，從篩選的活化標(biāo)記品系中評估T-DNA的插入位點(diǎn)將由經(jīng)篩選個體獲得的Weigel T-DNA品系的種子種于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.制造)的罐中，并于23℃、在光強(qiáng)度為100μE/m2/s、16小時光周期/8小時暗周期的光周期條件下生長約1月。
使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN制造)，從培養(yǎng)個體的葉制備基因組DNA，并且在用于Weigel T-DNA品系的活化標(biāo)記載體(pSKI015GenBank登錄號AF187951)的T-DNA左側(cè)序列(T-DNA左邊界SEQID NO30)的鄰近區(qū)設(shè)計3種特異引物(TL1SEQ ID NO31；TL2SEQID NO32；TL3SEQ ID NO33)。然后，使用特異引物和隨機(jī)引物1(SEQID NO34)實施TAIL-PCR(用于植物的PCR實驗方法(Protocols ofPCR Experiments for Plants)，(Shimamoto K. & Sasaki T.編輯)，新版，2000，pp 83-89，Shujunsha Co.，Ltd.，Tokyo；Genomics，25，674-681，1995；Plant J.，8，457-463，1995)，并且按下述的PCR反應(yīng)混合物和反應(yīng)條件擴(kuò)增T-DNA鄰近的基因組DNA。在SEQ ID NO34中，n代表a、g、c或t(位置1和11)、s代表g或c(位置7)和w代表a或t(位置8和13)。
第一輪PCR反應(yīng)混合物的組分和PCR條件列于表2和3。
模板(基因組DNA)10ng10xPCR緩沖液(TAKARA BIO Inc制造.) 2μl2.5mM dNTPs(TAKARA BIO Inc.制造) 1.6μl第一特異引物(TL1SEQ ID NO31) 3pmol隨機(jī)引物1(SEQ ID NO34) 80pmolAmpliTaq(Applied Biosystems制造) 0.8單位總體積 20μl[表3]#194℃(1分鐘)/95℃(1分鐘)#294℃(1分鐘)/65℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)×5個循環(huán)#394℃(1分鐘)/25℃(3分鐘)→72℃3分鐘/72℃(3分鐘)×1個循環(huán)#494℃(30秒)/68℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)94℃(30秒)/68℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)94℃(30秒)/44℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)×14個循環(huán)#5 72℃(5分鐘)第二輪PCR反應(yīng)混合物的組分和PCR條件列于表4和5。
模板(第一輪PCR產(chǎn)物50倍稀釋) 1μl10xPCR緩沖液 2μl250μM dNTPs 2μl第二特異引物(TL2SEQ ID NO32) 4pmol
隨機(jī)引物1(SEQ ID NO34)60pmolAmpliTaq0.6單位總體積20μl[表5]#694℃(30秒)/64℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)94℃(30秒)/64℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)94℃(30秒)/44℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)×10個循環(huán)#5 72℃(5分鐘)第三輪PCR反應(yīng)混合物的組分和PCR條件列于表6和7。
模板(第二輪PCR產(chǎn)物50倍稀釋) 1μl10xPCR緩沖液 10μl2.5mM dNTPs 1μl第三特異引物(TL3SEQ ID NO33) 30pmol隨機(jī)引物1(SEQ ID NO34) 300pmolAmpliTaq 3單位總體積 100μl[表7]#794℃(1分鐘)/44℃(1分鐘)/72℃(3分鐘)×20個循環(huán)#5 72℃(5分鐘)下一步，第二輪和第三輪PCR的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，證明擴(kuò)增的存在與否和反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。
此外，使用特異引物TL3(SEQ ID NO33)，利用ABI PRISM DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，對第三輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，然后，利用ABI PRISM 310基因分析儀(AppliedBiosystems)確定核苷酸序列。結(jié)果獲得278bp序列信息(SEQ ID NO35)。在SEQ ID NO35中，n代表a、g、c或t(位置13、35、73、108、156、190、198和201)。在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫中，對獲得的序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)位于BAC克隆F17I23的77240bp處。
(3)分離百草枯抗性基因的cDNA將鼠耳芥(鼠耳芥生態(tài)型Columbia(Col-0))的種子種于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允許于23℃、光強(qiáng)度為100μE/m2/s、16小時光周期/8小時暗周期的光周期下生長約1個月。
生長后，使用液氮對個體的葉進(jìn)行冷凍。隨后，使用RNeasy Plant MiniKit(QIAGEN制造)提取總RNA。此后，使用ProSTAR First StrandRT-PCR Kit(STRATAGEN制造)，從提取的總RNA中合成cDNA。
基于從具有上述(2)中獲得的核苷酸序列(SEQ ID NO35)的結(jié)構(gòu)基因的鄰近10kb內(nèi)推測的開發(fā)讀碼框(ORF)的序列，設(shè)計用于推測的結(jié)構(gòu)基因的引物141dF(SEQ ID NO36)和引物141dR(SEQ ID NO37)，然后，應(yīng)用上述合成的cDNA作為模板，使用這些引物和下述含有TakaraEX-Taq(TAKARA BIO Inc.制造)的反應(yīng)混合物(表8)實施PCR。
模板(cDNA) 50ng10×Ex Taq緩沖液(TAKARA BIO Inc.) 2μldNTPs 200μM每一引物 0.2μMTakara EX-Taq 1單位總體積 20μl應(yīng)用94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)進(jìn)行30個循環(huán)作為反應(yīng)條件。
將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體(Promega制造)，然后使用ABI PRISM 310基因分析儀(Applied Biosystems)，確定其核苷酸序列。結(jié)果獲得857bp的cDNA片段(SEQ ID NO1)。將該cDNA片段稱為AtMVR基因，并且含有AtMVR基因的pGEM-T Easy載體稱為pAtMVR。AtMVR基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
搜索相對于AtMVR基因的AtMVR同源基因基于AtMVR基因的核苷酸序列，在含有鼠耳芥完整核苷酸序列的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)在鼠耳芥基因組上除了AtMVR基因的核苷酸序列還存在13個AtMVR同源基因。
