專利名稱：不依賴飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種不依賴飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基(LD1細(xì)胞培養(yǎng)基)，具體涉及在普通人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入了一些支持人胚干細(xì)胞自我更新的因子，并且不依賴鼠胚成纖維細(xì)胞或其他任何細(xì)胞的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
1998年美國威斯康星大學(xué)Thomson教授首次成功地將早期人胚胎(受精后5-7天的囊胚)中最原始未分化的內(nèi)細(xì)胞群(Inner Cell Mass，ICM)分離出來、接種到呈單層培養(yǎng)的鼠胚成纖維細(xì)胞上(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，持續(xù)體外培養(yǎng)、傳代，且保持其未分化的狀態(tài)，并稱之為人體胚胎干細(xì)胞(以下簡稱為人胚干細(xì)胞或hES細(xì)胞)(Thomson JA，Itskovitz-E1dor J，Shapiro SS，Waknitz MA，Swiergiel JJ，MarshallVS，Jones JM.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science.1998 Nov 6；282(5391)1145-7.)。根據(jù)胚胎學(xué)研究，人體所有的組織、器官都是由這些ICM分化形成的，ICM被認(rèn)為具有全能性(Totipotency)。因此，hES細(xì)胞很可能帶來21世紀(jì)醫(yī)學(xué)革命。
hES細(xì)胞研究的目的最終是用于臨床治療患者，但目前國際上現(xiàn)有的hES細(xì)胞系，在分離和培養(yǎng)的過程中，均需要鼠胚成纖維細(xì)胞作為支持細(xì)胞，因而可能含有動物的某種未知的有害成分，如動物病毒等。這樣的hES細(xì)胞顯然不適于臨床應(yīng)用，因?yàn)閷⑷绱伺囵B(yǎng)的hES細(xì)胞移植到患者體內(nèi)，就有可能把某種未知的動物病毒或其它有害物質(zhì)帶給人類。
此外，鼠胚成纖維細(xì)胞(MEFs)的制備不僅耗時、成本高、且受到多個環(huán)節(jié)不穩(wěn)定因素的影響，含有MEFs成分的hES細(xì)胞培養(yǎng)基成分均不恒定。這給hES細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究帶來很多困難與不便，例如重復(fù)性不好等。
因此，建立不依賴鼠胚成纖維細(xì)胞的hES細(xì)胞系是本領(lǐng)域需解決的重大課題。
為解決此問題，研究人員們試圖避免將hES細(xì)胞接種到鼠胚成纖維細(xì)胞上的方法進(jìn)行培養(yǎng)，如2001年Xu等人用條件培養(yǎng)基(即在MEFs上過夜而獲取了其有效因子的普通hES培養(yǎng)基)，培養(yǎng)接種在Matrigel上的hES細(xì)胞，獲得成功(Xu C，Inokuma MS，Denham J，Golds K，Kundu P，Gold JD，Carpenter MK.Feeder-free growth of undifferentiatedhuman embryonic stem cells.Nat Biotechnol.2001 Oct；19(10)971-4.)。這樣，實(shí)際上是將hES細(xì)胞與MEFs的關(guān)系由直接接觸變?yōu)殚g接接觸，并未真正完全擺脫對MEFs的依賴。
根據(jù)研究，MEFs不僅有助于hES細(xì)胞貼壁生長，更重要的是MEFs含有某種(些)未知的物質(zhì)，支持了hES細(xì)胞的自我更新。人們推測，鼠胚成纖維細(xì)胞中可能分泌了某種(些)營養(yǎng)因子或代謝產(chǎn)物而使hES細(xì)胞系進(jìn)行自我更新。從理論上說，如果能搞清楚這些營養(yǎng)因子是什么物質(zhì)，或者找到具有同等生物效應(yīng)的營養(yǎng)因子，把它(們)添加到普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基中，hES細(xì)胞的培養(yǎng)就能徹底擺脫對MEFs的依賴。但目前未見到此類工作成功的有關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是找到不依賴鼠胚成纖維細(xì)胞(MEFs)，也不添加任何其他飼養(yǎng)細(xì)胞成分，并能維持人胚干細(xì)胞(hES)細(xì)胞進(jìn)行自我更新的物質(zhì)；本發(fā)明的另一目的是提供一種新型的不依賴鼠胚成纖維細(xì)胞或其他任何細(xì)胞成分的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一些支持hES細(xì)胞生長作用的生長因子，將這些因子按照一定的濃度添加到普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基中后，可使其直接用于培養(yǎng)人胚干細(xì)胞，而不再需要補(bǔ)充來自鼠胚成纖維細(xì)胞或其他任何細(xì)胞的任何成份。
用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的生長因子配制的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，不依賴鼠胚成纖維細(xì)胞或其他任何細(xì)胞，達(dá)到了本發(fā)明目的。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的支持hES細(xì)胞生長的因子是bFGF(纖維生長因子2)和Noggin(如可用Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera等)。
