專(zhuān)利名稱(chēng)：來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶a的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2及對(duì)其進(jìn)行編碼的DNA，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
絲狀菌中特別是含有米曲霉(キコウジ菌)等的曲霉菌，在日本的釀造業(yè)如制造清酒、黃醬、醬油以及甜料酒等方面的利用由來(lái)已久，是能夠直接食用的菌類(lèi)，美國(guó)FDA(食品藥品局)在GRAS(Generally Recognized as Safe)上將其列為安全的基因源。
因此，在把來(lái)自于一般菌類(lèi)的基因作為食品等利用時(shí)所進(jìn)行的必要的慢性毒性檢查等安全審查中，來(lái)自于一般菌類(lèi)的基因大約要花費(fèi)10億日元，與此相比，對(duì)于上述GRAS等級(jí)的基因的審查，只需花費(fèi)上述經(jīng)費(fèi)的約三分之一左右即可，而且，具有該審查所需要的時(shí)間更短的優(yōu)點(diǎn)。
這樣，從安全性和經(jīng)濟(jì)性的角度來(lái)看，可以說(shuō)絲狀菌特別是曲霉菌是利用價(jià)值非常高的基因?qū)殠?kù)。
因此，通過(guò)明確這些菌類(lèi)的基因組DNA信息以及被編碼的基因等的功能，不但能夠給如利用生物技術(shù)生產(chǎn)物質(zhì)等的食品工業(yè)提供有效利用安全的基因資源的方法，而且能夠?yàn)檗r(nóng)藥及醫(yī)藥領(lǐng)域的各種基因的篩選提供有用的信息。
進(jìn)一步，能夠成為解析親緣菌如黃曲霉(Aspergillus flavus)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)等谷物的污染菌以及人體的感染菌的基因組信息的有用工具。
在上述背景下進(jìn)行研究的結(jié)果，本發(fā)明者們成功地解析了曲霉菌中的一種米曲霉的基因組，確定了它的堿基序列(以及其編碼的氨基酸序列)和各種功能等?；谒龅难芯砍晒?，在先申請(qǐng)(特愿2001-403261)中公開(kāi)了來(lái)自于米曲霉的各種DNA，以及含有從這些DNA中制作的核苷酸序列、用于GRAS等級(jí)的絲狀菌基因的擴(kuò)增的引物組合以及用于檢測(cè)出絲狀菌基因的探針等。
本發(fā)明者們以得到的曲霉菌基因組信息為基礎(chǔ)做了更進(jìn)一步的研究。即關(guān)注于磷脂酶A2，從得到的堿基序列中確定對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行編碼的序列，同時(shí)嘗試確定被該序列編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。此外，磷脂酶A2是對(duì)甘油磷脂的2位的酯鍵進(jìn)行加水分解、生成游離的脂肪酸和溶血磷脂的酶。人們從很早以前就知道來(lái)自動(dòng)物的磷脂酶A2，這樣的磷脂酶A2作為乳化劑已廣泛用于溶血卵磷脂的制造(如參照特開(kāi)平10-042884號(hào)公報(bào))、油脂的脫膠工藝(如參照Industrial Enzymology 2nded.，p299-300(1996))、制作面包(如參照特開(kāi)昭60-2135號(hào)公報(bào))、功能性磷脂(如參照オレオサイェンス第2卷第1號(hào)(2002))等食品工業(yè)中。此外，也可在抗炎藥、治療敗血癥藥、治療風(fēng)濕病藥、治療哮喘藥、治療缺血性疾病藥、治療缺血再灌注傷害藥等藥物開(kāi)發(fā)方面使用。但是，來(lái)自動(dòng)物的酶，由于其來(lái)自于動(dòng)物，所以近年來(lái)消費(fèi)者、食品制造公司都對(duì)它有敬而遠(yuǎn)之的傾向，人們期待著認(rèn)為是更加安全的從微生物提取的酶。近年來(lái)對(duì)來(lái)自于微生物的磷脂酶A2進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了一種屬于放線菌的紫紅鏈霉菌(Streptomyces violaceoruber)的酶(參照特開(kāi)平6-327468號(hào)公報(bào))。接著最近又報(bào)道了來(lái)自于一種絲狀菌Tuber borchii的酶(參照Soragni et al.，The EMBO Journal，20(18)5079-5090(2001))、來(lái)自于Helicosporium sp.絲狀菌的酶(參照Wakatsuki et al.，Biochim.Biophys.Acta 1522，74，(2001))。但是，沒(méi)有把這些微生物作為食品使用的經(jīng)驗(yàn)，因此期待著來(lái)自于安全性更高的菌種的酶。
因此，本發(fā)明的課題是提供來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2和對(duì)其進(jìn)行編碼的DNA，并提供來(lái)自于該曲霉菌的磷脂酶A2的生產(chǎn)方法等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明者們對(duì)上述課題進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果成功地在曲霉菌基因組內(nèi)發(fā)現(xiàn)了與上述報(bào)道的來(lái)自于微生物的磷脂酶A2基因有高度同源性的2種序列(以下分別稱(chēng)為“spaA基因”和“spaB基因”)。接著，以大腸菌和曲霉菌為宿主，表達(dá)該序列編碼的2種蛋白質(zhì)(以下分別稱(chēng)為“磷脂酶A2-spaA”和“磷脂酶A2-spaB”)時(shí)，確認(rèn)任何一種蛋白質(zhì)都具有磷脂酶A2的活性，根據(jù)此結(jié)果從實(shí)驗(yàn)上進(jìn)一步確認(rèn)該2種序列對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行了編碼。另一方面，成功確定了該2種序列中的編碼區(qū)域，發(fā)現(xiàn)該序列編碼的2種蛋白質(zhì)含有新發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列。這樣，本發(fā)明者們首次成功地確定了來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2的基因及其氨基酸序列。
本發(fā)明是根據(jù)以上的研究成果完成的，提出了下述構(gòu)成。
(1)含有下述(a)或(b)蛋白質(zhì)的磷脂酶A2(a)具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有改變了序列號(hào)1表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A2功能的蛋白質(zhì)。
(2)含有下述(c)或(d)蛋白質(zhì)的磷脂酶A2(c)具有序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(d)具有對(duì)序列號(hào)2表示的氨基酸序列的一部分實(shí)施改變的氨基酸序列、具有磷脂酶A2功能的蛋白質(zhì)。
(3)下述(A)或(B)DNA(A)對(duì)(1)所述的磷脂酶A2進(jìn)行編碼的DNA，(B)在嚴(yán)格條件下與(A)DNA雜交，其編碼的蛋白質(zhì)具有磷脂酶A2功能的DNA。
(4)下述(C)或(D)的DNA(C)對(duì)(2)所述的磷脂酶A2進(jìn)行編碼的DNA；(D)在嚴(yán)格條件下與(C)DNA雜交，其編碼的蛋白質(zhì)具有磷脂酶A2功能的DNA。
(5)具有下述(i)～(vi)中任一項(xiàng)序列的DNA(i)序列號(hào)3表示的堿基序列；(ii)序列號(hào)4表示的堿基序列；
(iii)序列號(hào)5表示的堿基序列；(iv)序列號(hào)6表示的堿基序列；(v)序列號(hào)7表示的堿基序列；(vi)序列號(hào)8表示的堿基序列。
(6)一種載體，其攜帶有權(quán)利要求3～5中任一項(xiàng)所述的DNA。
(7)一種絲狀菌，其從外部導(dǎo)入權(quán)利要求3～5中任一項(xiàng)所述的DNA。
(8)磷脂酶A2的生產(chǎn)方法，其包括下述步驟①和步驟②①在能夠產(chǎn)生上述DNA編碼的蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)(7)所述的絲狀菌的步驟；以及②回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的步驟。
本發(fā)明中的“DNA”不僅限于雙鏈DNA，而且還包括構(gòu)成雙鏈的單鏈DNA(有義鏈和反義鏈)。另外，本發(fā)明的DNA中還包括含有考慮到密碼子簡(jiǎn)并的任意堿基序列的DNA。進(jìn)一步，本發(fā)明中的“DNA”沒(méi)有形態(tài)限制，可以包括cDNA、基因組DNA、合成DNA。
本發(fā)明中的“對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA”指的是，在基因表達(dá)時(shí)能得到該蛋白質(zhì)的DNA，當(dāng)然包括具有與該蛋白質(zhì)的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的堿基序列的DNA，也包括在這樣的DNA中附加對(duì)氨基酸序列不編碼的序列所形成的DNA(如含有1個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子的DNA)。
本發(fā)明中“來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2”指的是，以曲霉菌為起始原料生產(chǎn)的磷脂酶A2，或在生產(chǎn)過(guò)程中利用曲霉菌持有的磷脂酶A2的信息(氨基酸序列或DNA序列)生產(chǎn)的磷脂酶A2。當(dāng)然可以是利用物理方法或生物化學(xué)方法從曲霉菌中生產(chǎn)的磷脂酶A2，還包括利用本發(fā)明所公開(kāi)的磷脂酶A2的氨基酸序列或DNA序列采用基因工程學(xué)的方法生產(chǎn)的磷脂酶A2。