將每一AtMVR同源基因稱為AtMVR3-1-AtMVR3-13。每一AtMVR同源基因的核苷酸序列和對應(yīng)的AtMVR同源基因編碼的推測氨基酸序列如下面表9中所列出的序列號所示。表9也列出AtMVR基因和每一AtMVR同源基因之間的同源性分析結(jié)果。使用BLAST P在氨基酸水平上實施同源性分析。術(shù)語“同一性”指根據(jù)氨基酸的100％一致性。氨基酸的分類基于它們側(cè)鏈的化學(xué)特征。在BLOSUM62氨基酸替代矩陣中，氨基酸分為帶有巰基的氨基酸(C)、具有低分子量的親水氨基酸(S，T，P，A，G)、酸性氨基酸(N，D，E，Q)、堿性氨基酸(H，R，K)、具有低分子量的疏水氨基酸(M，I，L，V)和芳香族氨基酸(F，Y，W)。在表9中，術(shù)語“同一性”在氨基酸方面指100％一致性，術(shù)語“陽性率”指當(dāng)在BLOSUM62氨基酸替代矩陣中具有陽性分值的氨基酸添加至那些具有100％一致性的氨基酸時的數(shù)值[表9]
能在中度嚴(yán)緊條件(70-85％一致性)下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件(85％以上一致性)下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第111-1613位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第111-1613位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與天然的甘藍(lán)型油菜BnMPK9相同功能的蛋白的SEQID NO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語“甘藍(lán)型油菜抗逆信號傳遞的蛋白激酶編碼序列”指具有甘藍(lán)型油菜BnMPK9蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與天然甘藍(lán)型油菜BnMPK9相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括甘藍(lán)型油菜BnMPK9蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnMPK9多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與甘藍(lán)型油菜BnMPK9相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用甘藍(lán)型油菜BnMPK9多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“甘藍(lán)型油菜BnMPK9保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1
<p>在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化體，并通過自花受粉產(chǎn)生T3代植物(具有導(dǎo)入的AtMVR基因的純合子品系)。
下一步，檢測導(dǎo)入的AtMVR基因的表達(dá)量。將上述產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體的種子分別種于含有蛭石(Asahi Kagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允許在光強(qiáng)度為100μE/m2/s、23℃、16小時光周期/8小時暗周期的光周期條件下，生長約1個月。
生長后，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，從轉(zhuǎn)化體和野生型鼠耳芥生態(tài)型Col-0非轉(zhuǎn)化體中提取總RNA。此后，使用ProSTAR FirstStrand RT-PCR Kit(STRATAGEN)，將1μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后，應(yīng)用1/50體積的所合成cDNA為模板，使用AtMVR基因的引物(引物141d1(SEQ ID NO38)和引物141d2(SEQ ID NO39))，用含有Takara EX-Taq(TAKARA BIO)的下述反應(yīng)混合物(表10)實施PCR。
PCR反應(yīng)混合物模板(cDNA) 50ng10x Ex Taq緩沖液(TAKARA BIO Inc.)2μldNTPs200μM每一引物 0.2μMTakara EX-Taq1單位總體積 20μl應(yīng)用94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)進(jìn)行30個循環(huán)作為反應(yīng)條件。
將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上經(jīng)過電泳。圖1顯示電泳結(jié)果。從圖1可看出，與非轉(zhuǎn)化體比較，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體過量表達(dá)AtMVR基因。
評估AtMVR基因轉(zhuǎn)化體的百草枯抗性將來源于所產(chǎn)生的AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體(野生型鼠耳芥生態(tài)型Col-0)的種子無菌接種至含有3μM百草枯(甲基紫精，SigmaChemical Co制造)的1/2MS瓊脂(1％)培養(yǎng)基(2.3g/l Murashige andSkoog Plant Salt Mixture(Wako Pure Chemical Industries Ltd.制造)、1.5mg/l鹽酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/l鹽酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％瓊脂)，并于22℃、光照射60μE/m2/s(每個循環(huán)為16小時光期間/8小時暗期間)下培養(yǎng)8天。培養(yǎng)后，評估發(fā)芽個體的生長。結(jié)果如圖2所示，其中圖2B是顯示AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體在不含百草枯的1/2 MS培養(yǎng)基中生長的圖片，圖2C是顯示AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體在含有百草枯的1/2 MS培養(yǎng)基中生長的圖片。圖2A是顯示圖2B和2C中AtMVR基因轉(zhuǎn)化體和非轉(zhuǎn)化體位置的簡圖。
從圖2B可看出，結(jié)果顯示在不含百草枯的培養(yǎng)基中，AtMVR基因轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出與非轉(zhuǎn)化體同樣的生長。同時，從圖2C可看出，在含有百草枯的培養(yǎng)基中，非轉(zhuǎn)化體發(fā)展為黃萎病，并死亡，即生長受到顯著抑制，而相反，AtMVR基因轉(zhuǎn)化體的幼苗可以生長。因此，可確定在不含百草枯的培養(yǎng)基中，不管AtMVR基因表達(dá)與否，AtMVR基因轉(zhuǎn)化體與非轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出同樣的生長，也可確定在含有百草枯的培養(yǎng)基中，AtMVR基因轉(zhuǎn)化體無疑比非轉(zhuǎn)化體具有更高的百草枯抗性。
分離維管束/毛狀體特異啟動子將鼠耳芥(鼠耳芥生態(tài)型Columbia(Col-0)的種子種于含有蛭石(AsahiKagaku Kogyo Co.，Ltd.)的罐中，并允許在光強(qiáng)度為100μE/m2/s、23℃、在16小時光周期/8小時暗周期的光周期條件下，生長約1個月。
生長后，使用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)，從個體的葉子中制備基因組DNA。下一步，在下述的反應(yīng)條件下，應(yīng)用獲得的基因組DNA為模板，使用基于上述實施例1的AtMVR基因片段(SEQ ID NO35)設(shè)計的引物141dpF(SEQ ID NO40)和引物141dpR(SEQ ID NO41)，使用下述含有Takara EX-Taq(TAKARA BIO Inc.)的反應(yīng)混合物(表11)實施PCR。