本發(fā)明提供的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基(LD-1細(xì)胞培養(yǎng)基)是在普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基中加入超常濃度的bFGF和Noggin。
在本發(fā)明提供的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中，bFGF和Noggin的使用濃度是很重要的。本發(fā)明人經(jīng)過多次探索，才找到了合適的bFGF和Noggin使用濃度，即bFGF4-50ng/ml培養(yǎng)基，Noggin100-1000ng/ml培養(yǎng)基；濃度過小則作用不佳，濃度過大則成本太昂貴。
更為優(yōu)選的濃度是，bFGF10-40ng/ml培養(yǎng)基，Noggin250-500ng/ml培養(yǎng)基。
所述普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的各種hES細(xì)胞培養(yǎng)基，比如，可用如實(shí)施例中的配方一的普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基。
實(shí)驗(yàn)證明，在普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基里同時加入bFGF(10-40ng/ml)和Noggin(250-500ng/ml)，hES細(xì)胞不僅能正常生長，還能多次傳代，并保持其未分化狀態(tài)及分化為內(nèi)、中、外三個胚層細(xì)胞的潛能。
在本發(fā)明上述提供的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中，還可加入Bovine Fibronectin(一種纖連蛋白，簡稱Fibronectin)。實(shí)驗(yàn)證明，可增加hES細(xì)胞的克隆率，并加快其生長速度。
Fibronectin的用量可以是0.5-50μg/ml)，優(yōu)選用量是0.5-5μg/ml。
或者，在本發(fā)明上述加入bFGF和Noggin的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中，加入肝素(Heparin)。實(shí)驗(yàn)證明，可減少價格較貴的bFGF的用量，至少將bFGF用量減半。這樣可以降低成本。
肝素的用量可以是5-50μg/ml)，優(yōu)選用量是10-30μg/ml。
也可以在本發(fā)明上述提供的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中同時加入Fibronectin和Heparin。
本發(fā)明以上所述的bFGF、Noggin、Fibronectin和Heparin四種物質(zhì)，均可通過市售等方式購到。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用試劑與實(shí)驗(yàn)材料如下所述1、細(xì)胞a)hES細(xì)胞(Hl)由美國威斯康星大學(xué)WiCell研究所提供；b)照射處理后的MEFs(鼠胚成纖維細(xì)胞)由北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的ICR孕鼠體內(nèi)的鼠胚制備而成；(方法參見Thomson JA，Itskovit(z-Eldor J，ShapiroSS，Waknitz MA，Swiergiel JJ，Marshall VS，Jones JM.Embryonic stem celllines derived from human blastocysts.Science. 1998 Nov6；282(5391)1145-7.)2、細(xì)胞培養(yǎng)基a)普通hES細(xì)胞基配方一D-MEM/F12 (Invitrogen，#11330-032)200mlKnockOutTM Serum Replacement (Invitrogen，#10828-028) 50ml
NEAA(非必需氨基酸，Invitrogen，#11140-050) 2.5ml谷氨酰胺/巰基乙醇溶液(見配方三) 1.25mlbFGF溶液(見配方四) 0.5mlb)鼠胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基配方二D-MEM(Invitrogen，#11965-092)225mlFBS (Fetal Bovine Serum，Invitrogen，#16000-044)25mlNEAA(非必需氨基酸，Invitrogen，#11140-050) 2.5ml200mM谷氨酰胺+巰基乙醇溶液*1.25ml配方三200mM L-Glutamine (Invitrogen，#21030-081) 10ml2-Mercaptoethanol(Sigma，M-7522) 7μl配方四rh bFGF(BD，#354060) 10μg0.1％BSA in PBS 5ml3、生長因子a) bFGF(BD，#354060)b) Noggin (R&D，719-NG-050)c) Recombinant Mouse Wnt3a(R&D 1324-WN-002)d) Fibronectin (BD，#356008)4、PBS(Phosphate Buffered Saline，Invitrogen，#14190-250)5、0.2％Dispase in D-MEM/F12配方五Dispase(Invitrogen，#17105-041) 100μgD-MEM/F12(Invitrogen，#11330-032) 50ml6、Matrigel(BD，#354234)7、抗體a)Oct-4(Chemicon MAB4305，mouse IgG1)