圖1是表達(dá)載體-pNGspaA的構(gòu)成的模式示意圖。
圖2是表達(dá)載體-pNGspaB的構(gòu)成的模式示意圖。
圖3是顯示磷脂酶A2-spaA的轉(zhuǎn)化體以及磷脂酶A2-spaB的轉(zhuǎn)化體的磷脂酶活性(培養(yǎng)上清液中和破碎菌體溶液中)的圖示。
圖4是顯示由攜帶磷脂酶A2-spaA基因的轉(zhuǎn)化體精制得到的磷脂酶A2-spaA蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的電泳圖譜的圖像。
圖5是利用經(jīng)CM-纖維素柱精制了的磷脂酶A2-spaA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液來(lái)測(cè)定磷脂酶A2的活性的結(jié)果總結(jié)表。
具體實(shí)施例方式
(蛋白質(zhì))本發(fā)明的第一方面涉及來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2。本發(fā)明提供的磷脂酶A2是例如含有具有序列號(hào)1或序列號(hào)2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。如后述實(shí)施例所示，確認(rèn)該蛋白質(zhì)在使用絲狀菌的表達(dá)系統(tǒng)中確實(shí)具有磷脂酶A2的活性。
這里，在對(duì)某蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分實(shí)施改變時(shí)，一般情況下改變后的蛋白質(zhì)與改變前的蛋白質(zhì)具有相同的功能。即氨基酸序列的改變不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響，蛋白質(zhì)的功能在改變前后能夠得以維持。考慮到此因素，即使是含有對(duì)具有上述磷脂酶A2活性的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號(hào)1及2)的一部分進(jìn)行改變的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(以下稱(chēng)“改變的蛋白質(zhì)”)，只要有磷脂酶A2的功能就可以構(gòu)成本發(fā)明的磷脂酶A2(蛋白質(zhì))。換句話說(shuō)，只要能夠保持磷脂酶A2的功能，允許對(duì)一部分氨基酸實(shí)施改變。此外，優(yōu)選改變前后磷脂酶A2的活性不發(fā)生降低，但也可以有稍微的變動(dòng)(上升或降低)。
這里，“氨基酸序列的一部分被改變”指的是，氨基酸序列中有1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、置換、附加和/或插入的意思。只要能夠保持磷脂酶A2的活性，氨基酸序列的改變(變異)的位置沒(méi)有特別的限定，并且可以在多個(gè)位置發(fā)生改變。改變的氨基酸的數(shù)量，例如可以是相當(dāng)于全部氨基酸數(shù)量的10％或更少，優(yōu)選相當(dāng)于全部氨基酸數(shù)量的5％或更少，更優(yōu)選相當(dāng)于全部氨基酸數(shù)量的1％或更少。上述改變的蛋白質(zhì)，例如可以用下述方法制造，即制備核苷酸片斷，該核苷酸片斷含有對(duì)序列號(hào)1或2氨基酸序列進(jìn)行編碼的堿基序列施加改變的序列，在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)系中對(duì)此核苷酸片斷進(jìn)行表達(dá)等，利用基因工程學(xué)的方法制備上述改變的蛋白質(zhì)。
對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)(包括改變的蛋白質(zhì))中的含有天然曲霉菌的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)對(duì)該曲霉菌提取、精制等操作制備。此外，也可以根據(jù)本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)的磷脂酶A2的信息，采用基因工程學(xué)的方法生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白質(zhì)(包括改變的蛋白質(zhì))。例如，可以用本發(fā)明的對(duì)蛋白質(zhì)編碼的DNA使適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，然后通過(guò)回收轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)生產(chǎn)。對(duì)于回收到的蛋白質(zhì)根據(jù)相應(yīng)的目的實(shí)施適宜的精制。制備重組蛋白質(zhì)時(shí)能夠進(jìn)行各種修飾，例如，將對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA和其他適當(dāng)?shù)腄NA插入到同一載體內(nèi)，如果利用該載體可以進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，就可以得到在本發(fā)明的蛋白質(zhì)上連接別的肽甚至蛋白質(zhì)的重組蛋白質(zhì)。此外，也可以實(shí)施附加糖鏈和/或脂質(zhì)、或者實(shí)施諸如在N末端或C末端發(fā)生加工(プロセツシング)之類(lèi)的修飾。通過(guò)上述修飾，能夠使重組蛋白質(zhì)的提取、精制簡(jiǎn)便化，還能夠附加生物學(xué)功能等。
(對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行編碼的DNA)本發(fā)明的第2任務(wù)是提供對(duì)來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2進(jìn)行編碼的DNA。這樣的DNA的具體例子，可以是含有序列號(hào)3或4表示的堿基序列的DNA、或者含有序列號(hào)7表示的堿基序列的DNA。序列號(hào)3或4的序列是來(lái)自對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行編碼的基因組DNA(磷脂酶A2基因)序列，序列號(hào)7的序列是從序列號(hào)4所示序列中除去內(nèi)含子后的序列。本發(fā)明的DNA的其它具體例子可以是具有序列號(hào)5、6或8表示的堿基序列的DNA。序列號(hào)5的堿基序列是包括序列號(hào)3表示的磷脂酶A2基因及其推定的啟動(dòng)子和終止子區(qū)域的DNA。同樣，序列號(hào)6的堿基序列是包括序列號(hào)4表示的磷脂酶A2基因及其推定的啟動(dòng)子和終止子區(qū)域的DNA。此外，序列號(hào)8的堿基序列是包括序列號(hào)7表示的DNA(磷脂酶A2基因中除去內(nèi)含子區(qū)后的DNA)及其推定的啟動(dòng)子和終止子區(qū)域的DNA。在這些DNA中優(yōu)選啟動(dòng)子及終止子與結(jié)構(gòu)基因的組合，如果利用該DNA生產(chǎn)磷脂酶A2就可能出現(xiàn)良好的基因表達(dá)效果。因此，能夠構(gòu)建高效率的磷脂酶A2的生產(chǎn)體系。
上述本發(fā)明的DNA可以采用下述方法制備。即利用合適的絲狀菌基因組DNA基因文庫(kù)或cDNA基因文庫(kù)、或利用絲狀菌的菌體內(nèi)提取液，正確使用能夠與編碼本發(fā)明的磷脂酶A2基因(如具有序列號(hào)3或4表示的堿基序列的DNA)發(fā)生特異性雜交的探針、引物等，就可制備本發(fā)明的DNA。另外，關(guān)于制備本發(fā)明的DNA所使用的絲狀菌基因組DNA基因文庫(kù)或cDNA基因文庫(kù)的制作方法，可參照例如Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York進(jìn)行。
具體來(lái)說(shuō)，例如可以采用下述步驟制備本發(fā)明的DNA。首先，將預(yù)想具有目的DNA的絲狀菌培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過(guò)過(guò)濾集菌，洗凈后將菌體冷凍干燥；然后，使用研缽等粉碎菌體，加入適量的萃取用緩沖溶液(例如含有SDS的Tris-HCl緩沖液)作為萃取液；接著，通過(guò)苯酚萃取、乙醇沉淀等對(duì)基因組DNA進(jìn)行萃取、精制。把這樣得到的基因組DNA作為模板，采用PCR法就能夠得到目的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，該P(yáng)CR法使用了目的DNA序列的特異性引物。
在可能得到合適的絲狀菌基因組DNA基因文庫(kù)或cDNA基因文庫(kù)的情況下，利用這些基因文庫(kù)也可以制備本發(fā)明的DNA。根據(jù)使用的基因文庫(kù)的種類(lèi)可以采用嗜菌斑雜交法或菌落雜交法(參照Molecular Cloning，ThirdEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York等)。例如使用質(zhì)粒構(gòu)成的基因文庫(kù)時(shí)，可以采用菌落雜交法。在選擇具有目的DNA的克隆時(shí)，可以使用具有本發(fā)明DNA的特異性序列的探針。如果選擇了目的克隆，以具有該克隆的DNA為模板，采用PCR法等就能夠得到本發(fā)明的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，該P(yáng)CR法使用了目的DNA序列的特異性引物。
將得到的克隆DNA載入適當(dāng)?shù)妮d體中進(jìn)行亞克隆化，可供以后的使用。據(jù)此，例如能夠構(gòu)建轉(zhuǎn)化用的重組載體，或構(gòu)建適合解讀堿基序列的質(zhì)粒。