模板基因組DNA 50ng10x Ex Taq緩沖液(TAKARA BIO Inc.) 2μldNTPs 200μM每一引物 0.2μMTakara EX-Taq 1單位總體積 20μl反應(yīng)條件是94℃(30秒)/55℃(30秒/72℃(60秒)進(jìn)行30個循環(huán)。
將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEM-T Easy載體(Promega Corp.)，然后使用ABI PRISM 310基因分析儀，確定其核苷酸序列。結(jié)果獲得1722bp(SEQID NO3)的AtMVR啟動子。
分析維管束/毛狀體特異啟動子的組織特異性(1)構(gòu)建具有AtMVR啟動子的表達(dá)載體使用HindIII/PstI，將AtMVR啟動子從實施例5中產(chǎn)生的具有AtMVR啟動子(SEQ ID NO3)的pGEM-T Easy載體上切下，然后亞克隆進(jìn)pBI221(Clontech)的CaMV 35S啟動子上游區(qū)。將得到的載體用PstI/SmaI處理，以除去CaMV 35S啟動子，末端用DNA T4聚合酶(TAKARA BIOInc.)補(bǔ)平，并允許自連接。結(jié)果，AtMVR啟動子連接入載體的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因上游。隨后，使用HindIII/EcoRI，將含有AtMVR啟動子和GUS基因的片段從上述載體中切下，然后替換為pBI121(Clontech)的CaMV 35S啟動子-β-GUS基因。這樣獲得的載體用作下面使用的、具有AtMVR啟動子的表達(dá)載體。
(2)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物以實施例3(2)中的類似方法，將上述具有AtMVR啟動子的表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404株，然后通過滲入法，將所述農(nóng)桿菌菌株導(dǎo)入野生型鼠耳芥生態(tài)型Col-0。此后，在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化體，并通過自花受粉產(chǎn)生T3代植物。
(3)分析AtMVR啟動子的組織特異性將來源于上述(2)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體的種子無菌接種于1/2MS瓊脂(1％)培養(yǎng)基(2.3g/l Murashige and Skoog Plant Salt Mixture(Wako PureChemical Industries Ltd.制造)、1.5mg/l鹽酸硫胺素、2.5mg/l尼克酸、0.25mg/i鹽酸吡哆醇、1.5％蔗糖、1％瓊脂)，并于22℃、光照射60μE/m2/s(每個循環(huán)為16小時光期間/8小時暗期間)下培養(yǎng)約7天。
培養(yǎng)后，將長出的轉(zhuǎn)化體用丙酮固定。將含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸(X-Gluc)的反應(yīng)混合物加至固定的組織以浸沒全部組織。反應(yīng)混合物的組成是1.9mM X-Gluc、0.5mM K3Fe(CN)6、0.5mM K4Fe(CN)6和0.3％Triton X-100。
然后將容器密封，并在37℃保溫箱中過夜孵育。此后，將70％乙醇加至混合物以終止反應(yīng)，并觀察染色(用于觀察植物細(xì)胞的實驗方法(Protocols of Experiments for Observing Cells of Plants)，F(xiàn)ukuda H.，Nishimura M.，& Nakamura K.編輯，(1997)，71-79頁，Shujunsha Co.，Ltd.，Tokyo)。結(jié)果如圖3-5所示，其中圖3-5分別是完整轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)化體的葉子和轉(zhuǎn)化體的根的顯微照片。
從圖3-5可看出，在維管束和毛狀體中可觀察到特異染色。因此，可確定獲得的AtMVR啟動子(SEQ ID NO3)是在維管束和毛狀體中具有組織特異轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄啟動子。
序列表自由文本SEQ ID NO31-41是引物。
在SEQ ID NO34中，n代表a、g、c或t(位置1和11)，s代表g或c(位置7)，以及w代表a或t(位置8和13)。
在SEQ ID NO35中，n代表a、g、c或t(位置13、35、73、108、156、190、198和201)。
工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，提供了百草枯抗性基因以及維管束和毛狀體特異啟動子。根據(jù)本發(fā)明的百草枯抗性基因可賦予百草枯抗性同時不影響在不同環(huán)境下植物通過產(chǎn)生活性氧而對生長的調(diào)節(jié)。
此外，根據(jù)本發(fā)明的維管束和毛狀體特異啟動子可調(diào)節(jié)植物的維管束和毛狀體中的基因表達(dá)。
序列表<110>豐田自動車株式會社岡山縣<120>百草枯抗性基因及維管束和毛狀體特異性啟動子<130>PH-2160<140>
<141>
<150>JP 2003-322051<151>2003-09-12<160>41<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>855<212>DNA<213>鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)<400>1cttcttcaat catcaccatg gtacgtttta gtaacagtct tgtaggaata ctcaacttct 60tcgtcttcct tctctcggtt cccatactct caaccggaat ctggctcagc cttaaagcca 120cgacgcaatg cgagagattc ctcgacaaac ccatgatcgc tctcggtgtt ttcctcatga 180taatcgcaat cgctggagtc gttggatctt gttgcagagt gacgtggctt ctctggtcct 240atctctttgt gatgttcttc ttaatcctca tcgtcctctg tttcaccatc tttgccttcg 300
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Cys Cys Arg Val Thr Trp Leu Leu Trp Ser Tyr Leu Phe Val Met Phe65 70 75 80Phe Leu Ile Leu Ile Val Leu Cys Phe Thr Ile Phe Ala Phe Val Val85 90 95Thr Ser Lys Gly Ser Gly Glu Thr Ile Gln Gly Lys Ala Tyr Lys Glu100 105 110Tyr Arg Leu Glu Ala Tyr Ser Asp Trp Leu Gln Arg Arg Val Asn Asn115 120 125Ala Lys His Trp Asn Ser Ile Arg Ser Cys Leu Tyr Glu Ser Lys Phe130 135 140Cys Tyr Asn Leu Glu Leu Val Thr Ala Asn His Thr Val Ser Asp Phe145 150 155 160Tyr Lys Glu Asp Leu Thr Ala Phe Glu Ser Gly Cys Cys Lys Pro Ser165 170 175Asn Asp Cys Asp Phe Thr Tyr Ile Thr Ser Thr Thr Trp Asn Lys Thr180 185 190Ser Gly Thr His Lys Asn Ser Asp Cys Gln Leu Trp Asp Asn Glu Lys195 200 205His Lys Leu Cys Tyr Asn Cys Lys Ala Cys Lys Ala Gly Phe Leu Asp210 215 220
