專利名稱：一種短密青霉菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型微生物及其用途，尤其涉及一種短密青霉菌及其在制備霉酚酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
免疫抑制劑在器官移植中用于防治排斥反應(yīng)，即干擾受體對(duì)外來抗原的識(shí)別和非自身細(xì)胞的清除。1954年，人類第一例同卵雙生子間腎臟移植的手術(shù)取得成功以后，至今40多年來醫(yī)學(xué)科學(xué)在器官移植方面的研究有了很多重大的突破。1978年，環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)的臨床使用為器官移植開辟了新紀(jì)元。大多數(shù)患者腎移植2a存活率已超過80％，而患者生存率也有所提高。近年來，新的免疫抑制劑層出不窮，其中霉酚酸酯就是其中較好的一個(gè)。
霉酚酸酯(mycophenolate mofetil，MMF)是青霉屬產(chǎn)生的具有抗代謝的霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)的半合成物，是霉酚酸(MPA)的2-乙基酯類衍生物，脫酯化合形成具有免疫抑制活性的代謝物。MPA是高效、選擇性、非競爭性、可逆性抑制次黃嘌呤脫氫酶阻斷鳥嘌呤核苷酸的起始合成途徑，使鳥嘌呤核苷酸耗盡，進(jìn)而阻斷DNA的合成。MPA選擇性的作用于T、B淋巴細(xì)胞，抑制其增殖。再在動(dòng)物腎移植實(shí)驗(yàn)及臨床腎移植中已證實(shí)霉酚酸酯在對(duì)腎移植后排斥反應(yīng)的預(yù)防和難治性排斥的治療中起著重要的作用。
抑制淋巴細(xì)胞增殖所需的MPA濃度，對(duì)大多數(shù)淋巴細(xì)胞無抑制作用，MPA還能通過直接抑制B細(xì)胞的增殖來抑制抗體的形成。治療量的MMF并不抑制多糖激活人外周淋巴細(xì)胞產(chǎn)生白介素-I，也不抑制有絲分裂原激活的外周淋巴細(xì)胞合成白介素-II和其受體表達(dá)，這點(diǎn)也不同于環(huán)孢素、FK-506。此外，MPA介導(dǎo)的體外淋巴細(xì)胞三磷酸鳥苷的耗竭可抑制甘露糖和巖藻糖轉(zhuǎn)化成糖蛋白。通過這種機(jī)制，MPA可降低淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞在慢性炎癥部位的聚集。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明既是為了提供一種新的高單位的霉酚酸產(chǎn)生菌，及該菌種在制備霉酚酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種短密青霉菌廣西變種YMS-110，分類命名為Penicilliumbrevicompactum var.YMS-110，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO.M 204096，保藏日期為2004年12月15日。所述的短密青霉菌變種YMS-110的菌種于1993年4月自廣西岑溪土柱山區(qū)土壤樣品分離得到。
所述的短密青霉菌變種YMS-110的菌落特性在PDA上菌絲生長良好，菌落呈灰綠色絮狀，菌落表面有少量放射性褶皺，邊緣匍匐狀，背面黃褐色，分生孢子梗多輪，分枝似帚，帚狀枝分枝多，短而緊密，瓶梗為柱形細(xì)胞，向上漸變小，分生孢子呈綠色，直徑為2～3μm，表面光滑，鏈狀排列。
綜上所述，根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合YMS-110的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將YMS-110初步定為Penicilliumbrevicompactum系的一個(gè)變種即P.brevicompactum var.