這里，對(duì)編碼某蛋白質(zhì)的DNA的一部分實(shí)施改變時(shí)，一般情況下改變后的DNA編碼的蛋白質(zhì)與改變前的DNA編碼的蛋白質(zhì)具有相同的功能。即DNA序列的改變不會(huì)對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響，所編碼的蛋白質(zhì)的功能在改變前后能夠得以持續(xù)。考慮到此因素，即使是含有對(duì)上述本發(fā)明的DNA的一部分做了改變的堿基序列的DNA(以下稱(chēng)“改變的DNA”)，只要其編碼的蛋白質(zhì)具有磷脂酶A2功能就可以構(gòu)成本發(fā)明的DNA。換句話說(shuō)，只要含有編碼的蛋白質(zhì)、能夠保持磷脂酶A2的功能，就允許對(duì)一部分序列實(shí)施改變。此外，優(yōu)選在改變前后編碼的蛋白質(zhì)的磷脂酶A2的活性不發(fā)生降低，但也可以有稍微的變動(dòng)(上升或降低)。
這里，“一部分的改變”指的是，典型情況是，改變前的堿基序列中有1個(gè)或多個(gè)堿基被置換、缺失、插入或附加。這種改變也可以在多個(gè)部位發(fā)生。這里所說(shuō)的“多個(gè)”，因改變發(fā)生的位置以及改變的種類(lèi)的不同而異，例如可以是2～100個(gè)，優(yōu)選2～50個(gè)，更優(yōu)選2～10個(gè)。上述的改變的DNA，例如可以通過(guò)限制酶處理、核苷酸外切酶以及DNA連接酶等來(lái)處理，通過(guò)用指定位置突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter 13，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)、隨機(jī)突變導(dǎo)入法(MolecularCloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)導(dǎo)入變異等來(lái)制備。此外，也能夠用紫外線處理含有磷脂酶A2基因的絲狀菌，然后分離出改變后的基因等公知的變異處理方法制備改變的DNA。
此外，在上述的堿基的置換、缺失、插入、附加或逆位等變異中，根據(jù)含有磷脂酶A2的微生物的個(gè)體差異、種屬差異等情況，也包括自然發(fā)生的變異。
改變的DNA的制備方法，例如可舉出，從帶有改變的DNA的天然曲霉菌(米曲霉)中提取基因組(染色體)DNA，用適當(dāng)?shù)南拗泼笇?duì)此處理，然后以本發(fā)明的DNA(如具有序列號(hào)3或4表示的序列的DNA)或其一部分作為探針進(jìn)行篩選，在嚴(yán)格條件下對(duì)雜交DNA進(jìn)行選擇、分離的方法。在含有具有改變的DNA的克隆的基因組(染色體)DNA基因文庫(kù)能夠利用的情況下，以本發(fā)明的DNA(如具有序列號(hào)3表示的序列的DNA)或其一部分作為探針，在嚴(yán)格條件下通過(guò)對(duì)該基因文庫(kù)進(jìn)行篩選也可以得到改變的DNA。
與上述本發(fā)明的DNA(如具有序列號(hào)3或4表示的序列的DNA或者在其上附加上述變化而得到的DNA)在嚴(yán)格條件下雜交，并且其編碼的蛋白質(zhì)具有磷脂酶A2功能的DNA也可視為本發(fā)明的DNA。這里所說(shuō)的“嚴(yán)格條件”，就是指能夠形成特異性雜交化物、而不能形成非特異性雜交化物的條件。嚴(yán)格條件根據(jù)序列的長(zhǎng)短、構(gòu)成堿基的種類(lèi)的不同而變動(dòng)，例如使用雜交溶液(50％甲醛、10×SSC(0.15M NaCl，15mM sodium citrate，PH7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的變性鮭精子DNA、50mM磷酸緩沖液(PH7.5))在42℃溫育，然后使用0.1×SSC、0.1％SDS在68℃洗凈的條件。更優(yōu)選的嚴(yán)格條件是，可以例示為使用的雜交液為50％甲醛、5×SSC(0.15M NaCl，15mM sodium citrate，PH7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml的變性鮭精子DNA、50mM磷酸緩沖液(PH7.5)。
(載體)本發(fā)明的另外的方面是提供攜帶上述本發(fā)明DNA(包括改變的DNA)的載體。這樣的載體是通過(guò)把本發(fā)明的DNA載入現(xiàn)有的載體或載入對(duì)現(xiàn)有的載體實(shí)施改變后的載體內(nèi)而制作的。原則上只要能夠攜帶本發(fā)明的DNA，任何載體都可作為起始材料，但可根據(jù)使用目的(克隆、聚肽的表達(dá))的需要，以及考慮宿主細(xì)胞的種類(lèi)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)妮d體。本發(fā)明的DNA向載體內(nèi)載入的方法，可通過(guò)用限制酶及DNA連接酶的公知方法(Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)來(lái)進(jìn)行制作。
此外，在構(gòu)建攜帶有包括啟動(dòng)子區(qū)在內(nèi)的DNA(如具有序列號(hào)5、6、8任一項(xiàng)所表示的序列的DNA)的載體時(shí)，可以容易地把該DNA的啟動(dòng)子區(qū)和其他區(qū)分開(kāi)，再分別把它們載入載體內(nèi)以構(gòu)建重組載體。在這種情況下，以啟動(dòng)子能夠確切地發(fā)揮其功能為條件，在載體內(nèi)的兩者(啟動(dòng)子區(qū)和其他區(qū))之間也可以介入其他序列。此外，也可以先構(gòu)建攜帶啟動(dòng)子區(qū)的載體，然后再與其他區(qū)連結(jié)。
轉(zhuǎn)化用的載體中，典型的是攜帶有磷脂酶A2基因(如具有序列號(hào)3表示的序列的DNA)、啟動(dòng)子以及終止子。為確保啟動(dòng)子操縱的結(jié)構(gòu)基因?qū)崿F(xiàn)確切的轉(zhuǎn)錄，按照從上游到下游的順序配置啟動(dòng)子、磷脂酶A2基因及終止子。載體內(nèi)也可以含有具有選擇標(biāo)記或增強(qiáng)子功能的序列以及對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行編碼的序列。
(轉(zhuǎn)化體)轉(zhuǎn)化用的載體能夠用于絲狀菌的轉(zhuǎn)化。即、使用上述轉(zhuǎn)化用的載體，能夠構(gòu)建絲狀菌的轉(zhuǎn)化體的制備方法。根據(jù)所述的制備方法，可以得到從外部導(dǎo)入本發(fā)明的DNA的絲狀菌。這樣得到的絲狀菌的轉(zhuǎn)化體能夠用于磷脂酶A2的生產(chǎn)。具體來(lái)說(shuō)，在該DNA編碼的蛋白質(zhì)(磷脂酶A2)能夠表達(dá)的條件下，培養(yǎng)從外部導(dǎo)入本發(fā)明的DNA的絲狀菌的轉(zhuǎn)化體，能夠產(chǎn)生磷脂酶A2。根據(jù)使用的宿主的不同，選擇適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)作培養(yǎng)基，例如可以使用市售的各種培養(yǎng)基或在其中添加了精氨酸、尿苷等轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)發(fā)育、選擇、促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)等所必須的成分的培養(yǎng)基。
可以從經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)之后的培養(yǎng)液或菌體中回收目的蛋白質(zhì)(磷脂酶A2)。產(chǎn)生到菌體外時(shí)可以從培養(yǎng)液中回收，除此之外可以從菌體內(nèi)回收。從培養(yǎng)液中回收的情況下，例如可以通過(guò)過(guò)濾培養(yǎng)上清液、離心分離除去不溶物，然后使用硫酸銨沉淀等鹽析、透析、各種層析法等組合來(lái)進(jìn)行分離、精制而得到目的蛋白質(zhì)。另一方面，從菌體內(nèi)回收的情況下，例如可以對(duì)菌體進(jìn)行加壓處理、超聲波處理等使其破碎后，采取與上述同樣的方法進(jìn)行分離、精制而得到目的蛋白質(zhì)。此外，也可以在經(jīng)過(guò)過(guò)濾、離心分離等從預(yù)先制備的培養(yǎng)液中回收菌體后，實(shí)施上述一連串的工序(菌體的破碎、分離、精制)。此外，本發(fā)明的磷脂酶A2通常是產(chǎn)生到菌體外的，所以其分離、精制都比較容易。
用于轉(zhuǎn)化的宿主絲狀菌的種類(lèi)沒(méi)有特別的限制，可以使用曲霉屬(米曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、醬油曲霉、泡盛曲霉、白曲霉、寄生曲霉、黃曲霉、Aspergillus.nomius、煙曲霉等)、青霉屬、木霉屬、根霉屬、毛霉菌屬、或鐮孢(霉)屬等分類(lèi)出來(lái)的絲狀菌。優(yōu)選使用曲霉屬絲狀菌，其中因?yàn)槊浊够蚝谇沟陌踩愿撸詢?yōu)選。
可以利用公知的方法實(shí)施轉(zhuǎn)化用的載體向宿主絲狀菌內(nèi)導(dǎo)入(轉(zhuǎn)化)。例如可以根據(jù)使用原生質(zhì)體化菌的Turner等的方法(Gene，36，321-331(1985))進(jìn)行導(dǎo)入，此外也可以采用五味等的方法(Agric.Biol.Chem.，51，323-328(1987))等導(dǎo)入。
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更加詳細(xì)的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不僅僅限于實(shí)施例的內(nèi)容。并且實(shí)施例中對(duì)各種基因的操作根據(jù)上述Currentprotocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)所記載的方法實(shí)施。
全基因組鳥(niǎo)槍法基因文庫(kù)的制作方法1.插入方的制備(1)染色體DNA的制備將絲狀菌Aspergillus oryzae RIB-40株(ATCC 42149)的孢子接種在YPD培養(yǎng)基(0.5％Yeast extract，1％Peptone，2％Glucose)上，30℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，然后根據(jù)飯村的方法(Argric.Biol.Chem.323-328，51(1987))提取基因組DNA。為了除去混在基因組DNA中的線粒體DNA，參照Watson等的方法(Methods Enzymol.57-75 118(1986))，使用氯化銫超速離心，精制成只有染色體DNA。
