專利名稱：能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒及其制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其對人類健康的危害是不言而喻的，全世界的科學(xué)家和各國政府都投入了巨大的人力、物力進(jìn)行了長達(dá)數(shù)十年的研究，盡管也獲得了一些頗具價(jià)值的研究成果，但可以說，迄今為止，仍然沒有取得突破性進(jìn)展。手術(shù)切除、放療和化療仍然是腫瘤治療的“三大法寶”。曾經(jīng)認(rèn)為免疫治療是第四大法寶，但包括免疫調(diào)節(jié)、腫瘤特異性單克隆抗體、LAK細(xì)胞在內(nèi)的免疫學(xué)干預(yù)手段也沒有取得預(yù)期的效果。
近年來，隨著人們對腫瘤生物學(xué)和腫瘤發(fā)生學(xué)的認(rèn)識逐漸深化，腫瘤細(xì)胞的一些生物學(xué)特性引起了普遍的關(guān)注。眾所周知，正常細(xì)胞在體內(nèi)的增殖受到許多因素的制約，包括免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，尤其是細(xì)胞自身的凋亡(凋亡是細(xì)胞自然死亡的過程，也有人形象地稱為細(xì)胞的自殺)限制了細(xì)胞在體內(nèi)的無限擴(kuò)增。單腫瘤細(xì)胞能夠在體內(nèi)無限增殖，它似乎具有某種拮抗機(jī)制，或某種逃避機(jī)制，可以無視這些制約機(jī)制。盡管我們對這些逃避機(jī)制尚不完全清楚，但利用這些制約機(jī)制治療腫瘤確是一種有效的手段。目前腫瘤的基因治療研究頗多，其基本原理就是導(dǎo)入制約機(jī)制。
20世紀(jì)70年代，隨著基因操作即DNA重組技術(shù)的成熟，誕生了基因工程。這是當(dāng)時(shí)分子生物學(xué)發(fā)展的必然結(jié)果?；蚬こ淌菍⒒蜓b配于特定的具有表達(dá)必備元件的載體中，在體外通過細(xì)胞如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增并表達(dá)其蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
通過對蛋白質(zhì)產(chǎn)物分離與純化，最終獲得某一種基因所編碼的蛋白質(zhì)純品。這是生物高技術(shù)在20世紀(jì)的重大突破，創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。在此基礎(chǔ)上，將基因直接導(dǎo)入人體的基因治療也應(yīng)運(yùn)而生。自Fench Anderson于1989年進(jìn)行了基因標(biāo)記物在人體內(nèi)試驗(yàn)的準(zhǔn)備后，于1990年9月進(jìn)行了第一例應(yīng)用腺苷脫氨酶基因(ADA)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入人自身T淋巴細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)增后輸回患兒體內(nèi)，獲得了成功?；純?年后體內(nèi)10％造血細(xì)胞ADA基因陽性，除了還需應(yīng)用部分劑量的ADA蛋白外，其他體征正常。這一成功標(biāo)志著基因治療的時(shí)代已經(jīng)開始。
基因治療為什么具有誘人的前景？它和基因工程有何異同？1.基因工程是將具有應(yīng)用價(jià)值的基因，即“目的基因”，裝配在具有表達(dá)所需元件的特定載體中，導(dǎo)入相應(yīng)的宿主細(xì)胞，如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)分離、純化后，獲得其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物?；蛑委熓菍⒕哂兄委焹r(jià)值的基因，即“治療基因”，裝配于能在人體細(xì)胞中表達(dá)所必備元件的載體中，導(dǎo)入人體細(xì)胞，直接進(jìn)行表達(dá)。它不需對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，因?yàn)槿梭w細(xì)胞可以完成這一過程。
正由于以上原因，在基因工程中耗資最大的一部分器材與材料及其費(fèi)用，在基因治療中可以省卻，從而使今后工業(yè)化的成本明顯降低。
2.基因工程的“目的基因”產(chǎn)物迄今為止限于可分泌的蛋白，如生長因子、多肽了激素、細(xì)胞因子、可溶性受體等。對于非分泌性蛋白，如受體、細(xì)胞內(nèi)酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、原癌基因及抑癌因子等，由于不能有效的進(jìn)入細(xì)胞而不能應(yīng)用于基因工程。但基因治療不受以上限制。幾乎所有的細(xì)胞基因，只有它具有治療作用，理論上均可應(yīng)用基因治療。因此，基因治療具有更巨大的潛力。
3.隨著蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究，今后對非分泌性蛋白，通過加上某些肽段或進(jìn)行某些加工，使其同樣能進(jìn)入細(xì)胞。
基因治療的途徑包括下列幾種1.ex vivo指將含外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞(或異種細(xì)胞)，這種細(xì)胞可被稱為“基因工程化的細(xì)胞”，經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人體。這種方法易于操作，由于細(xì)胞在擴(kuò)增過程中，對外源的添加物質(zhì)經(jīng)大量稀釋并易于清除；同時(shí)，人體細(xì)胞，尤其是自體細(xì)胞，加工后應(yīng)用于人體自身，一般來說，易于解決安全性問題。但是，這種方法，在工業(yè)化方面，除載體系統(tǒng)外不易形成規(guī)模，而且必須有固定的臨床基地。
