專利名稱：一種薯蕷皂苷青霉菌及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能將薯蕷皂苷分解成薯蕷皂素的菌株，更具體涉及薯蕷皂苷青霉菌(Penicillum dioscin 051016.CCTCCNoM206001)，本發(fā)明還涉及該薯蕷皂苷青霉菌的制備方法。薯蕷皂苷青霉菌用于將含薯蕷皂苷的原料經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生薯蕷皂素。
背景技術(shù)：
薯蕷皂素是從薯蕷屬植物中提取的，黃姜屬薯蕷屬，是提取薯蕷皂素的主要資源。用薯蕷皂素為原料的合成藥有200多種，其中有60％以上的甾體激素以薯蕷皂素為原料。
從薯蕷原料中提取薯蕷皂素的傳統(tǒng)方法是采用酸解法。用酸解法的提取工藝會(huì)產(chǎn)生大量的酸性有機(jī)廢水，污染產(chǎn)區(qū)環(huán)境和河流，進(jìn)行污水處理將使生產(chǎn)成本大幅增加。因此，人們一直試圖用其它方法來替代酸解法，以避免對(duì)環(huán)境的污染，并且取得了一定的進(jìn)展。
現(xiàn)有從薯蕷原料中提取薯蕷皂素的方法有a、直接酸水解；b、預(yù)發(fā)酵后再進(jìn)行酸水解；c、分離后再進(jìn)行酸水解；d、酶解后再進(jìn)行酸水解；e、微生物發(fā)酵后再進(jìn)行酸水解等。
a、直接酸水解是傳統(tǒng)提取薯蕷皂素的方法該方法先用硫酸或鹽酸將薯蕷原料進(jìn)行酸水解，水解物用堿性物質(zhì)中和至中性，再用水洗滌，干燥后，再用溶劑提取薯蕷皂素，由于皂素在植物體內(nèi)主要以薯蕷皂苷的形式與纖維素結(jié)合存在于細(xì)胞壁中，又因?yàn)橹参锛?xì)胞壁比較堅(jiān)韌，因此直接酸水解法提取薯蕷皂素的提取率較低。
b、預(yù)發(fā)酵后再進(jìn)行酸水解提取薯蕷皂素的方法為先將薯蕷原料在酸水解前自然發(fā)酵，使材料中的淀粉分解，植物體疏松后再進(jìn)行酸水解，然后提取薯蕷皂素，可使薯蕷皂素的收率高于直接酸水解法。現(xiàn)在我國多數(shù)廠家都采用這種工藝生產(chǎn)薯蕷皂素。但由于自然發(fā)酵過程中多種微生物參與發(fā)酵，發(fā)酵條件難以控制，雜質(zhì)增多使薯蕷皂素質(zhì)量下降。為了提高薯蕷皂素的產(chǎn)率，除了預(yù)發(fā)酵法以外，加入纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、苦杏仁酶以及葡萄糖苷酶等酶液先進(jìn)行酶解，使薯蕷皂苷暴露出來，在酸水解時(shí)可提高薯蕷皂素的產(chǎn)率。
c、分離后再進(jìn)行酸水解提取薯蕷皂素的方法為將薯蕷原料加水磨碎過篩，先分離出纖維渣，過濾液經(jīng)過沉淀排水后，上清液濃縮后用乙醇提取，乙醚沉淀得到水溶性皂苷，把分離得到的皂苷淀粉漿加入淀粉酶進(jìn)行酶解，酶解后的糖渣再進(jìn)行酸水解。
d、酶解后再進(jìn)行酸水解提取薯蕷皂素的方法是華中工學(xué)院趙書申等人發(fā)明的，該方法采用純種黑曲霉菌，用未經(jīng)自然發(fā)酵的生產(chǎn)原料，經(jīng)蒸煮破壞了自身存在的各種酶以后，直接用黑曲霉菌接種發(fā)酵，再經(jīng)硫酸水解，提取薯蕷皂素，其產(chǎn)率較前面的提取方法提高許多。
e、微生物發(fā)酵后再進(jìn)行酸水解的方法是西北植物研究所和陜兩省衛(wèi)東醫(yī)藥化工廠發(fā)明的，該方法將工藝路線分為三部分第一步先分離出纖維素，第二步接種菌種降解淀粉生成酵母粉，并得到糖渣，第三步將得到的糖渣進(jìn)行酸水解，再提取皂素。該方法也比傳統(tǒng)工藝的提取率要高，并且減少了廢水的排放量。
綜上所述，雖然所有的工藝改進(jìn)都比傳統(tǒng)直接采用酸解法提高了薯蕷皂素的提取率，且減少了酸水污染物的排放量。但上述的所有工藝，無一例外地仍然需經(jīng)過酸水解的步驟。因此，不可避免地會(huì)產(chǎn)生酸性有機(jī)廢水污染物，且總量很大，而污水處理的成本很高，導(dǎo)致許多酸性有機(jī)廢水污染物對(duì)產(chǎn)區(qū)的環(huán)境和河流造成了嚴(yán)重的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種薯蕷皂苷青霉菌，該菌可在常溫與含薯蕷皂苷的植物原料發(fā)酵，直接將薯蕷皂苷酶解成薯蕷皂素，薯蕷皂素得率達(dá)90％以上，不產(chǎn)生酸性有機(jī)廢水污染物。本發(fā)明另一的目的是提供薯蕷皂苷青霉菌的制備方法，該方法是將薯蕷皂苷水解物純化至目的菌可能生長，而其它菌難以生長的環(huán)境，自然誘導(dǎo)薯蕷皂苷青霉菌的產(chǎn)生，再經(jīng)檢測和純化得到薯蕷皂苷青霉菌。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種薯蕷皂苷青霉菌051016，(Penicillum dioscin 051016)CCTCC NoM206001。