(2)染色體DNA的片斷化把制備的純凈的染色體DNA放入隨機(jī)化DNA片斷裝置HydroShear(トミ-精工)內(nèi)，使染色體DNA變成1-2kb左右的片斷。
(3)片斷化的DNA的末端處理對(duì)片斷化的染色體DNA進(jìn)行BAL31核酸酶(TAKARA)處理，然后實(shí)施Klenow Fragment(TAKARA)處理使末端平滑。
(4)向末端附加Adaptor在末端平滑的染色體DNA片斷的兩端，使用T4 DNA Ligase(TAKARA)連接具有(p)5’-CGAGAGCGGCCGCTAC-3’和(p)5’-GTAGCGGCCGCTC-3’的連接物。
2.轉(zhuǎn)化用限制酶SalI(TAKARA)把pUC19切斷后，通過(guò)Taq DNA聚合酶(ロシユ.ダイアグノステイクス)把dT插入到SalI切斷的部分。如此制作的質(zhì)粒通過(guò)Alkaline Phosphatase(TAKARA)處理，脫磷酸化后作為載體使用。利用T4 DNA Ligase將載體和上述制備的染色體DNA片斷進(jìn)行連結(jié)，利用電穿孔法在大腸菌DH10B(Gibco)上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
3.堿基序列的確定對(duì)于質(zhì)粒DNA，將大腸菌轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基2xYP上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)10小時(shí)，集菌后在滅菌水中99℃加熱處理10分鐘。把該上清液作為DNA模板水溶液使用，通過(guò)實(shí)施98℃20秒、68℃2分鐘的30個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，測(cè)序用引物將包括復(fù)性部位在內(nèi)的插入片斷的全長(zhǎng)擴(kuò)增。將制得的DNA片斷作為桑格法的模板，使用M13通用引物或M13逆向引物和Perkin Elmer公司制造的PRISM Dye-Terminatior DNA測(cè)序試劑盒，參照試劑盒附加的說(shuō)明書(shū)實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。對(duì)于測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物，使用凝膠過(guò)濾法等除去未反應(yīng)的Dye-terminator后，使用Perkin Elmer公司制造的3700DNA sequencer解讀DNA片斷的堿基序列。利用Phred(phil Green)對(duì)3700DNA sequencer輸出波形數(shù)據(jù)進(jìn)行再解析，除去載體和連接物序列后，使用SPS Phrap(Southwest Parallel Software公司)進(jìn)行集成匯編，構(gòu)建曲霉菌基因組DNA堿基序列的重疊群。
基因的鑒定采用下述方法從基因組DNA堿基序列中鑒定基因?；虻蔫b定方法，對(duì)于基因組DNA堿基序列的重疊群，參考已經(jīng)得到的EST序列的信息以及與已知蛋白質(zhì)氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性信息，采用以淺井潔等的算法(Pacific Symposium on Biocomputing 98，228-239)為基礎(chǔ)的基因區(qū)域的預(yù)測(cè)系統(tǒng)GeneDecoder和后藤修的算法(Bioinformatics 200016190-202.)為基礎(chǔ)的基因區(qū)域的預(yù)測(cè)系統(tǒng)ALN的組合來(lái)鑒定基因。另外，采用tRNA-scan預(yù)測(cè)tRNA基因。
第1“BLAST同源性基因候補(bǔ)區(qū)域的提取”從基因組DNA的堿基序列的重疊群中提取出與已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有高度同源性的區(qū)域。根據(jù)Karlin and Altschul的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sei.USA 872264-2268，1990、Proc.Natl.Acad.Sei.USA905873-5877，1993)可以確定氨基酸序列的同源性，而以該算法為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出的被稱(chēng)為BLASTX的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.215403-410，1990)，在基因組DNA的堿基序列被翻譯成氨基酸序列時(shí)能夠直接檢索出同源性高的區(qū)域。具體的解析方法是公知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov.)。本方法中，以基因組DNA的堿基序列的重疊群為查詢序列，以SWISSPROT版39(Bairoch，A.&Apweiler，R.NucleicAcids Res.28，45-48(2000).)以及NRaa為數(shù)據(jù)庫(kù)，實(shí)施BLASTX檢索，提取出BLAST算法中的同源性指標(biāo)E-value為10-30或更小(E-value的數(shù)值越小表示同源性越高)的區(qū)域。在這些區(qū)域中，使同源性更高的部分優(yōu)先，提取出相互不重疊的BLAST同源性基因的候補(bǔ)區(qū)域。
第2“提取ALN基因的候補(bǔ)區(qū)域”在BLAST同源性基因的候補(bǔ)區(qū)域中，以相對(duì)于同源性對(duì)象的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的全長(zhǎng)的90％的區(qū)域具有同源性的序列為核心，運(yùn)用基因區(qū)域預(yù)測(cè)系統(tǒng)ALN，對(duì)重疊群序列提取出ALN基因的候補(bǔ)區(qū)域。ALN通過(guò)對(duì)同源性對(duì)象的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的全長(zhǎng)與重疊群序列進(jìn)行整列和確定剪接部位，來(lái)預(yù)測(cè)基因區(qū)域。
第3“GD同源性基因候補(bǔ)區(qū)域的提取”在BLAST同源性基因的候補(bǔ)區(qū)域中，以相對(duì)于同源性對(duì)象的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的殘余長(zhǎng)度的20％或更高、不足90％的區(qū)域中具有同源性的序列為核心，運(yùn)用基因區(qū)域預(yù)測(cè)系統(tǒng)GeneDecoder，對(duì)重疊群序列提取出GD同源性基因的候補(bǔ)區(qū)域。GeneDecoder統(tǒng)合了BLASTX的E-value和蛋白質(zhì)編碼區(qū)的指向性指標(biāo)的2組密碼子統(tǒng)計(jì)量，進(jìn)一步參考根據(jù)以剪接部位的位置為依據(jù)的一階馬爾科夫模型(マルコフモデル)的得分，預(yù)測(cè)基因區(qū)域。
第4“EST-GD基因候補(bǔ)區(qū)域的提取”對(duì)于與重疊群序列相對(duì)應(yīng)的EST確定的基因表達(dá)區(qū)域，在該區(qū)域附近的重疊群序列中通過(guò)運(yùn)用GeneDecoder，不僅能預(yù)測(cè)EST序列確定的基因區(qū)域，而且能夠預(yù)測(cè)基因的全部區(qū)域，把此區(qū)域作為EST-GD基因的候補(bǔ)區(qū)域。
第5“一般的GD基因的候補(bǔ)區(qū)域的提取”對(duì)于沒(méi)有被第1到第4的基因候補(bǔ)區(qū)域所包括的重疊群序列，通過(guò)運(yùn)用GeneDecoder預(yù)測(cè)基因區(qū)域。
第6“tRNA基因的候補(bǔ)區(qū)域的提取”在全部的重疊群序列中使用tRNA-scan，提取tRNA基因的候補(bǔ)區(qū)域。
第7“基因候補(bǔ)區(qū)域的統(tǒng)合”根據(jù)下述步驟，統(tǒng)合第2到第6的基因候補(bǔ)區(qū)域。首先，從第2到第6的基因的候補(bǔ)區(qū)域中除去預(yù)測(cè)與EST確定的剪接部位相矛盾的基因區(qū)域，把殘留的基因候補(bǔ)區(qū)域通過(guò)除去互相重合的部分后進(jìn)行統(tǒng)合。此時(shí)，優(yōu)先按照tRNA、ALN同源性基因候補(bǔ)區(qū)域、GD同源性基因候補(bǔ)區(qū)域、GD-EST基因候補(bǔ)區(qū)域、一般的GD基因候補(bǔ)區(qū)域的順序統(tǒng)合。把這種被統(tǒng)合的基因候補(bǔ)區(qū)域作為預(yù)測(cè)基因的組合。
根據(jù)上述操作步驟，從同源性的觀點(diǎn)看，按照與已知蛋白質(zhì)的全部長(zhǎng)度具有同源性的基因、與已知蛋白質(zhì)部分地具有同源性的基因、與已知蛋白質(zhì)不具有同源性的基因這樣的順序的可信性，來(lái)保證能夠準(zhǔn)確鑒定這些基因。此外，從表達(dá)的確定性來(lái)看，按照根據(jù)EST確定的表達(dá)基因、根據(jù)EST序列沒(méi)有確定的表達(dá)基因的順序的可信性，來(lái)保證能夠準(zhǔn)確鑒定這些基因，同時(shí)要保證所有的候補(bǔ)基因與用EST確定的剪接部位不相矛盾。
使用的方法是采用了蛋白質(zhì)的編碼區(qū)全部不能包括起始密碼子和終止密碼子的算法，這樣把偽基因預(yù)測(cè)為正?；虻目赡苄孕?。
關(guān)于功能確定，對(duì)于預(yù)測(cè)到的基因區(qū)域通過(guò)以Nraa作為數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST進(jìn)行同源性檢索，以鑒定功能用的充分同源性(E-value 10-30)作為域值來(lái)確定功能。