Asn Leu Lys Ala Ala Trp Lys Arg Val Ala Ile Val Asn Ile Ile Phe225 230 235 240Leu Val Leu Leu Val Val Val Tyr Ala Met Gly Cys Cys Ala Phe Arg245 250 255Asn Asn Lys Glu Asp Arg Tyr Gly Arg Ser Asn Gly Phe Asn Asn Ser260 265 270<210>3<211>1722<212>DNA<213>鼠耳芥<400>3agccaagctt gtacattaac cgtgactatt attattattt ttaatgaaat tatttttttc 60tttctcccat acattttata tgattcgttt cttttaggat tattataaaa tctaaatgat 120tcgtttctct taagacaagc aaaaaccgaa aaaaggacag cctattatac cgcgttaatt 180taaagttaat cgtgattgtg ttaatcttga aatgtatttg aacatttttg ttttcttaat 240acagaattga ttgatgtaag gcagcaaata ttttcctacc aaaataattt gttagggatc 300ttttagaaaa agaaataaaa taaaaaaaag ggaataagga cagctgggaa gagtgggaca 360gcagagaaag tggtggtgta cggtaaccgt tggatccgat gaggaattta ataaaggtag 420tcgtaatctt acggtccagc tgtgaagtac tcatgccacg ttatcttctc caccgacagt 480acattgttac tatagcagct atagtatagc ctattcaatc atttgtattt taatggtaag 540caaagaggaa actatgtaga agtttcttat cttatagttt ctcaagtctt ttagttttgg 600ttccataatc ctttttttag tatgtgaagg tgaaggtgag tttagtatgt gatttttagt 660
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cttttgattc tccttgtgtt ctgtataaca gtttttgcct ttgttgttac taacaaagga 300gctggtgaag ctattgaagg aaaaggttat aaagagtata aacttggtga ttactctact 360tggttacaga aacgtgttga gaatggtaaa aattggaata agattaggag ttgtcttgtg 420gagagcaaag tttgttctaa gcttgaagcc aagtttgtta atgttcctgt caatagtttc 480tacaaggaac atcttactgc tcttcagtct ggttgctgca aaccttcaga tgaatgtggt 540ttcgagtacg taaacccaac aacctggacc aagaacacaa cgggaacaca cactaatcca 600gactgccaaa cctgggacaa cgcaaaagaa aagctctgct tcgattgtca atcttgtaaa 660gcgggtctac tcgacaacgt caaaagcgct tggaagaaag ttgcaatcgt taacatcgtc 720ttccttgtct tcctcatcat tgtctactct gttggttgct gtgctttcag gaacaacaag 780agggatgaca gttattcccg tacctacgga tataagcctt ga822<210>5<211>272<212>PRT<213>鼠耳芥<400>5Met Ala Arg Cys Ser Asn Asn Leu Val Gly Ile Leu Asn Phe Leu Val1 5 10 15Phe Leu Leu Ser Ile Pro Ile Leu Ala Gly Gly Ile Trp Leu Ser Gln20 25 30Iys Gly Ser Thr Glu Cys Glu Arg Phe Leu Asp Lys Pro Val Ile Ala35 40 45Leu Gly Val Phe Leu Met Val Val Ala Ile Ala Gly Leu Ile Gly Ser50 55 60
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tctaagatca ctcctctcca gtccggctgc tgcaaaccac caaccgcatg tggctacaac 540tttgtgaacc caacactgtg gctaaatcca accaatatgg ctgcagacgc agactgttac 600ttatggagca atgaccaaag ccagctttgt tacaattgca actcatgcaa agctggttta 660ttgggaaacc ttagaaaaga atggcgtaaa gcaaatctca tacttatcat cacagtcgtt 720gttctcatat gggtttatgt tattgcttgt agcgcgttta ggaatgctca gactgaggat 780ctcttccgca aatacaaaca aggttgggtc taa 813<210>17<211>270<212>PRT<213>鼠耳芥<400>17Met Ala Leu Ala Asn Asn Leu Thr Ala Ile Leu Asn Leu Leu Ala Leu1 5 10 15Leu Cys Ser Ile Pro Ile Thr Ala Ser Gly Ile Trp Leu Ala Ser Lys20 25 30Pro Asp Asn Glu Cys Val Asn Leu Leu Arg Trp Pro Val Val Val Leu35 40 45Gly Val Leu Ile Leu Val Val Ser Ala Thr Gly Phe Ile Gly Ala Tyr50 55 60Lys Tyr Lys Glu Thr Leu Leu Ala Val Tyr Leu Cys Cys Met Ala Ile65 70 75 80Leu Ile Gly Leu Leu Leu Val Val Leu Ile Phe Ala Phe Val Val Thr
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245 250 255Gln Thr Glu Asp Leu Phe Arg Lys Tyr Lys Gln Gly Trp Val260 265 270<210>18<211>816<212>DNA<213>鼠耳芥<400>18atgtttcgag ttagcaattt catggttggt ctagcaaaca cattggtgat gttagtgggc 60gcttcggcca ttggttattc gatttacatg ttcgttcacc aaggcgtcac tgattgtgaa 120tctgccattc ggataccact tctcacgacc ggactcatcc tcttcttggt gtctttgctc 180ggagtgattg gatcttgttt caaggagaat ttggcaatgg tttcctactt gatcatattg 240tttgggggca ttgttgcatt gatgattttc tccatatttc tcttctttgt gaccaacaaa 300ggagccggtc gtgtggtgtc cggtcgaggg tataaagagt accggacggt ggatttctcg 360acgtggctta atgggttcgt tggtgggaag agatgggttg ggataaggtc ttgtttggct 420gaggctaacg tttgtgatga tttgagtgat ggtcgtgtta gtcagatcgc tgatgcgttt 480tatcacaaga acttgtctcc catccagtca ggttgttgta agccaccatc ggattgcaac 540ttcgagttca gaaacgcgac gttctggata ccgccgagca aaaacgaaac ggcagttgcg 600gaaaacgggg actgtggtac gtggagcaac gtgcaaacag agttatgttt caactgcaac 660gcatgcaaag cgggtgtgtt agcgaacata agagagaagt ggaggaatct tcttgttttc 720aacatttgtc tcctcattct cctcataacc gtctattcct gcggttgctg tgctcgtcgt 780aacaatcgga cggctaggaa aagtgattct gtctga 816<210>19<211>271