該薯蕷皂苷青霉菌的制備方法包含下列步驟(一)菌株的誘導(dǎo)、初篩方法按下列步驟進(jìn)行a1、將含加入薯蕷皂苷原料洗凈、晾干，其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成漿；a2、加溫至60℃，保溫2小時(shí)，過濾，取提取液；a3、將濾渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加溫至60℃，保溫2小時(shí)，過濾，取提取液；a4、重復(fù)步驟3；a5、合并三次提取液，于70℃減壓回收溶劑后得到提取物，加入原料量20倍的蒸餾水溶解提取物，再加入薯蕷皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重復(fù)萃取兩次，合并三次正丁醇萃取液，70℃減壓回收正丁醇至粉末狀，即為薯蕷皂苷；a6、將薯蕷皂苷用2Mol/L鹽酸95℃回流水解6小時(shí)，減壓蒸去酸水至干，用1Mol/L的NaOH溶液調(diào)整PH值在4-7，85℃干燥成薯蕷皂苷水解物；a7、加入薯蕷皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，殘?jiān)c蒸餾水按重量1∶2的比例攪勻后作為培養(yǎng)基，置于20℃～28℃、相對(duì)濕度65％～80％的環(huán)境下，放置8～12天；a8、取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落作進(jìn)一步地篩選；(二)按下列步驟，用高效液相檢測色譜儀檢測每種菌落與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵后得到薯蕷皂素的含量，并根據(jù)薯蕷皂素含量的高低取舍菌落b1、將2～4克的含薯蕷皂苷原料洗凈，加入其重量5-10倍的自來水，磨碎成漿，100℃蒸煮30分鐘，冷至室溫；b2、取5mm2的菌落拌入含薯蕷皂苷原料的漿中，30℃發(fā)酵20～30小時(shí)，5000rmp離心10分鐘，棄上清液，取沉降物；b3、將沉降物在60℃干燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合并提取液；
b4、60℃回收石油醚至干，得到薯蕷皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作為待測樣品；b5、用高效液相檢測色譜儀檢測薯蕷皂素，條件為安捷倫1100型儀器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色譜柱，柱溫25℃，流動(dòng)相為3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，檢測波長206nm；薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品溶于3∶2的甲醇/乙腈中，制備成1mg/ml的溶液，進(jìn)樣量2μl，分析過程15分鐘；另取待測樣品同法進(jìn)行高效液相色譜分析；b6、比較待測樣品中各種菌落所得產(chǎn)物的檢測結(jié)果，選取與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵后得到薯蕷皂素含量最高的菌落；(三)菌株的純化按下列步驟進(jìn)行c1、培養(yǎng)基由下列成分按重量的百分比組成蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO40.1、Fe2(SO4)30.