專利名稱：分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥特別是乳腺癌的存在與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)的檢測。
背景技術(shù)：
全球范圍內(nèi)每年有超過一百萬的乳腺癌病例，其中約500,000例在美國，40,000例在英國，接近2000例在愛爾蘭。乳腺癌是女性患癌死亡的首要病因。盡管整體發(fā)病率在西方國家逐漸上升，但自1991年以來，更為廣泛的篩檢及治療方法的改進(jìn)使死亡率以每年約1％的速度逐年降低。被診斷患早期乳腺癌的患者，其5年相對存活率達(dá)90％以上，而被診斷患遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移乳腺癌(distally metastasised breast cancer)的患者，該存活率僅為20％。然而，并沒有確定的乳腺癌早期篩檢方法，目前的診斷還是基于乳房造影術(shù)和細(xì)針活檢(fine needle biopsy)的結(jié)果。乳房造影術(shù)有其局限性80％以上的可疑結(jié)果是假陽性，10-15％的患乳腺癌女性其檢測結(jié)果為假陰性。腫瘤通常在檢測前已發(fā)育到晚期，這會降低患者的存活機(jī)會，也會提高治療成本和醫(yī)療保健體系的管理成本。需要更為靈敏的方法檢測小的(直徑＜2cm)早期原位乳腺癌，以降低患者死亡率。除了早期檢測外，在判斷疾病是惡性還是良性、確定已知癌癥的所處時(shí)期以及區(qū)分腫瘤的類型方面，也存在著嚴(yán)重的問題。最后，還需要隨時(shí)監(jiān)測治療效果，辨別出對具體治療方法產(chǎn)生抗性的患者。這種檢測方法更為復(fù)雜，因?yàn)槿橄偈巧儆械膸讉€(gè)在成年期，特別是在妊娠期、哺乳期和更年期，其形態(tài)和功能經(jīng)歷顯著變化的器官之一。隨著時(shí)間的推移，該變化可能會引起同一乳腺中分子標(biāo)簽(molecular signature)的改變。
疾病診斷一般通過仔細(xì)檢查少量生物標(biāo)記的相對水平而實(shí)現(xiàn)。盡管近來有所進(jìn)步，但目前的生物標(biāo)記對患者治療和臨床結(jié)果的幫助依然有限。這是由于已有標(biāo)記的診斷靈敏度和疾病特異性較差。然而，一些分子生物標(biāo)記仍常規(guī)用于疾病診斷中，如前列腺特異抗原用于前列腺癌篩查，同時(shí)新的候選標(biāo)記也正以越來越快的速度被發(fā)現(xiàn)(Pritzker，2002)。人們正在逐漸認(rèn)識到使用一系列效果良好的生物標(biāo)記將提高檢查的陽性預(yù)測值，使假陽性或假陰性降到最低(Srinivas et al.，2002)。另外，目前人們對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)也越來越感興趣，該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)有望將各種生物標(biāo)記產(chǎn)生的微弱而獨(dú)立的信息結(jié)合起來，以產(chǎn)生較單獨(dú)使用生物標(biāo)記而言其信息量更大的預(yù)后/預(yù)測指數(shù)(Yousef et al.，2002)。
由于比較了更多的分子信息，人們正在根據(jù)與病人結(jié)果相關(guān)的遺傳標(biāo)簽(genetic signature)對諸如乳腺癌等疾病加以細(xì)分，從而為臨床醫(yī)生提供有價(jià)值的信息。分子醫(yī)學(xué)中的新興技術(shù)已顯示出其在以下方面的能力區(qū)別常規(guī)病理標(biāo)準(zhǔn)無法識別的疾病亞型(Sorlie et al.，2001)，以及鑒定癌癥進(jìn)程中涉及的特定遺傳事件(Srinivas et al.，2002)。同時(shí)，還需解決有關(guān)生物標(biāo)記在不同性別和人種間的效力問題，因此有必要對不同人群進(jìn)行大規(guī)模篩查。