實(shí)施例3 對(duì)磷脂酶A2進(jìn)行編碼序列的檢索以來(lái)自于Helicosporium sp.的磷脂酶A2基因的DNA序列為基礎(chǔ)，以曲霉菌基因組DNA中的全部DNA序列為對(duì)象，實(shí)施NCBI提供的BLAST檢索(Standard protein-protein BLASTblastp)。其結(jié)果是成功發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與來(lái)自于Helicosporium sp.磷脂酶A2有高度同源性的區(qū)域。其中的1個(gè)區(qū)域，在鑒定上述基因時(shí)預(yù)測(cè)其中多少具有一些功能的序列，但還沒(méi)有推定出它的功能。并且，該基因的編碼區(qū)(推定是磷脂酶A2-spaA編碼區(qū))用序列號(hào)3表示。此外，該區(qū)域編碼的氨基酸序列用序列號(hào)1表示。
另一方面，另一個(gè)區(qū)域(序列)，當(dāng)初預(yù)測(cè)其具有翻譯(translation)功能，存在于沒(méi)有得到功能推定的序列內(nèi)部。并且，當(dāng)初預(yù)測(cè)該序列是由與本次推定的氨基酸序列完全不同的624個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)的編碼序列，但通過(guò)本次研究發(fā)現(xiàn)了與來(lái)自于其他絲狀菌的磷脂酶A2的氨基酸序列同源性更高的160個(gè)氨基酸序列(序列號(hào)2)的編碼序列。對(duì)該氨基酸序列編碼的堿基序列用序列號(hào)7(推定是磷脂酶A2-spaB的編碼區(qū)域)表示(包含內(nèi)含子的序列在序列號(hào)4中表示)。另外，至于出現(xiàn)這樣的區(qū)別，是由于在當(dāng)初的預(yù)測(cè)中沒(méi)有正確地進(jìn)行內(nèi)含子的推定。此外，考慮到鏈孢菌屬(ノイロスポラクラツサ)中存在有2種磷脂酶A2基因(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)ACCESSION NO.NCU06650，NCU09423)，所以預(yù)測(cè)本基因組序列中也存在除上述序列(序列號(hào)3)之外的別的磷脂酶A2基因，在該預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的反復(fù)研究是成功發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列(序列號(hào)2)的原因之一。
為了解析上述鑒定的2個(gè)區(qū)域(序列)的功能，實(shí)施了下述實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例4 染色體DNA的制備將米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB-40株放入裝有200ml的DPY培養(yǎng)基(2％糊精、1％聚胨、0.5％酵母提取液、0.5％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、PH5.5)的三角燒瓶中，30℃培養(yǎng)2天；使用布氏漏斗和空吸濾瓶過(guò)濾培養(yǎng)液，得到菌體；用研缽、研棒將被液態(tài)氮冷凍的菌體破碎，然后加入20ml SolI(50mM EDTA、0.5％SDS、0.1mg/mlProteinase K、PH8.0)，50℃溫育4小時(shí)。接著用苯酚處理2次、苯酚·氯仿處理1次、氯仿處理1次(離心分離的條件為3500rpm、15分鐘、4℃)，在上清液中加入其量的1/10的3M醋酸鈉(PH5.2)和等量的異丙醇，冷卻一個(gè)晚上；在3500rpm、4℃時(shí)離心分離20分鐘，用70％的乙醇溶液清洗沉淀后，再把其溶解于TE(10mM Tris-HCl(PH8.0)、1mM EDTA)溶液中；接著，使RNase A成為10μg/ml，37℃溫育30分鐘；加入等量的苯酚·氯仿混合后，在3500rpm、4℃時(shí)離心分離20分鐘，回收上層液；在上層液中加入其量的1/10的3M醋酸鈉(PH5.2)和2.5倍量的乙醇，在3500rpm、4℃時(shí)離心分離20分鐘得到沉淀，把其作為染色體DNA溶液。
實(shí)施例5 磷脂酶A2基因的制備在實(shí)施例3得到的曲霉菌基因組DNA重疊群序列信息的基礎(chǔ)上，以實(shí)施例4得到的曲霉菌基因組DNA為模板，克隆磷脂酶A2-spaA及磷脂酶A2-spaB基因。將預(yù)測(cè)為各個(gè)目的基因(推定磷脂酶A2-spaA及磷脂酶A2-spaB基因)的起始密碼子到終止密碼子的DNA片斷進(jìn)行擴(kuò)增的引物對(duì)設(shè)計(jì)如下。
磷脂酶A2-spaA基因用引物Ao1724s 5’-cagcgaattcATGAAGAACATCTTCGTTGC-3’(序列號(hào)9)Ao1724as 5’cagcgaattcCTACAGGTTTTCAATATCGT-3’(序列號(hào)10)對(duì)于磷脂酶A2-spaB基因，在來(lái)自于鏈孢菌屬(ノイロスポラクラツサ)的2種磷脂酶A2基因(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)ACCESSIONNO.NCU06650，NCU09423)內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子，假定在本基因內(nèi)的相當(dāng)于同樣的位置也存在內(nèi)含子，那么比來(lái)自于其他微生物的磷脂酶A2的氨基酸序列的同源性更高?？紤]到這些因素，磷脂酶A2-spaB基因擴(kuò)增用的引物設(shè)計(jì)如下。
磷脂酶A2-spaB基因用的引物Ao0940s 5’-cagcgaattcATGAAGGCTAACAGCTTTCT-3’(序列號(hào)11)Ao0940as 5’gcgcgaattccaaggtctcatatatgtatc-3’(序列號(hào)12)此外，上述4個(gè)引物中下劃線部分表示限制酶EcoRI識(shí)別部位，大寫(xiě)字母分別表示蛋白質(zhì)編碼區(qū)域。
使用上述引物對(duì)實(shí)施PCR反應(yīng)，并且，反應(yīng)液的組成如下所示。
滅菌水29.75μlrTaq DNA Polymerase用10x緩沖液5μl2mM dNTP溶液5μl10pmol/μl Ao1724s或Ao0940s2.5μl10pmol/μl Ao1724as或Ao0940as2.5μl60ng/μl RIB40基因組DNA5μl5U/μl rTaq DNA Polymerase(寶酒造公司)0.25μl/50μl采用MJ research公司制造的PTC-100型PCR裝置，將上述反應(yīng)液在下述條件下實(shí)施PCR反應(yīng)。
(1)94℃1分鐘(2)94℃30秒、50℃30秒、72℃2分鐘的循環(huán)進(jìn)行30次循環(huán)(3)4℃放置PCR反應(yīng)的結(jié)果，有約670bp及約700bp的DNA片斷分別得到特異性擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳后使用GeneClaenlll(BIO 101公司)提取擴(kuò)增的DNA片斷。把提取的DNA片斷在PT7-Blue(Novagen公司)里進(jìn)行連接反應(yīng)，利用常規(guī)方法確定堿基序列。
實(shí)施例6 氨基酸序列的解析對(duì)實(shí)施例5得到的堿基序列進(jìn)行解析，解析結(jié)果證明，該堿基序列是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的DNA(序列號(hào)3和4)，該蛋白質(zhì)與以前報(bào)告的來(lái)自于微生物的磷脂酶A2的氨基酸序列有約35％～約55％的同源性，把各DNA作為spaA和spaB基因。由前者編碼的推定磷脂酶A2-spaA全長(zhǎng)含有222個(gè)氨基酸，除去由SMART(Schultz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864(1998)；Letunic et al.，Nucleic Acids Res.30，242-244(2002)；http//smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)的信號(hào)序列區(qū)域(19個(gè)氨基酸)后的分子量是23.4kDa，含有6個(gè)半胱氨酸。另一方面，由spaB基因編碼的推定磷脂酶A2-spaB全長(zhǎng)含有160個(gè)氨基酸，除去上述由SMART預(yù)測(cè)的信號(hào)區(qū)域(17個(gè)氨基酸)后的分子量是16.4kDa，含有4個(gè)半胱氨酸。此外發(fā)現(xiàn)任一種酶都含有與分泌型磷脂酶A2共同的活性中心的His-Asp配對(duì)序列。
實(shí)施例7 曲霉菌表達(dá)載體-pNGspaA的構(gòu)建接著，為了在曲霉菌中表達(dá)磷脂酶A2-spaA構(gòu)建了質(zhì)粒pNGspaA。首先，對(duì)于實(shí)施例5得到的、在pT7-Blue中克隆的磷脂酶A2-spaA基因，用限制酶Hind III Xba I(寶酒造公司)把它消化成約670bp的DNA片斷后切出，作為插入DNA。另一方面，用限制酶HindIII Xba I(寶酒造公司)消化曲霉菌表達(dá)載體-pNGA142(Minetoki et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，459-467(1988))，該曲霉菌表達(dá)載體含有作為選擇標(biāo)記物的來(lái)自于曲霉菌的niaD基因、作為啟動(dòng)子的來(lái)自于曲霉菌的改良型葡萄糖淀粉酶基因的改良型啟動(dòng)子、作為終止子的來(lái)自于曲霉菌的α-糖苷酶基因的終止子，然后使用Alkaline Phosphatase(寶酒造公司)進(jìn)行脫磷酸化，作為載體DNA；利用Ligation Kit ver.2(寶酒造公司)使上述得到的插入DNA和載體DNA進(jìn)行連接反應(yīng)，利用此連接反應(yīng)產(chǎn)物使大腸菌DH5α株的感受態(tài)細(xì)胞(TOYOBO公司)發(fā)生轉(zhuǎn)化，得到耐氨芐西林的轉(zhuǎn)化體。把具有得到的克隆的質(zhì)粒命名為pNGspaA，把其作為表達(dá)載體使用(圖1)。