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蕷皂苷水解物2、瓊脂1.5、余者為水；c2、將培養(yǎng)基加熱至100℃，保溫30分鐘，制成平板，冷卻至20℃～30℃；c3、將步驟(二)得到的菌落用涂布法接種于培養(yǎng)基制成的平板上，25℃～30℃培養(yǎng)3-4天；c4、取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落；c5、再按步驟(二)得到菌落，從該菌落中取到的菌株即為本發(fā)明所述的薯蕷皂苷青霉菌。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、與傳統(tǒng)采樣方法相比，本發(fā)明根據(jù)化學(xué)環(huán)境限制法或曰底物純化法的思路，將底物純化至目的菌可能生長的環(huán)境，除去了可能滋生其它菌類的底物，從而限制了其它菌類生長的條件，因此，本發(fā)明可簡便、快速地完成目的菌株的誘導(dǎo)篩選；2、本發(fā)明所得薯蕷皂苷青霉菌具有高度的專一性，即底物即便是兩種或兩種以上的薯蕷皂苷，所得產(chǎn)物均為薯蕷皂素；3、本發(fā)明所得薯蕷皂苷青霉菌具有很高的活性，使得用其發(fā)酵后的薯蕷皂素得率達(dá)90％以上；4、本發(fā)明所得薯蕷皂苷青霉菌可在常溫與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵，取代酸水解，可降低能耗、減少環(huán)境污染。


圖1為薯蕷原料經(jīng)薯蕷皂苷青霉菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物與酸水解后得到的產(chǎn)物的高效液相色譜分析結(jié)果的比較圖。
圖2為薯蕷原料經(jīng)自然發(fā)酵得到的產(chǎn)物，經(jīng)高效液相色譜分析之結(jié)果圖。
具體實(shí)施方案以下對(duì)薯蕷皂苷青霉菌及其制備方法作進(jìn)一步的說明。
薯蕷皂苷青霉菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCCNoM206001。
薯蕷皂苷青霉菌的制備方法包含下列步驟(一)菌株的誘導(dǎo)、初篩方法按下列步驟進(jìn)行a1、將含薯蕷皂苷原料洗凈、晾干，加入其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成漿；
a2、加溫至60℃，保溫2小時(shí)，過濾，取提取液；a3、將濾渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加溫至60℃，保溫2小時(shí)，過濾，取提取液；a4、重復(fù)步驟3；a5、合并三次提取液，于70℃減壓回收溶劑后得到提取物，加入原料量20倍的蒸餾水溶解提取物，再加入薯蕷皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重復(fù)萃取兩次，合并三次正丁醇萃取液，70℃減壓回收正丁醇至粉末狀，即為薯蕷皂苷；a6、將薯蕷皂苷用2Mol/L鹽酸95℃回流水解6小時(shí)，減壓蒸去酸水至干，用1Mol/L的NaOH溶液調(diào)整PH值在4-7，85℃干燥成薯蕷皂苷水解物；a7、加入薯蕷皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，殘?jiān)c蒸餾水按重量1∶2的比例攪勻后作為培養(yǎng)基，置于20℃～28℃、相對(duì)濕度65％～80％的環(huán)境下，放置8～12天；a8、取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落作進(jìn)一步地篩選；(二)按下列步驟，用高效液相檢測色譜儀檢測每種菌落與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵后得到薯蕷皂素的含量，并根據(jù)薯蕷皂素含量的高低取舍菌落b1、將2～4克的含薯蕷皂苷原料洗凈，加入其重量5-10倍的自來水，磨碎成漿，100℃蒸煮30分鐘，冷至室溫；b2、取5mm2的菌落拌入含薯蕷皂苷原料的漿中，30℃發(fā)酵20～30小時(shí)，5000rmp離心10分鐘，棄上清液，取沉降物；