2.in vivo指將外源基因裝配于特定的真核細(xì)胞表達(dá)載體，直接導(dǎo)入體內(nèi)。這種載體可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸DNA。這種方式的導(dǎo)入，無疑有利于大規(guī)模工藝化生產(chǎn)。這種方式導(dǎo)入的治療基因以及其載體必須證明其安全型，而且導(dǎo)入體內(nèi)之后必須能進(jìn)入靶細(xì)胞，有效地表達(dá)并達(dá)到治療目的。本發(fā)明專利技術(shù)符合上述標(biāo)準(zhǔn)。
從20世紀(jì)80年代到世紀(jì)末，基因治療大體經(jīng)歷了三個(gè)階段1.準(zhǔn)備期(1980～1989)自1980年至1989年，這是基因治療的“禁錮時(shí)代”。20世紀(jì)80年代初，從學(xué)術(shù)界到宗教、倫理、法律各界，對基因治療能否進(jìn)入臨床，存在很大爭議。直到1989年，F(xiàn)DA才同意基因治療先將載體導(dǎo)入作為“基因標(biāo)記”的臨床試驗(yàn)，1990年才批準(zhǔn)正式臨床試驗(yàn)。這個(gè)階段中，科學(xué)家們在臨床前研究進(jìn)行了大量工作，同時(shí)也在輿論上做了很多準(zhǔn)備。其中，F(xiàn)rench Anderson與Rosenberg、MichaelBlease等，對基因治療的問世起了重要的歷史作用。
2.狂熱期(1990～1995)自1989年后，基因治療進(jìn)入臨床試驗(yàn)，到來了醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的一片狂熱。在短短的數(shù)年，有100多個(gè)臨床方案，經(jīng)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。從專業(yè)刊物至一般媒體，給人的印象是基因治療即將成為臨床治療的一種成熟的治療方法。這里既有科學(xué)家本身的盲目樂觀，又有企業(yè)界參與以后媒體的炒作。一方面在1980～1989年期間，科學(xué)家所作的儲(chǔ)備，在這時(shí)幾乎傾囊而出，其中一些還沒有成熟到可以取得臨床療效的方案也過早地進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，在報(bào)道中也有某些不實(shí)與夸張之詞。這種狂熱性也傳到了國內(nèi)。由于一些關(guān)鍵技術(shù)沒有解決，在臨床應(yīng)用中必然回碰壁。
3.理性期(1996～至今)1995年美國NIH，主持了對過去幾年基因治療臨床試驗(yàn)地初步評估，證明一百幾十個(gè)方案中確證有療效的方案僅幾個(gè)。從而提出了必須對基因治療中地關(guān)鍵問題組織研究。從而，基因治療從狂熱轉(zhuǎn)入理性化的正常軌道。必須指出，從1995年以后，基因治療在研究方面決不是冷卻。美國成立了三個(gè)研究基因?qū)胂到y(tǒng)與載體的研究機(jī)構(gòu)；從1996年至1999年，全世界的基因治療方案增加了一倍，治療病人數(shù)也增加了一倍。從投資來看，除國家投資外，企業(yè)界的熱情有增無減，僅1996年一年，企業(yè)界的投資等于1990～1995年的總和。目前每年的總投資仍在10億美元左右。基因治療的專業(yè)雜志從1種增加到3種，美國癌癥研究協(xié)會(huì)還成立了以基因治療為主的“分子治療”協(xié)會(huì)。在研究成果方面，以電脈沖DNA導(dǎo)入為代表的新技術(shù)于1999年發(fā)表，標(biāo)志著基因?qū)胂到y(tǒng)的中藥突破。凡此種種，都說明目前基因治療研究正在以穩(wěn)健的步伐跨入21世紀(jì)。
肽治療學(xué)的發(fā)展及存在的問題肽是幾個(gè)或幾十個(gè)氨基酸，通過肽鍵連接形成的有機(jī)分子，可以認(rèn)為肽是蛋白質(zhì)的功能亞單位，蛋白質(zhì)的生物活性是由組成蛋白質(zhì)分子的所有肽分子共同實(shí)現(xiàn)的。同一蛋白質(zhì)分子中不同的肽鏈具有不同的功能。作為生物治療藥物，蛋白質(zhì)的應(yīng)用歷史悠久，應(yīng)用范圍也極為廣泛，但隨著科學(xué)研究的進(jìn)步，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，組成蛋白質(zhì)分子的某些肽分子，可以代表該蛋白質(zhì)的全部治療效應(yīng)，例如胸腺5肽只是胸腺素復(fù)雜結(jié)構(gòu)中的一小段，但它在體內(nèi)可表達(dá)胸腺素的免疫調(diào)節(jié)功能。因此，尋找具有生物學(xué)活性的肽已經(jīng)成為生物治療學(xué)研究的熱門課題之一。
生物活性肽具有分子量小，結(jié)構(gòu)簡單和功能專一的特點(diǎn)，在預(yù)防、診斷和治療疾病中具有重要使用價(jià)值并已經(jīng)用于臨床，如目前使用的免疫調(diào)節(jié)劑胸腺5肽(商品名日達(dá)先)、抗愛滋病毒的T-20肽、腫瘤凋亡肽和神經(jīng)營養(yǎng)肽等，并顯示了明確的治療效果。
但是由于目前主要是合成方法制備各種肽，產(chǎn)量是毫克級的，難達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平；且合成肽的生產(chǎn)成本很高；人體的循環(huán)血和細(xì)胞內(nèi)存在大量的肽水解酶，當(dāng)肽注射到體內(nèi)常常被迅速降解，體內(nèi)半衰期縮短，臨床要求每日多次的注射生物肽來治療疾病，則又增加其治療費(fèi)用。上述種種原因，限制了肽作為治療藥物在臨床的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒制劑及其制備方法和應(yīng)用，它通過重組的腺病毒載體，向腫瘤組織內(nèi)導(dǎo)入促進(jìn)腫瘤凋亡的物質(zhì)——腫瘤凋亡肽，達(dá)到治療腫瘤的目的。