<212>PRT<213>鼠耳芥<400>19Met Phe Arg Val Ser Asn Phe Met Val Gly Leu Ala Asn Thr Leu Val1 5 10 15Met Leu Val Gly Ala Ser Ala Ile Gly Tyr Ser Ile Tyr Met Phe Val20 25 30His Gln Gly Val Thr Asp Cys Glu Ser Ala Ile Arg Ile Pro Leu Leu35 40 45Thr Thr Gly Leu Ile Leu Phe Leu Val Ser Leu Leu Gly Val Ile Gly50 55 60Ser Cys Phe Lys Glu Asn Leu Ala Met Val Ser Tyr Leu Ile Ile Leu65 70 75 80Phe Gly Gly Ile Val Ala Leu Met Ile Phe Ser Ile Phe Leu Phe Phe85 90 95Val Thr Asn Lys Gly Ala Gly Arg Val Val Ser Gly Arg Gly Tyr Lys100 105 110Glu Tyr Arg Thr Val Asp Phe Ser Thr Trp Leu Asn Gly Phe Val Gly115 120 125Gly Lys Arg Trp Val Gly Ile Arg Ser Cys Leu Ala Glu Ala Asn Val130 135 140
Cys Asp Asp Leu Ser Asp Gly Arg Val Ser Gln Ile Ala Asp Ala Phe145 150 155 160Tyr His Lys Asn Leu Ser Pro Ile Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro165 170 175Ser Asp Cys Asn Phe Glu Phe Arg Asn Ala Thr Phe Trp Ile Pro Pro180 185 190Ser Lys Asn Glu Thr Ala Val Ala Glu Asn Gly Asp Cys Gly Thr Trp195 200 205Ser Asn Val Gln Thr Glu Leu Cys Phe Asn Cys Asn Ala Cys Lys Ala210 215 220Gly Val Leu Ala Asn Ile Arg Glu Lys Trp Arg Asn Leu Leu Val Phe225 230 235 240Asn Ile Cys Leu Leu Ile Leu Leu Ile Thr Val Tyr Ser Cys Gly Cys245 250 255Cys Ala Arg Arg Asn Asn Arg Thr Ala Arg Lys Ser Asp Ser Val260 265 270<210>20<211>705<212>DNA<213>鼠耳芥
<400>20atgagcaata cagtgatagg attcttgaat atcctaacac taatttcctc catagttcta 60ttaggatcag ctctatggat gggtaggagc aaaacgacat gcgagcattt tcttcagaag 120ccacttttga tcttaggcct agctatcttg atcttgtcag tagctggtct agtcggtgca 180tgttgtgacg tggcttgggt cttgtgggtg tacctcttct tcatggtctt catcatagtc 240gcactcatgg gtttgacctt gtttggattc atagtgacta gccatagtgg tggtgtggtt 300gtcgatggta gggtttataa agagtttaag cttgaagcat atcacccttg gcttaagaca 360agggtggtag atactaatta ttgggttact ataaagactt gtctcttggg ctcagtcact 420tgttccaagc tcgctctttg gactcctctt gattatctcc aaaaagactt atctcctctt 480cagctgttta ctgtgttggc tgttgcgcgt ttaaaaacgc caaacgccct caacattacg 540gcttccctta tggacgttac ggcatgtcca aatccagacc tggatgggaa cagtcctggt 600ttgttctctt ttctaatgca acaattattt ttattatttt cgcggcatgt aggtcaaggt 660ggtggcatgg gagagatcgg tattagtgaa aaatatttat gttaa 705<210>21<211>234<212>PRT<213>鼠耳芥<400>21Met Ser Asn Thr Val Ile Gly Phe Leu Asn Ile Leu Thr Leu Ile Ser1 5 10 15Ser Ile Val Leu Leu Gly Ser Ala Leu Trp Met Gly Arg Ser Lys Thr20 25 30Thr Cys Glu His Phe Leu Gln Lys Pro Leu Leu Ile Leu Gly Leu Ala35 40 45
Ile Leu Ile Leu Ser Val Ala Gly Leu Val Gly Ala Cys Cys Asp Val50 55 60Ala Trp Val Leu Trp Val Tyr Leu Phe Phe Met Val Phe Ile Ile Val65 70 75 80Ala Leu Met Gly Leu Thr Leu Phe Gly Phe Ile Val Thr Ser His Ser85 90 95Gly Gly Val Val Val Asp Gly Arg Val Tyr Lys Glu Phe Lys Leu Glu100 105 110Ala Tyr His Pro Trp Leu Lys Thr Arg Val Val Asp Thr Asn Tyr Trp115 120 125Val Thr Ile Lys Thr Cys Leu Leu Gly Ser Val Thr Cys Ser Lys Leu130 135 140Ala Leu Trp Thr Pro Leu Asp Tyr Leu Gln Lys Asp Leu Ser Pro Leu145 150 155 160Gln Leu Phe Thr Val Leu Ala Val Ala Arg Leu Lys Thr Pro Asn Ala165 170 175Leu Asn Ile Thr Ala Ser Leu Met Asp Val Thr Ala Cys Pro Asn Pro180 185 190Asp Leu Asp Gly Asn Ser Pro Gly Leu Phe Ser Phe Leu Met Gln Gln195 200 205