b)SSEA-4(Chemicon MAB4304，mouse IgG3)c)TRA-1-60(Chemicon MAB4360，mouse IgM)d)TRA-1-81(Chemicon MAB4381，mouse IgM)e)Goat anti-mouse IgM-FITC(Santa Cruz sc-2082)f)Goat anti-mouse IgG-FITC(Santa Cruz)8、材料a)4孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUNC，#176740)b)75cm2斜口培養(yǎng)瓶(NUNC，#156472)9、儀器設(shè)備a)生物安全柜b)二氧化碳培養(yǎng)箱c)離心機(jī)d)流式細(xì)胞儀e)顯微鏡實(shí)施例1 細(xì)胞培養(yǎng)一、目的將LD-1直接用于hES細(xì)胞培養(yǎng)，觀察其生長情況及形態(tài)學(xué)變化，并同時設(shè)立陽性對照組及陰性對照組，進(jìn)行同步比較。
二、分組與方法將用條件培養(yǎng)基在Matrigel上培養(yǎng)的26代hES細(xì)胞(H1)接種到用Matrigel包被的4孔板內(nèi)，并分為三組第一組用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)(陽性對照)；第二組用LD-1培養(yǎng)基培養(yǎng)(即普通培養(yǎng)基+40ng/ml Human FGF basic+500ng/ml Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera)；第三組用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)(陰性對照)。
按0.5ml培養(yǎng)基/孔，每天更換培養(yǎng)基一次，5-7天傳一次代，共傳代6次。
三、結(jié)果第一組和第二組細(xì)胞至第六代時，生長情況仍然良好，均無明顯分化現(xiàn)象；第三組細(xì)胞在第一代第5天時即已有明顯分化現(xiàn)象，傳至第二代時，細(xì)胞貼壁減少，生長緩慢，分化更加明顯，已不能再傳代。
四、結(jié)論用LD-1培養(yǎng)的hES細(xì)胞與用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的hES細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無明顯差異。
實(shí)施例2 免疫組化學(xué)檢測一、目的用免疫組化學(xué)方法，檢測經(jīng)LD-1培養(yǎng)6代后細(xì)胞的一些人胚干細(xì)胞的特征。
二、方法1.細(xì)胞將LD-1培養(yǎng)并經(jīng)多次傳代的hES細(xì)胞種植到4孔板的4個孔內(nèi)，同時將條件培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的hES細(xì)胞分別種植另外兩個4孔板的4個孔內(nèi)；2.固定細(xì)胞將上述細(xì)胞培養(yǎng)至第4天，吸除培養(yǎng)液，加入4％副甲醛，室溫下放置10分鐘，即可將細(xì)胞固定；3.細(xì)胞分組將前述固定細(xì)胞分為4組，每組均分別含有LD-1、條件培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的hES細(xì)胞各1孔。
4.第一抗體a)Oct-4(Chemicon MAB4305，mouse IgG1)，b)SSEA-4(Chemicon MAB4304，mouse IgG3)，c)TRA-1-60(Chemicon MAB4360，mouse IgM)，d)TRA-1-81(ChemiconMAB4381，mouse IgM)5.第二抗體a)Goat anti-mouse IgM-FITC(Santa Cruz sc-2082)，b)Goat anti-mouseIgG-FITC(Santa Cruz)三、結(jié)果

注+++強(qiáng)陽性；-/+陰性或弱陽性。
四、結(jié)論LD-1培養(yǎng)液培養(yǎng)的hES細(xì)胞(第二組)與條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的hES細(xì)胞(第一組)在該上述三種抗體的免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)中無明顯差異。
實(shí)施例3 定量分析一、目的使用流式細(xì)胞儀，對LD-1培養(yǎng)6代后的hES細(xì)胞進(jìn)行定量分析。
二、材料 來自第一、二、三組的hES細(xì)胞，抗Oct4等三、方法 用trypsin/EDTA消化后以PBS(含10％山羊血清)4℃重懸15min。加入抗Oct4單抗后4℃孵育30min，再加入FITC熒光素標(biāo)記的二抗。上流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特Epics XL)檢測，數(shù)據(jù)通過庫爾特SYSTEMII軟件分析。
四、結(jié)果 第一、二組hES細(xì)胞Oct4陽性率均達(dá)85％以上；第三組hES細(xì)胞Oct4陽性率則低于20％五、結(jié)論 第一、二組的hES細(xì)胞均能基本上維持其未分化狀態(tài)。
實(shí)施例4 分化實(shí)驗(yàn)一、目的將LD-1培養(yǎng)6代后hES細(xì)胞分別分化為胚內(nèi)層、中胚層和外胚層組織細(xì)胞，從而證明經(jīng)LD-1培養(yǎng)后的hES細(xì)胞仍具有正常的分化潛能。