為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一種能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，它是由具有能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽基因序列的雙質(zhì)粒pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，經(jīng)過單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，再次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞培養(yǎng)純化得到的重組腺病毒。
本發(fā)明所述基因序列是具有人P53和果蠅Ant膜滲透肽的cDNA序列。
本發(fā)明所述cDNA序列是具有依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列，在5′端加入內(nèi)肽酶識別序列和Nae I內(nèi)切酶識別點(diǎn)，3′端加入果蠅膜滲透肽Ant-cDNA內(nèi)切酶Hind III識別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA。
本發(fā)明所述cDNA序列的表達(dá)載體構(gòu)建是將已經(jīng)插入了NT4全長的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，插入P53 N peptide-Ant cDNA，得到的pBV-NT4-P53N-Ant載體。
本發(fā)明所述pBV-NT4-P53N-Ant載體是使用EcoR I和BamH I雙酶切獲得編碼-NT4信號肽、引導(dǎo)肽-P53N-Ant cDNA片段，將其插入到pACCMVpLpA載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，得到將插入目的基因的腺病毒載體。
本發(fā)明所述插入目的基因的腺病毒載體是轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，得到重組腺病毒載體質(zhì)粒pACCMV-NT4-P53N-Ant。
本發(fā)明的輔助表達(dá)載體構(gòu)建是使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因組總長達(dá)40.3kb的pJM17。
本發(fā)明的包裝是使用磷酸鈣方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞得到原代重組病毒。
本發(fā)明所述原代重組病毒是感染293細(xì)胞1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備的單克隆重組病毒。
本發(fā)明所述單克隆重組病毒是感染293細(xì)胞后2小時(shí)吸出含病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全培養(yǎng)基在5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。
本發(fā)明所述收獲細(xì)胞是用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌，得到純化后的重組病毒。
本發(fā)明還提供了一種所述能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒的制備方法，它包括下列步驟1.細(xì)胞庫包裝細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒包裝蛋白的人胚腎細(xì)胞，購置的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，增殖兩代，經(jīng)過FLC鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)為人源二倍體細(xì)胞后，液氮凍存20支，為原始細(xì)胞庫；1.1種子細(xì)胞庫由液氮儲(chǔ)存容器保存，每兩個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫傳代至50代，終止使用，再次重新購置，鑒定方法及監(jiān)測方法同前；1.2主細(xì)胞庫種子細(xì)胞庫經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后經(jīng)過上述同種方法進(jìn)行監(jiān)測，作為主細(xì)胞庫，由液氮儲(chǔ)存容器保存，每個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫傳代至50代，終止使用，再次重新購置，鑒定方法及監(jiān)測方法同前；1.3工作細(xì)胞庫從主細(xì)胞庫最早復(fù)蘇的細(xì)胞，傳代次數(shù)依據(jù)生產(chǎn)任務(wù)而定，且要留有繼續(xù)傳代的細(xì)胞的量，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，用至60代后，停止使用；2.病毒庫2.1種子病毒的制備與篩查2.1.1目的基因的來源及表達(dá)盒構(gòu)建目的肽序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫資料，查到人P53和果蠅Ant膜滲透肽的cDNA序列和編碼蛋白質(zhì)序列；治療基因的肽序列依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列目的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)盒構(gòu)建依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列，在5′端加入內(nèi)肽酶識別序列和Nae I內(nèi)切酶識別點(diǎn)，3′端加入果蠅膜滲透肽Ant-cDNA內(nèi)切酶Hind III識別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA，變性和復(fù)性，將合成的cDNA插入到pGEM