Leu Phe Leu Leu Phe Ser Arg His Val Gly Gln Gly Gly Gly Met Gly210 215 220Glu Ile Gly Ile Ser Glu Lys Tyr Leu Cys225 230<210>22<211>795<212>DNA<213>鼠耳芥<400>22atgctccggc taagcaacgc cgccgtaata acaaccaatg caattctcgc attgatcggc 60ctcgccgctc tatctttttc cgtctacgtc tacgttcaag gcccatcaca gtgtcaacgt 120ttcgttcaaa accctctcat tgtaactgcg gctctcctct tcttcatctc gtccttaggc 180cttatcgctg ctctctacgg tagccacatc atcatcacac tctatctctt cttccttttc 240ctctccattc ttctgcttct tgtcctctct gtctttatct tcctcgtcac gaatcccacc 300gccggaaaag cgttatccgg tagaggaata ggcaatgtca agaccggaga ttatcagaac 360tggatcggga accatttcct tcgtgggaag aattgggaag ggatcaccaa atgtttgtct 420gattctaggg tttgtaaaag gtttggtcca cgtgacattg actttgactc caaacatctc 480tctaatgtac agtttggttg ttgtcgacct cccgtagaat gtgggttcga atcaaagaat 540gccacgtggt ggacagttcc tgccacagcg actacggcga ttatagggga ttgtaaggca 600tggagtaaca cgcagagaca gttatgttac gcgtgcgagt cgtgtaagat tggagtttta 660aaagggataa gaaaaagatg gaggatactt attgtcgtca atctccttct tatccttctc 720gtcgtttttc tttactcgtg tggctgttgc gtgagaaaga acaatcgtgt tccatggaag 780cgccggttct tctaa 795
<210>23<211>264<212>PRT<213>鼠耳芥<400>23Met Leu Arg Leu Ser Asn Ala Ala Val Ile Thr Thr Asn Ala Ile Leu1 5 10 15Ala Leu Ile Gly Leu Ala Ala Leu Ser Phe Ser Val Tyr Val Tyr Val20 25 30Gln Gly Pro Ser Gln Cys Gln Arg Phe Val Gln Asn Pro Leu Ile Val35 40 45Thr Ala Ala Leu Leu Phe Phe Ile Ser Ser Leu Gly Leu Ile Ala Ala50 55 60Leu Tyr Gly Ser His Ile Ile Ile Thr Leu Tyr Leu Phe Phe Leu Phe65 70 75 80Leu Ser Ile Leu Leu Leu Leu Val Leu Ser Val Phe Ile Phe Leu Val85 90 95Thr Asn Pro Thr Ala Gly Lys Ala Leu Ser Gly Arg Gly Ile Gly Asn100 105 110Val Lys Thr Gly Asp Tyr Gln Asn Trp Ile Gly Asn His Phe Leu Arg115 120 125
Gly Lys Asn Trp Glu Gly Ile Thr Lys Cys Leu Ser Asp Ser Arg Val130 135 140Cys Lys Arg Phe Gly Pro Arg Asp Ile Asp Phe Asp Ser Lys His Leu145 150 155 160Ser Asn Val Gln Phe Gly Cys Cys Arg Pro Pro Val Glu Cys Gly Phe165 170 175Glu Ser Lys Asn Ala Thr Trp Trp Thr Val Pro Ala Thr Ala Thr Thr180 185 190Ala Ile Ile Gly Asp Cys Lys Ala Trp Ser Asn Thr Gln Arg Gln Leu195 200 205Cys Tyr Ala Cys Glu Ser Cys Lys Ile Gly Val Leu Lys Gly Ile Arg210 215 220Lys Arg Trp Arg Ile Leu Ile Val Val Asn Leu Leu Leu Ile Leu Leu225 230 235 240Val Val Phe Leu Tyr Ser Cys Gly Cys Cys Val Arg Lys Asn Asn Arg245 250 255Val Pro Trp Lys Arg Arg Phe Phe260<210>24<211>654
<212>DNA<213>鼠耳芥<400>24atgattgatt ttcctttgaa gtatcttgcc gtgctcctga tcgttttgat cgcgattctt 60gtctttaccg tactggcgtt cattgtaaca aacaatggtt ctggccatac taaccctggt 120ttaaggtaca aggagtataa gctgaatgat tacagctcat ggtttctaaa acagcttaac 180aacaccagta actggataag actaaagagt tgtcttgtta aatccgagca atgtcggaag 240ctttccaaga aatacaagac catcaaacag ttgaaatccg cagaattaac cccgatagaa 300gctggatgtt gtcgaccacc atctgagtgt ggttatcctg cggtgaatgc ttcttactat 360gacttgagct ttcattcgat aagttctaac aaagattgta agctttacaa gaatttgagg 420actatcaagt gctacaactg tgattcttgc aaagctggag ttgctcagta catgaaaacc 480gagtggcgac ttgttgcgat cttcaatgtg gtcctgtttg ttgtcttgat aagctctctt 540cttagcacga gatttgactc tgaacaaagt tttggccttt taaacggttt agtgcaaatt 600tccaacataa cctttaaaga ttgccaaacc acaacagtac caaaacagtt ttaa 654<210>25<211>217<212>PRT<213>鼠耳芥<400>25Met Ile Asp Phe Pro Leu Lys Tyr Leu Ala Val Leu Leu Ile Val Leu1 5 10 15Ile Ala Ile Leu Val Phe Thr Val Leu Ala Phe Ile Val Thr Asn Asn20 25 30Gly Ser Gly His Thr Asn Pro Gly Leu Arg Tyr Lys Glu Tyr Lys Leu
35 40 45Asn Asp Tyr Ser Ser Trp Phe Leu Lys Gln Leu Asn Asn Thr Ser Asn50 55 60Trp Ile Arg Leu Lys Ser Cys Leu Val Lys Ser Glu Gln Cys Arg Lys65 70 75 80Leu Ser Lys Lys Tyr Lys Thr Ile Lys Gln Leu Lys Ser Ala Glu Leu85 90 95Thr Pro Ile Glu Ala Gly Cys Cys Arg Pro Pro Ser Glu Cys Gly Tyr100 105 110Pro Ala Val Asn Ala Ser Tyr Tyr Asp Leu Ser Phe His Ser Ile Ser115 120 125Ser Asn Lys Asp Cys Lys Leu Tyr Lys Asn Leu Arg Thr Ile Lys Cys130 135 140Tyr Asn Cys Asp Ser Cys Lys Ala Gly Val Ala Gln Tyr Met Lys Thr145 150 155 160Glu Trp Arg Leu Val Ala Ile Phe Asn Val Val Leu Phe Val Val Leu165 170 175Ile Ser Ser Leu Leu Ser Thr Arg Phe Asp Ser Glu Gln Ser Phe Gly180 185 190Leu Leu Asn Gly Leu Val Gln Ile Ser Asn Ile Thr Phe Lys Asp Cys