乳腺癌的控制可通過使用新的標(biāo)記得以改進(jìn)。作為疾病的結(jié)果，通常該標(biāo)記僅在乳腺內(nèi)表達(dá)，但也在體內(nèi)其它部位發(fā)現(xiàn)。疾病活動(dòng)的預(yù)測因子，特別是能夠預(yù)測原位導(dǎo)管癌是否會發(fā)展成為擴(kuò)散性導(dǎo)管癌(invasive ductal carcinoma)的預(yù)測因子，在疾病控制上也具有重要的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種檢測患者患癌與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括如下步驟(i)從患者體內(nèi)分離生物樣本；(ii)檢測下述基因是否存在或表達(dá)，所述基因的特征在于被稱為SEQ ID No.1的核苷酸序列，其中，該基因是否存在或表達(dá)指示癌癥的存在與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，一種分離的多核苷酸包括本申請中被稱為SEQ ID No.1的核苷酸序列，或所述序列的互補(bǔ)序列，或在嚴(yán)格雜交條件下與所述序列(或其互補(bǔ)序列)雜交的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，一種分離的肽包括本申請中被稱為SEQID No.3的序列，或其至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，一種抗體對上述肽具有至少10-6M的親和力。
根據(jù)本發(fā)明的第五方面，一種與內(nèi)源性DD20基因雜交或抑制其表達(dá)的多核苷酸用于制備治療癌癥、特別是乳腺癌的藥物中。


本發(fā)明參照所附附圖進(jìn)行描述，其中圖1示出測定不同組織中所研究基因的存在與否的篩選分析結(jié)果，T表示腫瘤組織cDNA，M表示同一供體中共同切除的乳腺組織cDNA。
圖2示出為測定在不同組織樣本中所研究基因的表達(dá)所進(jìn)行的表達(dá)分析的結(jié)果。
圖3示出針對30個(gè)人組織cDNA樣本進(jìn)行的所研究基因半定量PCR表達(dá)分析的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的基礎(chǔ)是對癌癥患者，特別是乳腺癌、子宮癌或睪丸癌患者體內(nèi)表達(dá)的基因進(jìn)行鑒定。取自患者的樣本中該基因(或其表達(dá)產(chǎn)物)的鑒定指示患者體內(nèi)癌癥存在與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明還涉及用于檢測、診斷、監(jiān)測、預(yù)測、預(yù)防、成像、治療或確定癌癥誘因的試劑，如多肽序列。
實(shí)施診斷的方法可包括由待測樣本中的mRNA合成cDNA，擴(kuò)增對應(yīng)基因或其片段的cDNA的適當(dāng)部分，檢測指示該組織中疾病存在與否的產(chǎn)物，或檢測含有指示疾病存在與否的基因序列的mRNA的翻譯產(chǎn)物。
有用的試劑包括可用于下述診斷方法的多肽或其片段例如，對從活檢組織、血液或其它待測樣本中提取的mRNA進(jìn)行RT-PCR、PCR或雜交分析；或所述mRNA的翻譯產(chǎn)物蛋白；或針對這些蛋白的抗體?？紤]到機(jī)體中可能出現(xiàn)翻譯后修飾，包括與一些分子如輔助因子、抑制劑、激活劑以及形成亞基復(fù)合物的其它蛋白的相互作用，上述分析也包括檢測基因產(chǎn)物(蛋白)的方法。
與癌癥相關(guān)的基因的特征為如SEQ ID No.1所示的多核苷酸。推定編碼序列表示為SEQ ID No.2?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物在本申請中被稱為SEQ ID No.3。基因或其表達(dá)產(chǎn)物的鑒定可使用已知的多核苷酸或多肽檢測或表征技術(shù)進(jìn)行。例如，用與靶基因特異雜交的短寡核苷酸，可探查從患者體內(nèi)分離的遺傳物質(zhì)。該寡核苷酸探針可帶有可檢測的標(biāo)記物，例如螢光團(tuán)標(biāo)記，從而在與靶基因雜交后，所述探針能夠被檢測?；蛘?，也可使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增基因或其部分，然后再用標(biāo)記的寡核苷酸鑒別產(chǎn)物。