T載體，酶切圖譜鑒定和DNA測序證實(shí)其正確性；2.1.2表達(dá)載體構(gòu)建(1)將已經(jīng)插入了NT4全長的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，插入P53 N peptide-Ant cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-P53N-Ant載體經(jīng)酶切圖譜檢測證實(shí)；(2)使用EcoR I和BamH I雙酶切pBV-NT4-P53N-Ant載體獲得編碼-NT4信號肽、引導(dǎo)肽-P53N-Ant cDNA片段，將其插入到pACCMVpLpA載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，(3)將插入目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)，-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每兩周傳代一次，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒；(4)輔助包裝質(zhì)粒使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因組總長達(dá)40.3kb的pJM17質(zhì)粒，因?yàn)樗^了腺病毒包裝容量不能未經(jīng)重組包裝腺病毒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Dh5α宿主菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，常規(guī)在含有抗菌素的固體培養(yǎng)基上劃線分離單一菌落，小量擴(kuò)增后分離質(zhì)粒，Hind III內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌，大量培養(yǎng)擴(kuò)增，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)，-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每兩周傳代一次，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為包裝病毒用輔助質(zhì)粒；(5)包裝重組病毒①工作細(xì)胞庫的293細(xì)胞從主細(xì)胞庫分離獲取，在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)5％CO2、溫度37℃條件下貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％成片時(shí)用于病毒包裝；②使用磷酸鈣方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，常規(guī)方法觀察噬菌斑和細(xì)胞病變，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌兩次，離心收集沉淀，置-20℃反復(fù)凍融3次，3000rpm離心20分鐘收集上清，加入含10％甘油的病毒保護(hù)液2ml為原代重組病毒；③重組病毒克隆的分離和擴(kuò)增a.滴定重組病毒滴度將原代病毒或被檢測的重組病毒液，用培養(yǎng)基做指數(shù)倍的系列稀釋，10-1至10-10，接種各種濃度病毒到293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的半固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)，噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)＝病毒滴度b.分離單克隆重組病毒根據(jù)病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染劑量感染293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備單克隆重組病毒。
2.2建立原始病毒庫單克隆重組病毒毒液冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支，每10代凍存一次，作為原始病毒庫，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測病毒的增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性；2.3建立主病毒庫從原始病毒庫復(fù)蘇病毒，感染宿主293細(xì)胞后，復(fù)制出來的病毒，記錄代數(shù)，監(jiān)測增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性等參數(shù)；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例；從原始病毒庫復(fù)蘇病毒，感染宿主293細(xì)胞后，收獲病毒，置于甘油保護(hù)液中-20℃保存，每周傳代一次；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例；2.4建立工作病毒庫主病毒庫病毒經(jīng)過鑒定合格后，凍存存檔，供給工作病毒庫，工作病毒庫感染293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例；3.重組病毒的生產(chǎn)和純化3.1重組病毒的生產(chǎn)80％成片的293細(xì)胞，10MOI劑量接種工作病毒，感染后2小時(shí)吸出含病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全培養(yǎng)基在5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。
3.2重組病毒的純化收獲的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，在將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌。