所述的短密青霉菌變種YMS-110可應(yīng)用于發(fā)酵制備霉酚酸。具體的，是用短密青霉菌變種YMS-110以10～20％接種量，在含有水溶性較強(qiáng)的氮源和碳源培養(yǎng)基中，在25～29℃下、130～200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5～6天，得到所述的霉酚酸。
所述的培養(yǎng)基中有效成分含量如下葡萄糖10％； KH2PO40.3％；MgSO40.2％；甘氨酸 0.7％；L-蛋氨酸 0.025％； FeSO4·7H2O 0.0022％；CuSO4·5H2O0.003％； ZnSO4·5H2O 0.024％；MnSO4·5H2O0.0012％。
本發(fā)明所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110及其應(yīng)用的有益效果體現(xiàn)在所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110是目前分離到的一種天然高單位的霉酚酸產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，極具開發(fā)、應(yīng)用前景。


本發(fā)明所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM 204096，保藏日期為2004年12月15日。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但不能將方案中所涉及的方法及技術(shù)參數(shù)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1短密青霉菌變種YMS-110的菌落特征1.材料和方法1.1菌種YMS-1101.2培養(yǎng)基1.2.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)土豆丁200g，用1000ml水煮沸30分鐘，紗布過濾待用。
土豆汁20％
葡萄糖 2％瓊脂 2％pH 自然121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘1.2.2麥芽汁瓊脂將發(fā)酵啤酒的原料(未加酒花)，稀釋至12柏林，加瓊脂15克，溶化后分裝，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。
1.2.3酵母麥芽汁瓊脂酵母膏 3.0g葡萄糖 10.0g麥芽汁 3.0g蒸餾水 1000g蛋白胨 5.0g瓊脂 20.0g121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘1.2.4察氏瓊脂蔗糖 30gNaNO333gMgSO4·7H2O0.5gKCl 0.5gFeSO4·5H2O0.01gK2HPO41g瓊脂 15g蒸餾水1000ml
121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘1.3方法將菌株按下列方法分別置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、麥芽汁瓊脂、酵母麥芽汁瓊脂、察氏瓊脂上培養(yǎng)，觀察該種菌株的特性①載片培養(yǎng)菌株接種在載片中央的小塊培養(yǎng)基上，加上蓋玻片，28℃培養(yǎng)15天觀察結(jié)果。
②插片培養(yǎng)將蓋玻片插入已接種的培養(yǎng)基里，28℃培養(yǎng)20天觀察結(jié)果。
③培養(yǎng)物觀察肉眼或借助放大鏡及低倍鏡觀察菌落特征，用高倍鏡及電子顯微鏡觀察個(gè)體形態(tài)特征。
1.4結(jié)果描述1.4.1菌落特征YMS-110在PDA上菌絲生長良好，菌落呈灰綠色絮狀，菌落表面有少量放射性褶皺，邊緣匍匐狀，背面黃褐色，7天菌落直徑為7mm。分生孢子梗多輪，分枝似帚，帚狀枝分枝多，短而緊密。瓶梗為柱形細(xì)胞，向上漸變小。分生孢子呈綠色，直徑為2～3μm，表面光滑，鏈狀排列。
1.4.2 YMS-110在其他培養(yǎng)基上的菌落特征(見表1)表1YMS-110在其他培養(yǎng)基上的菌落特征
1.5結(jié)論根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合YMS-110的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將YMS-110初步定為Penicillium brevicompactum系的一個(gè)變種即P.brevicompactum var.