實(shí)施例8 曲霉菌表達(dá)載體-pNGspaB的構(gòu)建接著，為了在曲霉菌中表達(dá)磷脂酶A2-spaB構(gòu)建了質(zhì)粒pNGspaB。首先，將實(shí)施例5得到的并且在pT7-Blue中克隆的磷脂酶A2-spaB基因，用限制酶HindIII Xba I(寶酒造公司)把它消化成700bp的DNA片斷后切出，作為插入DNA；另一方面，用限制酶Hind III Xba I(寶酒造公司)消化曲霉菌表達(dá)載體pNGA142(Minetoki et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，459-467(1988))，該曲霉菌表達(dá)載體含有作為選擇標(biāo)記物的來(lái)自于曲霉菌的niaD基因、作為啟動(dòng)子的來(lái)自于曲霉菌的改良型葡萄糖淀粉酶基因的改良型啟動(dòng)子、作為終止子的來(lái)自于曲霉菌的α-糖苷酶基因的終止子，然后使用Alkaline Phosphatase(寶酒造公司)脫磷酸化，作為載體DNA；利用Ligation Kit ver.2(寶酒造公司)使上述調(diào)制的插入DNA和載體DNA進(jìn)行連接反應(yīng)，利用此連接反應(yīng)產(chǎn)物使大腸菌DH5α株的感受態(tài)細(xì)胞(TOYOBO公司)發(fā)生轉(zhuǎn)化，得到耐氨芐西林的轉(zhuǎn)化體。把具有得到的克隆的質(zhì)粒命名為pNGspaB，把其作為表達(dá)載體使用(圖2)。
實(shí)施例9 曲霉菌的轉(zhuǎn)化將硝酸還原酶缺損株米曲霉(Aspergillus oryzae)niaD 300株(Aspergillus oryzae RIB-40株(ATCC 42149)的硝酸還原酶缺損變異株、Minetoki et al.，Curr.Genet.，30，432-438(1996))放入糊精·胨培養(yǎng)基(2％糊精、1％聚胨、0.5％KH2PO4、0.05％MgSO4·7H2O、PH5.5)中，30℃振蕩培養(yǎng)3天；然后用滅菌水把得到的菌體洗凈；把該菌體加入細(xì)胞壁溶解液(10Mm磷酸緩沖液、PH6.0、0.8M NaCl、20mg/mlヤタラ一ゼ(寶酒造公司))中使之發(fā)生懸濁，30℃緩慢振蕩培養(yǎng)2～3小時(shí)，發(fā)生原生質(zhì)體化；將得到的原生質(zhì)體通過(guò)玻璃過(guò)濾器過(guò)濾除去殘存的菌體。
接著，通過(guò)五味等的方法(Agric.Biol.Chem.，51，323-328(1987))，利用該原生質(zhì)體制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞以及利用pNGA142(對(duì)照)、pNGspaA或pNGspaB進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以含有硝酸作為單一氮源的培養(yǎng)基，例如恰佩克培養(yǎng)基(0.2％NaNO3、0.1％KH2PO4、0.2％KCl、0.05％MgSO4·7H2O、0.002％FeSO4·7H2O、2％葡萄糖、PH5.5)，對(duì)于每種質(zhì)粒，分別取4株能夠在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)化體，共取得12株。把來(lái)自于質(zhì)粒pNGA142、pNGspaA或pNGspaB的轉(zhuǎn)化體分別命名為載體1～載體4、SpaA-1～SpaA-4、SpaB-1～SpaB-4。
實(shí)施例10 用磷脂酶A2-spaA轉(zhuǎn)化體表達(dá)磷脂酶A2將得到的磷脂酶A2-spaA的轉(zhuǎn)化體在下述所示的DPY培養(yǎng)基上30℃振蕩培養(yǎng)3天，然后將培養(yǎng)液在室溫、10,000×g的條件下離心分離10分鐘，得到培養(yǎng)上清液和菌體。用粉碎機(jī)(マルチビ一ズショツカ一)(安井器械公司)破碎菌體，得到的懸濁液作為菌體破碎液。
<DPY培養(yǎng)基>
2％糊精1％聚胨0.5％酵母提取液0.5％KH2PO40.05％MgSO4·7H2OPH5.5采用下述方法測(cè)定上述制備的培養(yǎng)上清液和菌體中磷脂酶A2的活性，結(jié)果確認(rèn)，尤其是培養(yǎng)上清液中明顯存在比對(duì)照株(即載體1～載體4株)的活性更高的磷脂酶A2活性(圖3)。該結(jié)果可以明確證實(shí)取得的推定磷脂酶A2-spaA基因?qū)α字窤2進(jìn)行編碼。
(磷脂酶A2酶的活性測(cè)定方法)磷脂酶A2的活性測(cè)定，采用對(duì)定量測(cè)定標(biāo)識(shí)油酸的方法(Elsbach，P.，and Weiss，J.(1991)Methods Enzymol.197，24-31)進(jìn)行若干變更后的方法，該定量測(cè)定標(biāo)識(shí)油酸的方法是定量測(cè)定從in vivo標(biāo)識(shí)的大腸菌的膜上游離出的油酸。即、將由2.5×108的[3H]油酸標(biāo)識(shí)后的高壓蒸汽滅菌的大腸菌(-500,000dpm)、25mM Tris-HCl緩沖溶液(PH7.5)和10mM CaCl2及酶液組成的反應(yīng)液(最終液量為100μl)，30℃溫育30分鐘，添加用冰冷卻的1％的牛血清白蛋白(W/V)后立刻離心分離(10,000×g)，用液體閃爍掃描計(jì)數(shù)器測(cè)量得到的上清液中的放射活性。根據(jù)本條件下測(cè)出的計(jì)數(shù)(H-DPM)求出酶的活性(H-DPM/μg-protein)。采用下述方法制備[3H]油酸標(biāo)識(shí)的大腸菌，將在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)了1夜的Eshcericia coli DH5α株的培養(yǎng)液100μl接種于含有10ml的5μCi/ml的[3H]油酸的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)3小時(shí)。將該培養(yǎng)液在室溫、3,000×g的條件下離心分離12分鐘，把收集到的菌體加入到10ml新鮮的上述培養(yǎng)基中使之懸濁，37℃培養(yǎng)30分鐘。在室溫、3,000×g的條件下離心分離、收集菌體，用5ml的1％的牛血清白蛋白(W/V)洗凈，最后加入適量的蒸餾水使之成為5×108細(xì)胞/ml懸濁液，作為[3H]油酸標(biāo)識(shí)的大腸菌液。
實(shí)施例11 用磷脂酶A2-spaB轉(zhuǎn)化體表達(dá)磷脂酶A2利用磷脂酶A2-spaB轉(zhuǎn)化體，通過(guò)實(shí)施與實(shí)施例10同樣的培養(yǎng)及培養(yǎng)后的處理，得到A2-spaB轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液和菌體破碎液。此外，與磷脂酶A2-spaA轉(zhuǎn)化體的情況相比，A2-spaB轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)發(fā)育大大受到抑制。認(rèn)為可能是因?yàn)榱字窤2-spaB的大量表達(dá)對(duì)菌體產(chǎn)生的一些抑制效果所致。
對(duì)于取得的培養(yǎng)上清液和菌體破碎液，與磷脂酶A2-spaA的情況一樣，測(cè)定磷脂酶A2的活性。其結(jié)果確認(rèn)，尤其是菌體破碎液中明顯存在比對(duì)照株(載體1～載體4株)活性更高的磷脂酶A2活性(圖3)。該結(jié)果可以明確證實(shí)取得的推定磷脂酶A2-spaB基因?qū)α字窤2進(jìn)行編碼。
實(shí)施例12 用磷脂酶A2-spaA的轉(zhuǎn)化體表達(dá)的磷脂酶A2的精制取20ml實(shí)施例10得到的磷脂酶A2-spaA的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液，用25mM Tris-HCl緩沖液(PH7.4)將其稀釋10倍，然后向用25mMTris-HCl緩沖液(PH7.4)平衡過(guò)的CM-纖維柱內(nèi)進(jìn)樣，使用含有0.1M、0.25M、0.5M、1.0M NaCl的同樣的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，分別取10μl的各洗脫液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果在NaCl濃度為0.5M～1.0M的溶出區(qū)域中檢出了分子量約為16kDa的單一譜帶(圖4)。測(cè)定得到的未吸附、0.25M NaCl、0.5M NaCl、1.0M NaCl的各區(qū)域中的磷脂酶A2的活性。結(jié)果如圖5所示，在0.5M NaCl、1.0MNaCl的各區(qū)域中檢出了磷脂酶A2的活性，而在未吸附、0.25M NaCl的區(qū)域中幾乎沒(méi)有檢出磷脂酶A2的活性。因此可以證明，在0.5M NaCl、1.0M NaCl的區(qū)域中溶出的分子量約為16kDa的蛋白質(zhì)就是磷脂酶A2。
本發(fā)明并不限定于上述發(fā)明的實(shí)施方式及實(shí)施例的說(shuō)明內(nèi)容，同領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所記載的范圍內(nèi)，容易想到的各種變形方式都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
產(chǎn)業(yè)利用的可能性本發(fā)明能夠提供來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2及對(duì)其進(jìn)行編碼的DNA。利用本發(fā)明的DNA，能夠構(gòu)建使用安全性高的用絲狀菌來(lái)生產(chǎn)磷脂酶A2的生產(chǎn)系統(tǒng)。
序列表<110>獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤(pán)機(jī)構(gòu)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所獨(dú)立行政法人酒類(lèi)綜合研究所北本勝?gòu)┯袑鶎W(xué)山口莊太郎町田雅之阿部敬悅五味勝也淺井潔佐野元昭金大心長(zhǎng)崎英樹(shù)細(xì)山哲秋田修小笠原直毅久原哲<120>來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A2<130>P0302001<150>JP P2003-57565<151>2003-03-04<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>222<212>PRT<213>米曲霉菌<400>1Met Lys Asn Ile Phe Val Ala Thr Leu Gly Leu Phe Ala Ala Val Ser1 51015Ser Ala Leu Pro Tyr Thr Thr Pro Val Asn Asp Asn Pro Ile Ser Ala