本發(fā)明純化后的重組病毒用于腫瘤的治療，包括腦膠質(zhì)瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和各種白血病。
本發(fā)明是以注射劑形式用于腫瘤治療。
本發(fā)明所述注射劑為注射液或注射用無菌粉末。
本發(fā)明的意義在于1.本發(fā)明使用了信號肽和引導(dǎo)肽，同表達(dá)肽cDNA同框架(ORF)連接時(shí)設(shè)計(jì)了自身編碼了信號肽酶識別點(diǎn)。因此當(dāng)將該表達(dá)盒插入表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞時(shí)，宿主細(xì)胞的內(nèi)肽酶可以正確切割重組蛋白，在分泌出胞時(shí)獲得了表達(dá)肽即腫瘤特異凋亡肽。使轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療腫瘤的目的。
本發(fā)明的作用特點(diǎn)為由于表達(dá)的嵌合肽對正常二倍體細(xì)胞沒有凋亡作用，轉(zhuǎn)導(dǎo)的正常細(xì)胞，尤其是腫瘤的間質(zhì)細(xì)胞可以持續(xù)的表達(dá)嵌合肽，而且這種表達(dá)產(chǎn)物可以分泌到細(xì)胞間隙，通過嵌合肽的膜滲透機(jī)理，以非受體依賴和非能量依賴方式進(jìn)入未轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒腫瘤細(xì)胞，起到持續(xù)連續(xù)殺傷腫瘤作用。由于本發(fā)明對腫瘤的凋亡作用具有特異性，不損害正常細(xì)胞的生存和增殖，因此不損害骨髓造血器官和其它器官的生理機(jī)能，無化學(xué)抗癌藥和其它泛性細(xì)胞自殺基因的毒負(fù)作用，安全性好。由于本發(fā)明對正常細(xì)胞的無害性，確保了非腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)之后可以長期表達(dá)腫瘤特異凋亡嵌合肽，彌補(bǔ)了腫瘤基因治療過程中，無法實(shí)現(xiàn)所有的腫瘤細(xì)胞全部轉(zhuǎn)導(dǎo)了治療基因的不足。嵌合肽的分泌表達(dá)和嵌合肽的膜滲透功能及其核定位精密設(shè)計(jì)，確保了治療基因殺傷腫瘤的有效性。因此本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了腫瘤基因治療中的安全性和有效性的雙突破。它的治療原理其一是通過重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，使其表達(dá)腫瘤細(xì)胞特異凋亡肽，使其迅速死亡的直接殺傷腫瘤作用。另外是重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞，使其持續(xù)分泌表達(dá)使腫瘤特異凋亡的嵌合肽，該肽具有膜滲透功能可以有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞核，使腫瘤細(xì)胞凋亡且不定位到正常二倍體細(xì)胞核內(nèi)，不使正常細(xì)胞凋亡，起到間接持續(xù)殺傷腫瘤作用。本品治療作用是直接和間接殺傷腫瘤作用之和又保證了對正常細(xì)胞的無害性，實(shí)現(xiàn)了腫瘤基因治療的新突破。
本發(fā)明解決了生物活性肽的臨床應(yīng)用難題，減少了肽的化學(xué)合成程序和一日多次給藥等缺陷，減低了肽類物質(zhì)作為預(yù)防、治療疾病的生產(chǎn)成本和使用成本。


圖1為本發(fā)明所述cDNA變性和復(fù)性后的編碼結(jié)構(gòu)。
其中1為內(nèi)肽酶切點(diǎn)；2為Nae I切點(diǎn)；3為Hind III切點(diǎn)；4為P53氨基肽cDNA編碼； 5為滲透肽cDNA編碼具體實(shí)施方式
下面以實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒的制備1.細(xì)胞庫包裝細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒包裝蛋白的人胚腎細(xì)胞(購自于美國ATCC)，購置的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，增殖兩代，經(jīng)過FLC鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)為人源二倍體細(xì)胞后，液氮凍存20支，為原始細(xì)胞庫(原始種子細(xì)胞庫)，標(biāo)記凍存時(shí)間，代數(shù)等參數(shù)。
1.1種子細(xì)胞庫由專用的液氮儲(chǔ)存容器保存，專人專門負(fù)責(zé)。每兩個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，標(biāo)記凍存時(shí)間，代數(shù)等參數(shù)。每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定。以此類推，主細(xì)胞庫傳代至50代，終止使用，再次重新購置，鑒定方法及監(jiān)測方法同前。
1.2主細(xì)胞庫種子細(xì)胞庫經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后經(jīng)過上述同種方法進(jìn)行監(jiān)測，作為主細(xì)胞庫。由專用的液氮儲(chǔ)存容器保存，專人專門負(fù)責(zé)。每個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，標(biāo)記凍存時(shí)間，代數(shù)等參數(shù)。每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定。以此類推，主細(xì)胞庫傳代至50代，終止使用，再次重新購置，鑒定方法及監(jiān)測方法同前。