實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)制備霉酚酸2.1種子庫菌種培養(yǎng)及保存培養(yǎng)基土豆葡萄糖瓊脂(PDA)土豆丁200g，用1000ml水煮沸30分鐘，紗布過濾待用。
土豆汁20％葡萄糖2％瓊脂 2％pH 自然培養(yǎng)溫度27℃～28℃培養(yǎng)時(shí)間10天保存方法培養(yǎng)10天的斜面孢子加入30％甘油，洗下孢子，將孢子懸液分裝在10ml試管中，-70℃保存。
2.2搖瓶種子培養(yǎng)
2.2.1培養(yǎng)基葡萄糖 1％酵母浸出粉 0.1％麥芽浸出粉 0.1％蛋白胨 0.2％pH 6.5培養(yǎng)溫度27℃～28℃培養(yǎng)時(shí)間2天裝量500ml三角瓶裝上述培養(yǎng)基100ml接種量2％搖床轉(zhuǎn)速220～240rpm2.2.2種子質(zhì)量指標(biāo)菌濃15～20％鏡檢無雜菌，染色較深且均勻，菌絲粗壯，有結(jié)球現(xiàn)象。
2.3種子罐種子培養(yǎng)基2.3.1培養(yǎng)基葡萄糖 1％酵母浸出粉 0.1％麥芽浸出粉 0.1％蛋白胨 0.2％pH 6.5裝量150L種子罐內(nèi)裝培養(yǎng)基50L培養(yǎng)溫度28±0.5℃培養(yǎng)時(shí)間48～76小時(shí)空氣流量1∶0.5(v/v/m)接種量2％轉(zhuǎn)速150rpm2.3.2移種指標(biāo)菌濃15～20％(3000rpm)，鏡檢菌絲粗壯，染色較深，有結(jié)球現(xiàn)象。
2.4發(fā)酵培養(yǎng)2.4.1發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖 10％KH2PO40.3％MgSO40.2％甘氨酸 0.7％L-蛋氨酸0.025％FeSO4·7H2O 0.0022％CuSO4·5H2O 0.003％ZnSO4·5H2O 0.024％MnSO4·5H2O 0.0012％2.4.2發(fā)酵條件及參數(shù)指標(biāo)裝量1000L發(fā)酵罐內(nèi)裝培養(yǎng)基500L接種量10～20％空氣流量1∶1(v/v/m)培養(yǎng)溫度28±0.5℃培養(yǎng)時(shí)間5～6天轉(zhuǎn)速150rpm
放罐指標(biāo)pH上升，氨基氮上升，鏡檢菌絲有自溶現(xiàn)象。
發(fā)酵單位參數(shù)2.55噸發(fā)酵罐試驗(yàn)參照上述發(fā)酵條件和工藝，在5噸發(fā)酵罐、10噸發(fā)酵罐、20噸發(fā)酵罐進(jìn)行多批發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵單位平均為1000μg/ml，提取總收率為35％左右，各批生產(chǎn)制得霉酚酸樣品均符合華東醫(yī)藥企業(yè)內(nèi)部霉酚酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(見附件)。
2.6發(fā)酵液中霉酚酸的檢測2.6.1色譜條件高效液相色譜(中國藥典2000年版二部附錄VD)測定；色譜柱Diamonsil(鉆石)C8 5μm 250(or150)×4.6mm流動(dòng)相乙腈∶磷酸緩沖液(1∶1)檢測波長249nm流速1.0ml/min進(jìn)樣量20μl磷酸緩沖液配制將1gNaH2PO4溶于1L雙蒸水中，用濃H3PO4調(diào)pH至3.0。
以霉酚酸峰值計(jì)算理論塔板數(shù)應(yīng)不低于3000。
2.6.2檢測方法取10ml發(fā)酵液于250ml三角瓶中，再加入40ml乙醇，220rpm振蕩30min。離心后，取上清，然后用移液槍取1ml濾液于1ml離心管中，以12000r/min離心10分鐘，取上清作為供試液；另取霉酚酸對(duì)照品適量配置成濃度為500μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取供試液和標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜柱，量取峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算即得發(fā)酵液霉酚酸的量。
2.7結(jié)論發(fā)酵過程是霉酚酸生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，其發(fā)酵水平與工藝優(yōu)劣直接相關(guān)，經(jīng)過搖瓶和發(fā)酵罐(5噸)發(fā)酵工藝的研究，基本確定了發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件。我們又在10噸、20噸發(fā)酵罐中進(jìn)行放大試驗(yàn)，其產(chǎn)抗能力基本穩(wěn)定。從而進(jìn)一步確定和驗(yàn)證了發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及條件。由于種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基均選擇水溶性較強(qiáng)的氮源和碳源，故對(duì)霉酚酸的提取分離幫助很大。
附件霉酚酸企業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)霉酚酸Mycophenolic Acid C17H20O6320.341本品為(E)-6-(1，3-二氫-4-羥基-7-甲基-3-氧-5-異苯并呋喃)-4-乙烯酸。按干燥品計(jì)算，含C17H20O6不得少于95.0％。
性狀本品為白色、類白色粉末，幾乎不溶于冷水，易溶于乙酸乙酯、乙醇，中等程度溶于乙醚、氯仿，難溶于苯、甲苯。