20 25 30Leu Gln Ala Arg Ala Thr Thr Cys Ser Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu35 40 45Ile Phe Lys Val Ser Met Lys Thr Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ala Lys50 55 60Asn Pro Ser Lys Cys Asn Trp Ser Ser Asp Asn Cys Ser Lys Ser Pro65 70 75 80Asp Lys Pro Asp Gly Tyr Asn Phe Ile Pro Ser Cys Gln Arg His Asp85 90 95Phe Gly Tyr Arg Asn Thr Lys Lys Gln Lys Arg Phe Thr Lys Ala Met100105110Lys Lys Arg Ile Asp Asp Asn Phe Lys Lys Asp Leu Tyr Lys Tyr Cys115 120 125Ser Gln Phe Ser Gly Trp Ser Ser Trp Lys Gly Val Glu Cys Arg Arg130 135 140Leu Ala Asp Val Tyr Tyr Thr Ala Val Arg His Phe Gly Lys Arg Asp145 150 155 160Glu Ala Leu Glu Phe Asp Pro Glu Val Glu Phe Glu Lys Arg Asp Glu165 170 175Val Ala Asp Val Gln Pro Asp Glu Phe Asp Asn Phe Asp Gly Ser Glu180 185190Val Asp Pro Asp Ile Glu Gly Gln Val Ile Pro Glu Val Leu Glu Asp
195 200 205Asp Gly Val Asp Val Glu Asn Leu Asp Asp Ile Glu Asn Leu210 215 220<210>2<211>160<212>PRT<213>米曲霉菌<400>2Met Lys Ala Asn Ser Phe Leu Ile Ala Leu Leu Pro Thr Ala Leu Ala1 5 10 15Ile Pro Leu Pro Thr Pro Asn Glu Gly Ala Thr Ser Leu Ser Glu Ser20 25 30Gln Arg Leu Gln Ser Ile Thr Asp Glu Leu Met Phe Gly Leu Glu Leu35 40 45Pro Asp Phe Thr Ala Arg Arg Glu Ala Asn Asp Pro Pro Gln Leu Asp50 55 60Trp Tyr Ser Asp Gly Cys Thr Arg Ala Pro Ser Asn Pro Leu Gly Phe65 70 75 80Pro Phe Gln Arg Ala Cys Glu Arg His Asp Phe Gly Tyr Gln Asn Tyr85 90 95Arg Ile Gln Gly Arg Phe Thr Lys Ala Ala Lys Ala Gln Ile Asp Leu100 105 110Arg Phe Lys Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Cys Glu Leu Gly Arg Ala Val115120125
Gly Ile Cys Lys Lys Leu Ala Arg Leu Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Arg130 135 140His Gly Gly Lys Asp Ala Ala Lys Arg Arg Glu Leu Asp Glu Leu Leu145 150 155 160<210>3<211>669<212>DNA<213>米曲霉菌<400>3atgaagaaca tcttcgttgc cactttgggc ctgttcgccg cagtttcgtc tgccttgccc60tacacaaccc ctgtcaatga caatcccatc tctgctttac aagcacgcgc gacaacatgc120tcggccaagg ccacggataa cctcatcttc aaggtctcca tgaagacctt ccagaaggcg180cgcaaggcca agaacccctc caagtgcaac tggtcatcgg acaactgctc caagtcaccc240gataagcccg atggatacaa cttcatcccc agctgccaaa gacacgattt cggctaccgg300aacacgaaga agcagaagcg cttcacaaag gccatgaaga agcgcattga cgacaacttc360aagaaggatc tctacaagta ctgcagccaa ttctcgggct ggagctcatg gaagggagtg420gagtgccgtc gccttgcgga tgtctactat actgctgtcc gccactttgg caagcgtgat480gaagcgcttg agtttgaccc tgaggttgag ttcgagaagc gtgatgaggt ggccgatgtc540cagcctgacg aatttgataa ctttgacggt tctgaagttg accctgatat cgagggccag600gtcattcccg aagttcttga agatgatgga gtggatgtgg agaacctcga cgatattgaa660aacctgtag669<210>4<211>593
<212>DNA<213>米曲霉菌<400>4atgaaggcta acagctttct cattgccctc ctcccaaccg ccctagccat ccccctcccc60acaccaaatg aaggcgctac aagcctctca gaaagccagc gcctccagtc tatcaccgac120gagcttatgt tcggcctcga gctgcccgac ttcacagctc gcagagaggc aaacgaccct180cctcagttag actggtactc tgatggctgc acaagggctc cgagtaaccc tctcggattc240ccctttcaaa gggcgtgtga acgccatgac ttcggttacc agaactaccg aatacaaggg300cgcttcacca aggccgcaaa agcgcagata gatcttagat tcaaagaaga gtatgatttc360cctttcgttc cttccttctc ccctggaatc tgcttctgtt gattcttatg gcagttggat420attgagagtc tggaggactg acgtttgatt cactgtttag tctttactat caatgtgaat480taggacgcgc tgtcggaatt tgcaagaagt tggctcggtt gtactaccgt gcttcggggc540ggcatggtgg taaagatgca gcgaagagaa gggagttgga tgaacttctt tag 593<210>5<211>1969<212>DNA<213>米曲霉菌<220>
<221>外顯子<222>(1001)..(1666)<223>
<400>5tgacctcata tagaagtgac gccgggccaa tgccaaaatt gaagctttta cgaagactaa60cctcggattt tttcttggca gagcttgacc tcgtattgcg tcaattgcga caattatcgc120tttcctggaa aatatcgcat attgaagaag tggcatgtat tgctgttagt gagtttggat180acgtatcaaa atactcctaa taaccagcaa ccaaaagaaa atgtgagcac tggtggaacc240
gaattgtgtt atggcaggat agaattgaga atgggtttct tcagcggggg atcctccgat300gataaccttc tgagagctat ttttagaatc aagggtcttc cagcttgacg atcatcttgg360catacacaag cactacagct gcacgacgat ggggctttac gagtcacgaa ggtaacccaa420gattcttcac tgagtcttgg catgcgagcc atgctcgtac ctggatccct tttgtctgga480atttactatt attggatacg ataatgcctt gatccagggt ccttttagaa ccaataggcc540actaaagctt acccgaggcc aatttatcct tcgaagtgaa tatgctcggt gcatttcagg600ttctgcagat cctgaagccc tttaccgtat cctgaatggt cttctcttct tctccaataa660tacgtcgagg gctttaatta tgttcgtgtt gagaactcgt aaagaaagac aaataggttc720ttggcgagag gggatagaat gcatcacgtc cacaatgcgg cacagggaat gtgccagacg780atacagcaga atgggggcgg agcgagacgt agtttaccga gtacgaaata gcctcgttca840aggagacagt ccatggcaac cataagagtc attcgcgagt ataaagggca ggtcaactcc900tgtcatgtag ctctctacag aatcatcaac aatctcctct cgcaagcatc acatctactt960cttattgcct attctgtccg agtgctagcc acttatcatc atg aag aac atc ttc 1015Met Lys Asn Ile Phe1 5gtt gcc act ttg ggc ctg ttc gcc gca gtt tcg tct gcc ttg ccc tac 1063Val Ala Thr Leu Gly Leu Phe Ala Ala Val Ser Ser Ala Leu Pro Tyr10 15 20aca acc cct gtc aat gac aat ccc atc tct gct tta caa gca cgc gcg 1111Thr Thr Pro Val Asn Asp Asn Pro Ile Ser Ala Leu Gln Ala Arg Ala25 30 35aca aca tgc tcg gcc aag gcc acg gat aac ctc atc ttc aag gtc tcc 1159Thr Thr Cys Ser Ala Lys Ala Thr Asp Asn Leu Ile Phe Lys Val Ser40 45 50atg aag acc ttc cag aag gcg cgc aag gcc aag aac ccc tcc aag tgc 1207Met Lys Thr Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ala Lys Asn Pro Ser Lys Cys55 60 65