包括該基因或關(guān)聯(lián)蛋白或抗體的診斷分析包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)時(shí)PCR原位雜交DNA點(diǎn)印跡免疫組織化學(xué)核糖核酸酶保護(hù)分析cDNA陣列技術(shù)ELISA用于結(jié)合研究的承載于固體載體如玻璃或陶瓷上的蛋白、抗原或抗體陣列。
小干擾RNA功能分析。
上述所有技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，所述多核苷酸含有被稱為SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2的序列、或其互補(bǔ)序列，或其含有至少15個(gè)連續(xù)核苷酸、優(yōu)選30個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少50個(gè)核苷酸的片段。與上述多核苷酸雜交的多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。雜交通常在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。嚴(yán)格雜交條件為普通技術(shù)人員所熟知，選擇嚴(yán)格雜交條件是為了降低非互補(bǔ)雜交的可能。合適條件的實(shí)例公開于Nucleic AcidHydridisation.A Practical Approach(B.D.Hames and S.J.Higgins，IRL Press編輯，1985)中。更具體地，嚴(yán)格雜交條件包括在含下述組分的溶液中于42℃孵育過夜50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的、經(jīng)剪切的鮭精DNA，然后在約65℃下在0.1×SSC中洗滌。
基因鑒定也可開發(fā)以基因作為治療性分子的靶標(biāo)的治療方法。例如，現(xiàn)有很多已知分子已經(jīng)被開發(fā)用于基因治療，用以打靶特定基因或預(yù)防其表達(dá)。一種特殊的分子是小干擾RNA(siRNA)，它通過刺激靶mRNA的降解抑制特定靶蛋白的表達(dá)。已知能與所研究基因(或其調(diào)控元件)結(jié)合以修飾表達(dá)的其它合成寡核苷酸。還已證明與DNA聯(lián)合的肽核酸(PNA)(PNA-DNA嵌合體)顯示出較強(qiáng)的誘餌活性(decoyactivity)，從而能夠改變所研究基因的表達(dá)。這些分子可用于結(jié)合基因或其上游調(diào)控元件，阻止表達(dá)。
本發(fā)明也涉及分離的所研究基因的多肽產(chǎn)物。本發(fā)明中分離的多肽包括本申請中被稱為SEQ ID No.3的序列，或其至少10個(gè)連續(xù)氨基酸、優(yōu)選至少15個(gè)連續(xù)氨基酸、更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸的片段。多肽可用于產(chǎn)生抗體，或用于開發(fā)可與蛋白體內(nèi)結(jié)合以抑制其活性的蛋白結(jié)合分子。
本發(fā)明也包括針對本發(fā)明的肽的抗體。該抗體通常具有對所述肽至少10-6M、更優(yōu)選10-9M、最優(yōu)選至少10-11M的親和力?？贵w可以是任何合適的類型，包括單克隆型或多克隆型。測定待測樣本中肽抗原存在與否的分析試劑盒也包括于本發(fā)明中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該分析試劑盒包括裝有與抗原特異性結(jié)合的抗體的容器，其中，所述抗原具有由DD20基因編碼的至少一個(gè)抗原決定簇。這些試劑盒還可包括裝有用于收集待測樣本如血液、唾液、尿液和大便的工具的容器。這些工具包括用于收集和穩(wěn)定血液的刺血針(lancet)以及吸水紙或吸水布、用于收集和穩(wěn)定唾液的棉簽(swab)、用于收集和穩(wěn)定尿液及大便樣本的杯子?？贵w可結(jié)合到諸如玻璃或陶瓷表面的固相上。