b3、將沉降物在60℃干燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合并提取液；b4、60℃回收石油醚至干，得到薯蕷皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作為待測樣品；b5、用高效液相檢測色譜儀檢測薯蕷皂素，條件為安捷倫1100型儀器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色譜柱，柱溫25℃，流動(dòng)相為3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，檢測波長206nm；薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品溶于3∶2的甲醇/乙腈中，制備成1mg/ml的溶液，進(jìn)樣量2μl，分析過程15分鐘；另取待測樣品同法進(jìn)行高效液相色譜分析；b6、比較待測樣品中各種菌落所得產(chǎn)物的檢測結(jié)果，選取與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵后得到薯蕷皂素含量最高的菌落；(三)菌株的純化按下列步驟進(jìn)行c1、培養(yǎng)基由下列成分按重量的百分比組成蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO40.1、Fe2(SO4)30.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蕷皂苷水解物2、瓊脂1.5、余者為水；c2、將培養(yǎng)基加熱至100℃，保溫30分鐘，制成平板，冷卻至20℃～30℃；c3、將步驟(二)得到的菌落用涂布法接種于培養(yǎng)基制成的平板上，25℃～30℃培養(yǎng)3-4天；c4、取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落；c5、再按步驟(二)得到菌落，從該菌落中取到的菌株即為本發(fā)明所述的薯蕷皂苷青霉菌。
圖1為薯蕷原料經(jīng)薯蕷皂苷青霉菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物與酸水解后得到的產(chǎn)物的高效液相色譜分析結(jié)果的比較圖。
其橫坐標(biāo)為保留時(shí)間，縱坐標(biāo)為吸收強(qiáng)度。經(jīng)高效液相色譜分析保留時(shí)間在11分鐘左右為薯蕷皂素，上圖0017.D為經(jīng)薯蕷皂苷青霉菌發(fā)酵得到的產(chǎn)物，其保留時(shí)間為11.1分鐘，下圖0016.D為經(jīng)酸水解得到的產(chǎn)物，其保留時(shí)間為11.08分鐘，兩者的誤差為0.02分鐘，因此，兩者可視為同一種產(chǎn)物。
用薄層色譜(TLC)分析及熔點(diǎn)測定均表明所得到的產(chǎn)物與皂素對(duì)照品一致。
圖2為薯蕷原料經(jīng)自然發(fā)酵得到的產(chǎn)物，經(jīng)高效液相色譜分析之結(jié)果圖。
該結(jié)果說明，薯蕷原料經(jīng)自然發(fā)酵得到的產(chǎn)物不一定相同，其薯蕷皂素的產(chǎn)率甚微。
實(shí)施列用薯蕷皂苷青霉菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCCNoM206001制備薯蕷皂素的方法按下列步驟進(jìn)行。
1、取薯蕷原料100公斤，清洗至無泥沙和其它雜質(zhì)，經(jīng)高效液相色譜分析，該薯蕷原料含薯蕷皂素2.3％；2、加入500公斤的水，將薯蕷原料破碎至5毫米以下；3、將已破碎的物料裝入發(fā)酵罐中，加入500克的氨水，拌勻，26℃密閉放置1小時(shí)；4、25℃接入100克的薯蕷皂苷青霉菌Penicillum dioscin051016，CCTCC NoM206001，攪拌均勻，在PH4～7條件下，26℃發(fā)酵30小時(shí)；5、過濾，將濾渣在65℃干燥，再加入300升80℃沸程的石油醚；7、60℃回流提取2～3次，合并提取液；8、60℃回收石油醚至薯蕷皂素結(jié)晶析出；9、過濾，取薯蕷皂素結(jié)晶；10、用薯蕷皂素結(jié)晶兩倍重量的80℃沸程的石油醚60℃溶解，再緩慢加入乙醇至溶液渾濁，放置過夜，重結(jié)晶；11、濾取結(jié)晶，60℃干燥4小時(shí)，稱重得2.08公斤薯蕷皂素，經(jīng)高效液相色譜分析薯蕷皂素含量98.07％。
權(quán)利要求
1.一種薯蕷皂苷青霉菌，其特征在于，薯蕷皂苷青霉菌051016(Penicillum dioscin 051016)CCTCC NoM206001。