195 200 205Gln Thr Thr Thr Val Pro Lys Gln Phe210 215<210>26<211>837<212>DNA<213>鼠耳芥<400>26atggcgagag ataaagaaga tcaaaacaat gagaatcctt caattgtcca gaacatgtca 60tttccattca acaccatttt cttgatctca agcgcaatct tcctcgtcac agccgctttc 120tggttcgtag ccgtcatgac attacattac aggaccgatg aatgtaaccg gttcgtcaca 180actcccggaa tattcataag cttctcattg cttgctatgt ccctcactgg attctacgca 240gcttacttca aatccgattg tctctttcga atccacttct ttatcttctt cttgtggatg 300ttcgttgtcg tgtctaaagc aatctttgtc atctttctac ataaggagac caatcctaga 360ttgtttcctg ggaccaagat ttatgagttt aggtacgagg attactcagg atgggttagt 420agattggtca tcaaagacga tgaatggtat cgtacaagga gatgtcttgt taaggacaat 480gtttgtaaca ggctaaacca taagatgcca gcttctgagt tttatcagat gaatctaact 540cctatacagt cgggttgttg caaaccacca ctttcatgtg gattgaatta cgagaaacca 600aataattgga cagtttcaag atattataac aatttagaag ttgattgcaa gagatggaac 660aattctgcag atacattatg cttcgattgt gattcatgta aagctgtgat tattgctgat 720gtacataata cttcattttc cataacagtt aacattattc atatcatctt tagtctttgt 780atcggcatga ccggttggtt tgcctggtta aggatccttc gagaaagtca gaaatag837<210>27<211>278
<212>PRT<213>鼠耳芥<400>27Met Ala Arg Asp Lys Glu Asp Gln Asn Asn Glu Asn Pro Ser Ile Val1 5 10 15Gln Asn Met Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ile Phe Leu Ile Ser Ser Ala20 25 30Ile Phe Leu Val Thr Ala Ala Phe Trp Phe Val Ala Val Met Thr Leu35 40 45His Tyr Arg Thr Asp Glu Cys Asn Arg Phe Val Thr Thr Pro Gly Ile50 55 60Phe Ile Ser Phe Ser Leu Leu Ala Met Ser Leu Thr Gly Phe Tyr Ala65 70 75 80Ala Tyr Phe Lys Ser Asp Cys Leu Phe Arg Ile His Phe Phe Ile Phe85 90 95Phe Leu Trp Met Phe Val Val Val Ser Lys Ala Ile Phe Val Ile Phe100 105 110Leu His Lys Glu Thr Asn Pro Arg Leu Phe Pro Gly Thr Lys Ile Tyr115 120 125Glu Phe Arg Tyr Glu Asp Tyr Ser Gly Trp Val Ser Arg Leu Val Ile130 135 140
Lys Asp Asp Glu Trp Tyr Arg Thr Arg Arg Cys Leu Val Lys Asp Asn145 150 155 160Val Cys Asn Arg Leu Asn His Lys Met Pro Ala Ser Glu Phe Tyr Gln165 170 175Met Asn Leu Thr Pro Ile Gln Ser Gly Cys Cys Lys Pro Pro Leu Ser180 185 190Cys Gly Leu Asn Tyr Glu Lys Pro Asn Asn Trp Thr Val Ser Arg Tyr195 200 205Tyr Asn Asn Leu Glu Val Asp Cys Lys Arg Trp Asn Asn Ser Ala Asp210 215 220Thr Leu Cys Phe Asp Cys Asp Ser Cys Lys Ala Val Ile Ile Ala Asp225 230 235 240Val His Asn Thr Ser Phe Ser Ile Thr Val Asn Ile Ile His Ile Ile245 250 255Phe Ser Leu Cys Ile Gly Met Thr Gly Trp Phe Ala Trp Leu Arg Ile260 265 270Leu Arg Glu Ser Gln Lys275<210>28
<211>816<212>DNA<213>鼠耳芥<400>28atgggaacat tgatggcact tgtgaacatt ttagccgctg gtgtccttcc gatcttcact 60ttcgtcctct cacttacact cctcggctac gcagtgtggc ttctttacat gcgtagctac 120gactgcgaag atattctcgg tctgccacgt gtccagacgc tagctagtgt cggtcttctc 180gcggtgtttg ttgtcagcaa cgcagctctg tttttgcggc ggaagtttcc gatgcctgca 240cttgtggtga tggtggtggt cttgttgtta atgcttttca tcggtttggc gtatgccgga 300gtaaatgaga tgcaaagccg gcggtttccg gcgacaagga tgtggttcaa gctcaaaatc 360atggacgatc atgtgacctg gaacaatatc aaatcgtgtg tctatgataa aggagcttgc 420aacgacctca tttacggatc tccaaatgaa aaaccttaca atagaagaaa aatgccacca 480atcaagaatg gatgttgtat gccaccagag acatgtaaca tggacgcgat aaacgcgacg 540ttttggtaca gaagaaaaga cgaaggacca ccgtcgtcta tgaacctaat gtacggtgat 600gagatgatgg tgggaaggat tagcgactgt caactatgga ggaacgattg gagcatttta 660tgctatgatt gtagatcttg taagttcgga ttcataagat cggtaaggag gaaatggtgg 720cagctcggta tcttcttgat cgtcatttcc attcttcttc tcatgtctca tctcttgatc 780ttcttggcta ctttttggga acgattcaag ggttag 816<210>29<211>271<212>PRT<213>鼠耳芥<400>29Met Gly Thr Leu Met Ala Leu Val Asn Ile Leu Ala Ala Gly Val Leu1 5 10 15