熔點(diǎn)本品的熔點(diǎn)為140-143℃鑒別在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與霉酚酸對(duì)照品峰的保留時(shí)間一致。
檢查干燥失重取本品，105℃烘干至恒重，減失重量不得超過1.0％。
熾灼殘?jiān)”酒?.0g，依法檢查(中國藥典2000年版附錄VIII N)，殘留不超過0.1％。
有關(guān)物質(zhì) 取本品適量，加流動(dòng)相溶解制成每1ml含1mg的供試品。另取本品適量，加含量測定項(xiàng)下的流動(dòng)相制成每1ml含20μg的溶液，制成對(duì)照溶液。照含量測定項(xiàng)下的方法試驗(yàn)，取對(duì)照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度，使主成分色譜峰高為記錄儀滿量程的10％至15％。再取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，供試品溶液如顯示雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照品溶液的主峰面積。
含量測定照高效液相色譜法(國藥典2000年版附錄V D)測定。
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用辛基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-磷酸緩沖液(1∶1)為流動(dòng)相；檢測波長為249nm。理論塔板數(shù)按霉酚酸峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000。
測定法取本品約25mg，精密稱定，置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取霉酚酸對(duì)照品適量，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。
貯藏遮光，密封保存。
權(quán)利要求
1.一種短密青霉菌廣西變種YMS-110，分類命名為Penicilliumbrevicompactum var.YMS-110，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM 204096，保藏日期為2004年12月15日。
2.如權(quán)利要求1所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110，其特征在于所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110在PDA上菌絲生長良好，菌落呈灰綠色絮狀，菌落表面有少量放射性褶皺，邊緣匍匐狀，背面黃褐色，分生孢子梗多輪，分枝似帚，帚狀枝分枝多，短而緊密，瓶梗為柱形細(xì)胞，向上漸變小，分生孢子呈綠色，直徑為2～3μm，表面光滑，鏈狀排列。
3.短密青霉菌廣西變種YMS-110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是用短密青霉菌廣西變種YMS-110以10～20％接種量，在含有水溶性較強(qiáng)的氮源和碳源培養(yǎng)基中，在25～29℃下、130～200rpm轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)5～6天，得到所述的霉酚酸。
5.如權(quán)利要求3所述的短密青霉菌廣西變種YMS-110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應(yīng)用，其特征在于所述的培養(yǎng)基中有效成分含量如下葡萄糖 10％KH2PO40.3％MgSO40.2％甘氨酸 0.7％L-蛋氨酸 0.025％FeSO4·7H2O 0.0022％CuSO45H2O 0.003％ZnSO45H2O 0.024％MnSO45H2O 0.0012％
全文摘要
本發(fā)明涉及一種短密青霉菌廣西變種YMS－110，在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCC NOM 204096，保藏日期為2004年12月15日。分類命名Penicillium brevicompactum var.YMS－110。根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)及國外相關(guān)資料的描述，結(jié)合YMS－110的各種培養(yǎng)特征和形態(tài)特征，將YMS－110初步定為Penicilliumbrevicompactum系的一個(gè)變種即P.brevicompactumvar.本發(fā)明還提供了短密青霉菌廣西變種YMS－110在發(fā)酵制備霉酚酸中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的短密青霉菌廣西變種YMS－110是目前分離到的一種天然高單位的霉酚酸產(chǎn)生菌，發(fā)酵性能優(yōu)良，極具開發(fā)、應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P17/02GK1796538SQ20041009910
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月28日
發(fā)明者朱健, 高興蓉, 陳曉霞, 朱亮 申請人:杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)生物工程研究所有限公司