也可檢測待測樣本中能夠與所述抗原特異結(jié)合的抗體，該待測樣本被懷疑含有上述抗體。該檢測方法包括使待測樣本與多肽接觸，其中該多肽含有所述基因的至少一個(gè)抗原決定簇。接觸在足以形成抗原/抗體復(fù)合物的條件下進(jìn)行一段時(shí)間。該方法還需要檢測含上述多肽的復(fù)合物。多肽復(fù)合物可重組制備、人工合成制備，或從天然來源中純化得到。
在本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立實(shí)施方案中，針對抗原的抗體或其片段可用于檢測患者體內(nèi)抗原的成像定位(image localization)，以達(dá)到檢測和診斷疾病或病癥的目的。這種抗體可為單克隆或多克隆抗體，或者可通過分子生物學(xué)技術(shù)制備，并可用多種可檢測試劑標(biāo)記，所述檢測試劑包括但不限于放射性同位素。
在另一實(shí)施方案中，抗體或其片段，不管是單克隆或多克隆抗體，還是通過分子生物學(xué)技術(shù)制備的，均可用作治療藥物，用于治療以本發(fā)明基因的表達(dá)為特征的疾病?？贵w可不經(jīng)衍生化而直接使用，也可用細(xì)胞毒性試劑如放射性同位素、酶、毒素、藥物、前體藥物等衍生化。
術(shù)語“抗體”泛指任何免疫結(jié)合試劑，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗體同樣指任何抗體類分子，這些分子具有抗原結(jié)合區(qū)并且包括但不限于抗體片段，如單域抗體(DABS)、Fv、scFv、適體等。制備和使用各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
如果需要，本發(fā)明的癌癥篩查方法可容易地與其它方法結(jié)合，以提供更為可靠的診斷或預(yù)測指標(biāo)，由此提供多標(biāo)記檢查。
以下實(shí)施例參照所附

本發(fā)明。
實(shí)施例使用非同位素差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(DDRT-PCR)，從乳腺癌患者臨床配對樣本的cDNA群中分離多個(gè)差異表達(dá)的基因片段。發(fā)現(xiàn)其中的一個(gè)片段(本申請中稱為DD20)在多個(gè)供體的乳腺癌組織樣本中顯著上調(diào)。該新分子標(biāo)記的表達(dá)概況、全長以及相應(yīng)的推測蛋白序列在本申請中詳細(xì)描述。
材料與方法將來自于同一供體的正常乳房組織與腫瘤組織配對樣本(matchedpairs)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析。組織樣本在得到倫理完全許可和患者同意后，從英國諾丁漢Medical Solutions plc獲得。外科手術(shù)切除腫瘤后，收集一個(gè)腫瘤組織樣本，以及一個(gè)一起切除的相鄰正常組織樣本。分別使用Dynal dT18-標(biāo)記的Dynabeads和Superscript II反轉(zhuǎn)錄方案，提取信使RNA，隨后合成cDNA。采用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(DDRT-PCR)觀察該配對樣本基因表達(dá)概況的差異，分離顯示上調(diào)或下調(diào)的單個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本，并進(jìn)行進(jìn)一步研究。
Liang & Pardee(1992)首次報(bào)道差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(DDRT-PCR)使用兩個(gè)或更多個(gè)生物樣本的mRNA作為模板，用三個(gè)可能的錨定引物中的其中一個(gè)，通過反轉(zhuǎn)錄合成代表性cDNA。使用與80個(gè)13聚體隨機(jī)引物偶聯(lián)的各自的錨定引物，分別用PCR擴(kuò)增3個(gè)亞群。據(jù)估計(jì)，此數(shù)量的引物組合有助于mRNA群中96％的已表達(dá)基因的表現(xiàn)(Sturtevant，2000)。該群的細(xì)分導(dǎo)致在每組引物的第二條cDNA鏈合成結(jié)束時(shí)，所估計(jì)的12,000到15,000個(gè)真核細(xì)胞中表達(dá)的mRNA減少到100-150個(gè)轉(zhuǎn)錄本。這有助于配對引物組在聚丙烯酰胺凝膠上的平行電泳分離和準(zhǔn)確顯示，從而可鑒定只在一個(gè)組織樣本中表達(dá)的基因片段。