Pro Ile Phe Thr Phe Val Leu Ser Leu Thr Leu Leu Gly Tyr Ala Val20 25 30Trp Leu Leu Tyr Met Arg Ser Tyr Asp Cys Glu Asp Ile Leu Gly Leu35 40 45Pro Arg Val Gln Thr Leu Ala Ser Val Gly Leu Leu Ala Val Phe Val50 55 60Val Ser Asn Ala Ala Leu Phe Leu Arg Arg Lys Phe Pro Met Pro Ala65 70 75 80Leu Val Val Met Val Val Val Leu Leu Leu Met Leu Phe Ile Gly Leu85 90 95Ala Tyr Ala Gly Val Asn Glu Met Gln Ser Arg Arg Phe Pro Ala Thr100 105 110Arg Met Trp Phe Lys Leu Lys Ile Met Asp Asp His Val Thr Trp Asn115 120 125Asn Ile Lys Ser Cys Val Tyr Asp Lys Gly Ala Cys Asn Asp Leu Ile130 135 140Tyr Gly Ser Pro Asn Glu Lys Pro Tyr Asn Arg Arg Lys Met Pro Pro145 150 155 160Ile Lys Asn Gly Cys Cys Met Pro Pro Glu Thr Cys Asn Met Asp Ala165 170 175
Ile Asn Ala Thr Phe Trp Tyr Arg Arg Lys Asp Glu Gly Pro Pro Ser180 185 190Ser Met Asn Leu Met Tyr Gly Asp Glu Met Met Val Gly Arg Ile Ser195 200 205Asp Cys Gln Leu Trp Arg Asn Asp Trp Ser Ile Leu Cys Tyr Asp Cys210 215 220Arg Ser Cys Lys Phe Gly Phe Ile Arg Ser Val Arg Arg Lys Trp Trp225 230 235 240Gln Leu Gly Ile Phe Leu Ile Val Ile Ser Ile Leu Leu Leu Met Ser245 250 255His Leu Leu Ile Phe Leu Ala Thr Phe Trp Glu Arg Phe Lys Gly260 265 270<210>30<211>24<212>DNA<213>
<400>30gcggcagcgg cggcaggata tatt 24<210>31<211>24
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>31tgctttcgcc tataaatacg acgg24<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>32cgctgcggac atctacattt ttg 23<210>33<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>33tcccggacat gaagccattt ac 22<210>34<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>修飾堿基<222>1和11<223>n代表a，g，c或t<220>
<221>修飾堿基<222>7<223>s代表g或c<220>
<221>修飾堿基<222>8和13<223>w代表a或t<220>
<223>人工序列的描述引物<400>34ngtcgaswga nawgaa 16
<210>35<211>278<212>DNA<213>
<220>
<221>修飾堿基<222>13，35，73，108，156，190，198和201<223>n代表a，g，c或t<400>35tgtggcaaac tcngagtagg aatggagaat ccaancgttt gggtctttct caaggaagaa 60agtgacgact gcncattgta ttgctccgaa taaacacatc catgctgnta aagagaggtt 120atctggatag taggcagaga ttggaaccta gggttntgtt gaaacaaaac tcacatttct 180tgtaagacan gaaacatnca ncaacaaaaa gtttagactt ttgatttatt taatgaagtt 240acctgaagta taagccaaaa ggaccaacaa agagtgct 278<210>36<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>36cttcttcaat catcaccatg 20
<210>37<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>37tagcttgaac cggcgcaaat20<210>38<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>38gtacgtttta gtaacagtct20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述引物<400>39gattagcagt gactaactcc 20<210>40<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>40agcttgtaca ttaaccgtga ct 22<210>41<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>41ctgcagggtg atgattgaag aagat 2
權(quán)利要求
1.編碼下述(a)或(b)的蛋白質(zhì)的基因(a)由SEQ ID NO2代表的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，以及(b)與SEQ ID NO2代表的氨基酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)。
2.賦予百草枯抗性的蛋白質(zhì)，其由如權(quán)利要求1所述的基因編碼。
3.重組載體，其包含如權(quán)利要求1所述的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組載體，其中重組載體還包含外源基因或外源DNA片段。
5.轉(zhuǎn)化體，其具有如權(quán)利要求3或4所述的重組載體。
6.植物體，其具有如權(quán)利要求3或4所述的重組載體并具有百草枯抗性。
7.篩選轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括將權(quán)利要求4所述的重組載體導(dǎo)入植物，并在以百草枯抗性為指標(biāo)的基礎(chǔ)上篩選轉(zhuǎn)基因植物。
8.維管束和毛狀體特異性啟動子，其包含下述(a)、(b)或(c)的DNA(a)由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA；(b)與SEQ ID NO3代表的核苷酸序列相比，由具有替代、缺失或添加一個或多個核苷酸的核苷酸序列組成、并作為維管束和毛狀體特異性啟動子發(fā)揮功能的DNA；以及(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與由SEQ ID NO3代表的核苷酸序列組成的DNA雜交、并作為維管束和毛狀體特異啟動子發(fā)揮功能的DNA。
9.重組載體，其包含如權(quán)利要求8所述的維管束和毛狀體特異性啟動子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組載體，其中重組載體包含維管束和毛狀體特異啟動子下游的外源基因或外源DNA片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組載體，其中外源基因為如權(quán)利要求1所述的基因。
12.轉(zhuǎn)基因植物，其具有如權(quán)利要求9-11中任意一項所述的重組載體。
全文摘要
提供了百草枯抗性基因以及提供了維管束和毛狀體特異啟動子。通過鑒定和分析鼠耳芥基因而分離了百草枯抗性基因以及維管束和毛狀體特異啟動子。
文檔編號C12N1/21GK1594571SQ200410074700
公開日2005年3月16日 申請日期2004年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月12日
發(fā)明者伊藤壽, 田中良和, 小川健一, 近藤聰, 大音德, 古澤嚴(yán) 申請人:豐田自動車株式會社, 岡山縣