二、材料1)抗外胚層抗體NFH(neurofilament heavy chain)、Keratin15；2)抗中胚層抗體T gene、beta-globin；3)抗內(nèi)胚層抗體AFP(a-fetoprotein)、amylase三、方法 用dispase消化從Matrigel膠上挑取未分化hES細(xì)胞集落，重新接種到fibronectin包被的培養(yǎng)皿中。以不同培養(yǎng)液(以DMEM/F12 20％胎牛血清，1mM谷氨酰胺，1％非必須氨基酸0.1mMβ-巰基乙醇為基礎(chǔ))培養(yǎng)12～14days促使其分化。
四、結(jié)果 上述三個胚層的抗體免疫熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)均有陽性反應(yīng)。
五、結(jié)論 LD-1培養(yǎng)液培養(yǎng)的hES細(xì)胞保留了其分化潛能的全能性。
實(shí)施例5 核型分析一、目的排除LD-1誘導(dǎo)hES細(xì)胞癌變的可能性。
二、方法 hES細(xì)胞以0.1ug/ml Colcemid (KaryoMax Colcemid solution，GIBCO)處理2～3小時。再用胰酶消化至單一化后重懸于0.075M KCl溶液中，在37℃下靜置20分鐘，再用甲醛和乙酸(3∶1)固定，然后用標(biāo)準(zhǔn)的G-banding法進(jìn)行核型分析。
三、結(jié)果 所檢測細(xì)胞的細(xì)胞核型均為22xy。
四、結(jié)論 所檢測的hES細(xì)胞均為正常的未癌變的人體細(xì)胞。
實(shí)施例6 LD-1培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)一、目的尋找LD-1中bFGF和Noggin的最小有效濃度，以降低成本。
二、方法 分別將LD-1中bFGF和Noggin的濃度設(shè)定為4、8、10、20、40ng/ml和100、250、500、1000ng/ml后，觀察細(xì)胞的生長情況。
三、結(jié)果 含有40ng/ml的bFGF和500ng/ml的Noggin的LD-1培養(yǎng)基里細(xì)胞生長情況最為滿意。
四、結(jié)論 LD-1培養(yǎng)基中bFGF和Noggin的濃度應(yīng)分別為40ng/ml和500ng/ml。
權(quán)利要求
1.人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，特征是在普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基中加入4-50ng/ml bFGF和100-1000ng/ml Noggin。
2.權(quán)利要求1所述的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，特征是在普通hES細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10-40ng/ml bFGF和250-500ng/ml Noggin。
3.權(quán)利要求1或2所述的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括有0.5-50μg/ml BovineFibronectin
4.權(quán)利要求1或2所述的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括有5-50μg/ml肝素。
5.權(quán)利要求1或2所述的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，還包括有0.5-50μg/ml BovineFibronectin和10-30μg/ml Heparin。
6.權(quán)利要求3所述的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中Fibronectin用量是0.5-5μg/ml。
7.權(quán)利要求4所述的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基，其中肝素用量是10-30μg/ml。
8.用bFGF和Noggin、Fibronectin配制支持人胚干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基的用途。
9.用bFGF、Noggin、Fibronectin和肝素配制支持人胚干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基的用途。
10.用bFGF、Noggin，以及Fibronectin或肝素配制支持人胚干細(xì)胞生長的培養(yǎng)基的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種不依賴飼養(yǎng)細(xì)胞的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基(LD－1細(xì)胞培養(yǎng)基)，具體涉及在普通人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中加入了支持人胚干細(xì)胞自我更新的一些生長因子，并且不依賴鼠胚成纖維細(xì)胞或其他任何細(xì)胞的人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基。所述生長因子是纖維生長因子2(bFGF)、Noggin等。將這些因子添加到普通人胚干細(xì)胞培養(yǎng)基中后，可使其直接用于培養(yǎng)人胚干細(xì)胞，而不再需要補(bǔ)充來自鼠胚成纖維細(xì)胞或其他任何細(xì)胞的任何成份。
文檔編號C12N5/08GK1657610SQ20051001132
公開日2005年8月24日 申請日期2005年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月7日
發(fā)明者李東升, 鄧宏魁 申請人:十堰市太和醫(yī)院, 北京大學(xué)