在將所研究片段剪切和再擴(kuò)增后，通過反向DNA點(diǎn)印跡除去假陽性。這需要將每個(gè)再擴(kuò)增片段點(diǎn)樣到雙層尼龍膜(Hybond N+，Amersham Pharmacia Biotech)上，并使其與片段供體的腫瘤或正常組織cDNA群雜交。然后，對這些被確定為差異表達(dá)的片段進(jìn)行直接測序，即不經(jīng)克隆而測序，隨后進(jìn)行基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫查詢，以確定是否每個(gè)基因都是新的。與已知基因不匹配的片段被認(rèn)為可能是片段來源乳腺癌的新標(biāo)記。通過半定量RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR，用多個(gè)乳腺癌供體的一組配對cDNA群，對每種轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行進(jìn)一步篩檢。在所有情況下，均使用β-肌動(dòng)蛋白作為校正cDNA模板的組成性對照基因，并在PCR過程中將其作為陽性內(nèi)對照。使用校正模板上的基因特異性引物組，表達(dá)每種新的推定標(biāo)記基因。然后使用5’-RACE法(cDNA末端快速擴(kuò)增法)，合成含開放閱讀框的新的基因片段的全長轉(zhuǎn)錄本，該方法將基因特異性的延伸與擴(kuò)增相結(jié)合，這一點(diǎn)可以通過測序證明。
使用針對cDNA群的每種新標(biāo)記基因特異性引物測定組織特異性，該cDNA群來自非乳腺組織，包括大腦、心臟、淋巴細(xì)胞、脾臟、腎臟、睪丸和肌肉(從Origene獲得)。使用來源于更全的22種人組織的一組人組織的cDNA群，進(jìn)一步檢測DD20分子標(biāo)記。這些組織如下腎上腺收集自62個(gè)供體骨髓 收集自7個(gè)供體大腦、小腦收集自24個(gè)供體全腦 收集自1個(gè)供體結(jié)腸*收集自1個(gè)供體胎兒大腦 收集自59個(gè)供體胎兒肝臟 收集自63個(gè)供體心臟 收集自1個(gè)供體腎臟 收集自1個(gè)供體肝臟 收集自1個(gè)供體肺收集自1個(gè)供體胎盤 收集自7個(gè)供體前列腺收集自47個(gè)供體唾腺 收集自24個(gè)供體骨骼肌收集自2個(gè)供體小腸*收集自1個(gè)供體脾臟 收集自14個(gè)供體睪丸 收集自19個(gè)供體胸腺 收集自9個(gè)供體甲狀腺收集自65個(gè)供體氣管 收集自1個(gè)供體子宮 收集自10個(gè)供體需要注意的是這些樣本中大部分是人總RNA系列II(Clontech)中的一部分，而星號標(biāo)記的兩個(gè)樣本是從英國諾丁漢Medical Solutionsplc的組織塊中獲得，并在Randox Laboratories Ltd進(jìn)行了處理。
另外，分析是使用倫理允許范圍內(nèi)的人腫瘤樣本(從MedicalSolutiosn plc.獲得)進(jìn)行的。采用實(shí)時(shí)PCR，針對β-肌動(dòng)蛋白和DD20，對卵巢、睪丸、胃、肝臟、肺、膀胱、結(jié)腸和胰腺腫瘤的代表性cDNA進(jìn)行了檢查。
在進(jìn)行新標(biāo)記表達(dá)分析的同時(shí)，還對每對配對乳腺組織進(jìn)行了分子標(biāo)簽分析。這需要使用針對每種組織cDNA的、在半定量RT-PCR中對多種已公開的乳腺癌分子標(biāo)記具有特異性的引物。確定了每種樣本每種分子標(biāo)記之間的關(guān)系，并將其列表，作為對照使用，新標(biāo)記可與此進(jìn)行比較。這是為了細(xì)分腫瘤類型，使新標(biāo)記與這些亞型相關(guān)聯(lián)，同時(shí)也可以顯著提高診斷標(biāo)記的功用。