aac tgg tca tcg gac aac tgc tcc aag tca ccc gat aag ccc gat gga1255Asn Trp Ser Ser Asp Asn Cys Ser Lys Ser Pro Asp Lys Pro Asp Gly70 75 80 85tac aac ttc atc ccc agc tgc caa aga cac gat ttc ggc tac cgg aac1303Tyr Asn Phe Ile Pro Ser Cys Gln Arg His Asp Phe Gly Tyr Arg Asn90 95 100acg aag aag cag aag cgc ttc aca aag gcc atg aag aag cgc att gac1351Thr Lys Lys Gln Lys Arg Phe Thr Lys Ala Met Lys Lys Arg Ile Asp105 110 115gac aac ttc aag aag gat ctc tac aag tac tgc agc caa ttc tcg ggc1399Asp Asn Phe Lys Lys Asp Leu Tyr Lys Tyr Cys Ser Gln Phe Ser Gly120 125 130tgg agc tca tgg aag gga gtg gag tgc cgt cgc ctt gcg gat gtc tac1447Trp Ser Ser Trp Lys Gly Val Glu Cys Arg Arg Leu Ala Asp Val Tyr135 140 145tat act gct gtc cgc cac ttt ggc aag cgt gat gaa gcg ctt gag ttt1495Tyr Thr Ala Val Arg His Phe Gly Lys Arg Asp Glu Ala Leu Glu Phe150 155 160 165gac cct gag gtt gag ttc gag aag cgt gat gag gtg gcc gat gtc cag1543Asp Pro Glu Val Glu Phe Glu Lys Arg Asp Glu Val Ala Asp Val Gln170 175 180cct gac gaa ttt gat aac ttt gac ggt tct gaa gtt gac cct gat atc1591Pro Asp Glu Phe Asp Asn Phe Asp Gly Ser Glu Val Asp Pro Asp Ile185190 195gag ggc cag gtc att ccc gaa gtt ctt gaa gat gat gga gtg gat gtg1639Glu Gly Gln Val Ile Pro Glu Val Leu Glu Asp Asp Gly Val Asp Val200 205 210gag aac ctc gac gat att gaa aac ctg taggttttcg gcattggctc 1686Glu Asn Leu Asp Asp Ile Glu Asn Leu215 220tacactttgc aaatgggtcg tcataatcca ttggaagccg gaggaggagg gaaatcaagg 1746catcttttgg ttgtcagtaa ctttgagtgc ctagtttgtg aattgttttt tgaggttcta 1806
tttgaattct gcttttgttc aatcttatag cttcctacgt tgttgtcatt taaaaatgga1866caggagtatc tgtgagattt ttgacttgaa atcagtagca gtcaaccaat aaaagaatag1926caaatgcttc taccaatctt tggatctagt acataagtag aca 1969<210>6<211>1893<212>DNA<213>米曲霉菌<220>
<221>外顯子<222>(1001)..(1350)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(1461)..(1590)<223>
<400>6atttatgcgc gatttatatg ctgtatcagg cgcccggatg gctttggcag tagccgacgg60cagacgacgg tgaatggaat gcaaggaaga gggggattta gcactcactc ttcacaaagt120tcaccacgac gctcaagagc cggcgcaaat gatcgcaggt gcggcttggg atgagcgaat180gctgaaacac tcctcagaca cggggtcgaa cgagaggggg gattgaggag atggtatcca240ggatggagtg gtggaggaag aagaggtgaa agtcggaagt aatttataaa ggctgcgatt300ccgcgcgatt cccattactc cacgccaagc ctagattgcc tctttcggaa tggtctccta360tcgacctcta agcaaaaacg gtaagaaatg gcagaatctc tgcctgcccc cgagctgttt420ctccggttcc gatctatgtt ctacatctat acatcaagca gacctcacca atatcctcaa480agggaagcag tgcctattat gctctattct ctaatgatta tctggcatta gccttgttga540ttggaatgct ccgccaatgg accagactaa agagtatgac tcaggctaaa agtcttcgct600acaatccaag gcttgctgga atcagtcgcg tttgtggtca agctggtaat ccaatggact660
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權(quán)利要求
1.磷脂酶A2，其含有下述(a)或(b)蛋白質(zhì)(a)具有序列號(hào)1表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(b)具有改變了序列號(hào)1表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A2功能的蛋白質(zhì)。
2.磷脂酶A2，其含有下述(c)或(d)蛋白質(zhì)(c)具有序列號(hào)2表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(d)具有改變了序列號(hào)2表示的氨基酸序列的一部分的氨基酸序列、具有磷脂酶A2功能的蛋白質(zhì)。
3.下述(A)或(B)DNA(A)對(duì)權(quán)利要求1所述的磷脂酶A2進(jìn)行編碼的DNA，(B)在嚴(yán)格條件下與(A)DNA進(jìn)行雜交，其編碼的蛋白質(zhì)具有磷脂酶A2功能的DNA。
4.下述(C)或(D)DNA(C)對(duì)權(quán)利要求2所述的磷脂酶A2進(jìn)行編碼的DNA；(D)在嚴(yán)格條件下與(C)DNA進(jìn)行雜交，其編碼的蛋白質(zhì)具有磷脂酶A2功能的DNA。
5.一種DNA，其含有下述(i)～(vi)中任一項(xiàng)的序列(i)序列號(hào)3表示的堿基序列；(ii)序列號(hào)4表示的堿基序列；(iii)序列號(hào)5表示的堿基序列；(iv)序列號(hào)6表示的堿基序列；(v)序列號(hào)7表示的堿基序列；(vi)序列號(hào)8表示的堿基序列。
6.一種載體，其攜帶有權(quán)利要求3～5中任一項(xiàng)所述的DNA。
7.一種絲狀菌，其從外部導(dǎo)入了權(quán)利要求3～5中任一項(xiàng)所述的DNA。
8.磷脂酶A2的生產(chǎn)方法，其包括下述步驟(1)和步驟(2)(1)在能夠產(chǎn)生上述DNA編碼的蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的絲狀菌的步驟；(2)回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的步驟。
全文摘要
提供來(lái)自于曲霉菌的磷脂酶A
文檔編號(hào)C12N1/15GK1756841SQ20048000559
公開(kāi)日2006年4月5日 申請(qǐng)日期2004年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月4日
發(fā)明者北本勝?gòu)? 有岡學(xué), 山口莊太郎, 町田雅之, 阿部敬悅, 五味勝也, 淺井潔, 佐野元昭, 金大心, 長(zhǎng)崎英樹(shù), 細(xì)山哲, 秋田修, 小笠原直毅, 久原哲 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤(pán)機(jī)構(gòu), 獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所, 獨(dú)立行政法人酒類(lèi)綜合研究所