2.制備權(quán)利要求1所述的一種薯蕷皂苷青霉菌的方法，其特征在于，該方法包含下列步驟(一)菌株的誘導(dǎo)、初篩方法按下列步驟進(jìn)行a1、將含薯蕷皂苷原料洗凈、晾干，加入其重量4倍的甲醇或乙醇，磨碎成漿；a2、加溫至60℃，保溫2小時(shí)，過濾，取提取液；a3、將濾渣再加入其重量2倍的甲醇或乙醇，加溫至60℃，保溫2小時(shí)，過濾，取提取液；a4、重復(fù)步驟3；a5、合并三次提取液，于70℃減壓回收溶劑后得到提取物，加入原料量20倍的蒸餾水溶解提取物，再加入薯蕷皂苷原料重量10倍的正丁醇萃取，再重復(fù)萃取兩次，合并三次正丁醇萃取液，70℃減壓回收正丁醇至粉末狀，即為薯蕷皂苷；a6、將薯蕷皂苷用2Mol/L鹽酸95℃回流水解6小時(shí)，減壓蒸去酸水至干，用1Mol/L的NaOH溶液調(diào)整PH值在4-7，85℃干燥成薯蕷皂苷水解物；a7、加入薯蕷皂苷水解物重量5倍的60℃-90℃沸程的石油醚，60℃回流提取3次，殘?jiān)c蒸餾水按重量1∶2的比例攪勻后作為培養(yǎng)基，置于20℃～28℃、相對(duì)濕度65％～80％的環(huán)境下，放置8～12天；a8、取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落作進(jìn)一步地篩選；(二)按下列步驟，用高效液相檢測色譜儀檢測每種菌落與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵后得到薯蕷皂素的含量，并根據(jù)薯蕷皂素含量的高低取舍菌落b1、將2～4克的含薯蕷皂苷原料洗凈，加入其重量5-10倍的自來水，磨碎成漿，100℃蒸煮30分鐘，冷至室溫；b2、取5mm2的菌落拌入含薯蕷皂苷原料的漿中，30℃發(fā)酵20～30小時(shí)，5000rmp離心10分鐘，棄上清液，取沉降物；b3、將沉降物在60℃干燥，加入其重量5倍的60℃-90℃沸程石油醚，60℃回流提取3次，合并提取液；b4、60℃回收石油醚至干，得到薯蕷皂素粗品，再用3∶2比例的甲醇和乙腈溶解定容至1毫升，作為待測樣品；b5、用高效液相檢測色譜儀檢測薯蕷皂素，條件為安捷倫1100型儀器，Zorbax SB-C18，5μ，4.6×250mm色譜柱，柱溫25℃，流動(dòng)相為3∶2的甲醇/乙腈，0.8ml/min，檢測波長206nm；薯蕷皂素標(biāo)準(zhǔn)品溶于3∶2的甲醇/乙腈中，制備成1mg/ml的溶液，進(jìn)樣量2μl，分析過程15分鐘；另取待測樣品同法進(jìn)行高效液相色譜分析；b6、比較待測樣品中各種菌落所得產(chǎn)物的檢測結(jié)果，選取與含薯蕷皂苷原料發(fā)酵后得到薯蕷皂素含量最高的菌落；(三)菌株的純化按下列步驟進(jìn)行c1、培養(yǎng)基由下列成分按重量的百分比組成蔗糖3、KCl 0.5、K2HPO40.1、Fe2(SO4)30.001、MgSO4.7H2O 0.5、薯蕷皂苷水解物2、瓊脂1.5、余者為水；c2、將培養(yǎng)基加熱至100℃，保溫30分鐘，制成平板，冷卻至20℃～30℃；c3、將步驟(二)得到的菌落用涂布法接種于培養(yǎng)基制成的平板上，25℃～30℃培養(yǎng)3-4天；c4、取培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落；c5、再按步驟(二)得到菌落，從該菌落中取到的菌株即為本發(fā)明所述的薯蕷皂苷青霉菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種薯蕷皂苷青霉菌，薯蕷皂苷青霉菌Penicillumdioscin 051016.CCTCCNoM206001，涉及能將薯蕷皂苷分解成薯蕷皂苷元的菌株。該菌可在常溫與含薯蕷皂苷的植物原料發(fā)酵，直接將薯蕷皂苷酶解成薯蕷皂素，薯蕷皂素提取率達(dá)90％以上，不產(chǎn)生酸性有機(jī)廢水污染物。本發(fā)明還公開了該菌的制備方法，該方法將薯蕷皂苷水解物純化至目的菌能生長，而其它菌難以生長的環(huán)境，自然誘導(dǎo)薯蕷皂苷青霉菌的產(chǎn)生，是一種快速、簡便、準(zhǔn)確的分離、篩選能酶解薯蕷皂苷為薯蕷皂素的專一性很強(qiáng)的高活性菌株的方法。
文檔編號(hào)C12R1/80GK1920001SQ20061012451
公開日2007年2月28日 申請(qǐng)日期2006年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月14日
發(fā)明者盧大炎, 張麗紅, 葉晚成 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院武漢植物園