結(jié)果和討論使用差異顯示法發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的正常組織cDNA相比，來源于乳腺癌供體配對組織cDNA群的稱為DD20的基因片段在腫瘤cDNA群中顯著上調(diào)。該由187個(gè)核苷酸組成的產(chǎn)物通過反向DNA點(diǎn)印跡被確定為差異表達(dá)。進(jìn)行序列分析，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫查詢，確定DD20與EMBL和SWISSPROT數(shù)據(jù)庫中的已知基因或蛋白不是同源的，因此DD20被認(rèn)為可能是新的。但是，在去除多腺苷酸尾巴(poly-A tail)后，DD20與人基因組的染色體11的克隆是100％同源的。
使用基因特異性引物，通過針對原始供體配對組織樣本的半定量PCR，確認(rèn)了該片段的腫瘤特異性。這些數(shù)據(jù)表明DD20是乳腺癌存在的推定標(biāo)記(圖1)。
為簡化進(jìn)一步的分析，使用5′-RACE法延伸片段，以使其包含該基因的全部開放閱讀框(ORF)，以及所有的5′非編碼序列。使用該技術(shù)，衍生出由427個(gè)核苷酸組成的推測的全長產(chǎn)物(SEQ ID No.1)，隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫查詢，證實(shí)了先前認(rèn)為的與人染色體11的同源性，在全長序列(427/427)上是100％同源的。從該序列中形成全部6個(gè)氨基酸閱讀框，并在+3框中發(fā)現(xiàn)一個(gè)推定的小ORF，該小ORF含67個(gè)氨基酸，包括終止密碼子(SEQ ID No.3)。該小蛋白未表現(xiàn)出對SWALL數(shù)據(jù)庫中任何已知蛋白的高度同源性，因此推測是新的。最初認(rèn)為它可能是一種小的細(xì)胞因子，因?yàn)樗c小鼠和人的小的誘導(dǎo)型細(xì)胞因子A22前體都具有適度的同源性，并與SWISSPROT數(shù)據(jù)庫中的其它細(xì)胞因子大小相近。但DD20只有一個(gè)二硫鍵(由半胱氨酸殘基表明)；而所有的細(xì)胞因子均包含兩個(gè)二硫鍵。另外，此單個(gè)二硫鍵并不與細(xì)胞因子中的任何二硫鍵相符。
使用半定量PCR分析和實(shí)時(shí)PCR分析，對來自由其它患者供給的多個(gè)配對乳腺癌組織的cDNA群進(jìn)行進(jìn)一步DD20篩查。6對配對cDNA群進(jìn)行常規(guī)半定量PCR分析，最初為40個(gè)循環(huán)，由于所檢測DD20的水平低，又改用45個(gè)循環(huán)(圖2)。用β-肌動(dòng)蛋白進(jìn)行模板校正，并作為PCR的陽性對照。在多個(gè)樣本中觀察到腫瘤樣本中的表達(dá)與其正常樣本相比顯著提高。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)DD20是乳腺癌存在的推定分子標(biāo)記。
該分析被所有現(xiàn)有的配對乳腺組織樣本的分子標(biāo)簽分析所證實(shí)，如下所示在腫瘤組織中表達(dá)提高1052.6％在正常組織中表達(dá)提高3 15.8％沒有顯著差異4 21.1％沒有明顯表達(dá)2 10.5％總計(jì)19100％為測定器官特異性，采用常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)PCR，針對DD20引物，檢查了22種非乳腺組織的人組織cDNA群。另外，以同樣方式分析了8種腫瘤組織樣本中DD20的表達(dá)。亦使用組成型管家基因β-肌動(dòng)蛋白的引物作為陽性對照檢查了相同樣本，以校正用于半定量PCR分析的模板。β-肌動(dòng)蛋白產(chǎn)物在所有所研究的cDNA群中被強(qiáng)烈擴(kuò)增，確認(rèn)該表達(dá)可被推測為半定量的。常規(guī)PCR的結(jié)果示于圖3中。在30種組織樣本中，DD20似乎有選擇地表達(dá)。在大多數(shù)情況下，該推定標(biāo)記的強(qiáng)烈表達(dá)局限在受到生殖激素影響的組織中，例如卵巢、睪丸、子宮和胎盤。在其它器官如骨髓、脾臟、胸腺和甲狀腺中也發(fā)現(xiàn)較弱表達(dá)。在腫瘤組織中，僅在卵巢和睪丸中明顯表達(dá)強(qiáng)烈，而在胰腺瘤中表達(dá)較弱。
該分子標(biāo)記雖然不是乳腺特異性或腫瘤特異性的，但在多種乳腺癌中的表達(dá)仍顯著提高，可能與特異性亞群或腫瘤所處時(shí)期有關(guān)。因此，該分子標(biāo)記在乳腺癌類型的細(xì)分上可能是有用的。比較組織樣本中DD20和分子標(biāo)簽的的表達(dá)概況，可揭示該標(biāo)記和其它已發(fā)表的與疾病的分類和預(yù)后相關(guān)聯(lián)的乳腺癌標(biāo)記之間的聯(lián)系。
作為參照，值得指出的是，DD20大大優(yōu)于一些最受推崇的“標(biāo)準(zhǔn)”乳腺癌標(biāo)記，如雌激素受體(ERα)和人上皮生長因子受體(c-ErbB-2)。這在所有配對乳腺癌組織樣本的分子標(biāo)簽分析中都顯而易見，其中很多情況下，同一患者的兩個(gè)樣本使用針對人正常組織和腫瘤組織的30個(gè)cDNA群的靶特異性引物所致的表達(dá)相似。
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1.一種檢測患者體內(nèi)癌癥存在與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法包括如下步驟(i)分離患者的生物樣本；(ii)檢測其特征為稱為SEQ ID No.1的核苷酸序列的基因是否存在或表達(dá)；其中，所述基因的存在或表達(dá)指示癌癥存在與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，所述基因是被稱為SEQ ID No.2的基因。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述樣本從乳腺組織、子宮、睪丸或卵巢中獲得。
4.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述癌癥為乳腺癌。
5.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中，所述檢測使用聚合酶通過擴(kuò)增基因?qū)嵤?br> 6.一種分離的多核苷酸，它含有被稱為SEQ ID No.1的核苷酸序列、或其互補(bǔ)序列、或在嚴(yán)格雜交條件下與所述序列(或其互補(bǔ)序列)雜交的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
7.權(quán)利要求6的分離的多核苷酸，其中，所述序列是被稱為SEQ IDNo.2的序列。
8.權(quán)利要求6的多核苷酸在離體診斷分析中檢查患者患癌風(fēng)險(xiǎn)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8的應(yīng)用，其中，所述癌癥是乳腺癌。
10.一種肽，它含有被稱為SEQ ID No.3的序列，或其至少10個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的片段。
11.一種抗體，它對權(quán)利要求10的肽具有至少10-6M的親和力。
12.一種與內(nèi)源性基因雜交或抑制其表達(dá)的第二多核苷酸在制備治療癌癥、特別是乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，所述第二多核苷酸包含權(quán)利要求6或7的多核苷酸。
全文摘要
公開了一種可用于預(yù)測癌癥、特別是乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)的診斷方法。本方法包括(i)分離患者的生物樣本；(ii)檢測本申請中被稱為SEQID No.1的序列中所含基因的存在或表達(dá)，其中，該基因的存在或表達(dá)指示癌癥的存在與否或患癌風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK1878876SQ200480033043
公開日2006年12月13日 申請日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者M·A·克羅克德, J·R·貝利, J·V·拉蒙特, S·P·菲茨杰拉德 申請人:蘭多克斯實(shí)驗(yàn)室有限公司