1.3工作細(xì)胞庫從主細(xì)胞庫最早復(fù)蘇的細(xì)胞。傳代次數(shù)依據(jù)生產(chǎn)任務(wù)而定，且要留有繼續(xù)傳代的細(xì)胞的量。每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定。一般用至60代后，集停止使用。
2.病毒庫2.1種子病毒的制備與篩查2.1.1目的基因的來源及表達(dá)盒構(gòu)建目的肽序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫資料，查到人P53和果蠅Ant膜滲透肽的cDNA序列和編碼蛋白質(zhì)序列。
治療基因的肽序列依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列目的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)盒構(gòu)建依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列，在5′端加入內(nèi)肽酶識別序列和Nae I內(nèi)切酶識別點(diǎn)，3′端加入果蠅膜滲透肽Ant-cDNA內(nèi)切酶Hind III識別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA，變性和復(fù)性后將合成的cDNA插入到pGEM T載體，酶切圖譜鑒定和DNA測序證實(shí)其正確性。
2.1.2表達(dá)載體構(gòu)建(1)將已經(jīng)插入了NT4全長的pBV-NT4質(zhì)粒(本室自己克隆構(gòu)建，測序證實(shí))，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，插入P53 N peptide-Ant cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-P53N-Ant載體經(jīng)酶切圖譜檢測證實(shí)。
(2)使用EcoR I和BamH I雙酶切pBV-NT4-P53N-Ant載體獲得編碼-NT4信號肽、引導(dǎo)肽-P53N-Ant cDNA片段，將其插入到pACCMVpLpA載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，pACCMVpLpA載體由加拿大Microbix生物公司提供。
(3)將插入目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞(美國Invtrogen公司購買)。大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒。紫外分光度計(jì)280/260測定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)。-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每兩周傳代一次，小提質(zhì)粒，酶切鑒定。大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒。
(4)輔助包裝質(zhì)粒使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因組總長達(dá)40.3kb的pJM17質(zhì)粒(因?yàn)樗^了腺病毒包裝容量不能未經(jīng)重組包裝腺病毒)，購于Microbix公司。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Dh5α宿主菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，常規(guī)在含有抗菌素的固體培養(yǎng)基上劃線分離單一菌落，小量擴(kuò)增后分離質(zhì)粒，Hind III內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌，大量培養(yǎng)擴(kuò)增。堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒。紫外分光度計(jì)280/260測定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)。-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每兩周傳代一次，小提質(zhì)粒，酶切鑒定。大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為包裝病毒用輔助質(zhì)粒。
(5)包裝重組病毒①工作細(xì)胞庫的293細(xì)胞從主細(xì)胞庫分離獲取，記錄代數(shù)和分離時(shí)間。在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)5％CO2、溫度37℃條件下貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％成片時(shí)用于病毒包裝。
②使用磷酸鈣方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，常規(guī)方法觀察噬菌斑和細(xì)胞病變。收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌兩次，離心收集沉淀，置-20℃反復(fù)凍融3次，3000rpm離心20分鐘收集上清。加入含10％甘油的病毒保護(hù)液2ml為原代重組病毒。
③重組病毒克隆的分離和擴(kuò)增a.滴定重組病毒滴度將原代病毒或被檢測的重組病毒液，用培養(yǎng)基做指數(shù)倍的系列稀釋，10-1至10-10，接種各種濃度病毒到293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的半固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)。
噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)＝病毒滴度b.分離單克隆重組病毒根據(jù)病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染劑量感染293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備單克隆重組病毒。
2.2建立原始病毒庫單克隆重組病毒毒液冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支。每10代凍存一次。作為原始病毒庫。每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測病毒的增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性。
2.3建立主病毒庫從原始病毒庫復(fù)蘇病毒，感染宿主(293)細(xì)胞后，復(fù)制出來的病毒，記錄代數(shù)，監(jiān)測增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性等參數(shù)；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例。
從原始病毒庫復(fù)蘇病毒，感染宿主(293)細(xì)胞后，收獲病毒，置于甘油保護(hù)液中-20℃保存。每周傳代一次，記錄代數(shù)，監(jiān)測增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性等參數(shù)；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例。
2.4建立工作病毒庫主病毒庫病毒經(jīng)過鑒定合格后，凍存存檔，供給工作病毒庫。工作病毒庫感染293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，記錄代數(shù)，監(jiān)測增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性等參數(shù)；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例。用于藥物生產(chǎn)。
3.重組病毒的生產(chǎn)和純化3.1重組病毒的生產(chǎn)80％成片的293細(xì)胞，10MOI劑量接種工作病毒，感染后2小時(shí)吸出含病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全培養(yǎng)基在5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。
3.2重組病毒的純化收獲的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，在將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌。
實(shí)施例2重組病毒注射劑的制備成型重組病毒注射液的制備成型將純化后的重組病毒稀釋到含有2％甘露醇的0.85％Nacl溶液中，使其終濃度為2×108pfu，灌裝得到重組病毒注射液。
實(shí)施例3重組病毒注射劑的制備成型重組病毒無菌粉末的制備成型將純化后的重組病毒稀釋到含有2％甘露醇的0.85％Nacl溶液中，使其終濃度為2×108pfu，灌裝經(jīng)冷凍干燥得到重組病毒無菌粉末。
臨床應(yīng)用劑型及規(guī)格1.注射液(10-10～1010ml/規(guī)格)2.注射用無菌粉末(10-10～1010mg/規(guī)格)臨床給藥途徑1.皮下注射2.皮內(nèi)注射3.肌肉注射4.靜脈注射5.靜脈滴注6.腫瘤體內(nèi)注射7.血管插管等臨床應(yīng)用范圍1.腦膠質(zhì)瘤2.肝癌3.肺癌4.乳腺癌5.前列腺癌6.各種白血病等。
使用能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒制劑轉(zhuǎn)導(dǎo)二倍體細(xì)胞，人胚腎293細(xì)胞，原代分離的血管內(nèi)皮細(xì)胞和NIH 3T3小鼠成纖維細(xì)胞，不影響細(xì)胞的生長和傳代，不出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和形態(tài)學(xué)異常。
實(shí)施例4使用能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒制劑轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，包括小鼠肝癌細(xì)胞H22、人肝癌細(xì)胞HpaG2、宮頸癌細(xì)胞Hela，24小時(shí)后出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變，48小時(shí)后脫壁死亡。
實(shí)施例5使用能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒制劑轉(zhuǎn)染的正常二倍體細(xì)胞培養(yǎng)物，移植到腫瘤細(xì)胞中見到了同重組病毒相同的殺傷作用，而且不影響正常細(xì)胞生長和增殖。使用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞的IP染色和細(xì)胞LDH釋放實(shí)驗(yàn)證實(shí)了本品的特異殺傷腫瘤作用。
實(shí)施例6使用小鼠H22肝癌細(xì)胞系和Waker256乳腺癌肉瘤細(xì)胞系，建立ICR小鼠皮下種植瘤動(dòng)物模型。當(dāng)腫瘤結(jié)節(jié)的最大直徑達(dá)到10mm時(shí)，多點(diǎn)瘤體注射使用能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒制劑一次，2天后病理檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤注射區(qū)出現(xiàn)中心性壞死和出血，注射GFP和對照病毒動(dòng)物的瘤區(qū)無此現(xiàn)象，僅注射表達(dá)GFP的病毒的瘤組織顯示GFP熒光。注射治療病毒后7天，7/22小鼠腫瘤結(jié)節(jié)消退，小鼠生活如常已經(jīng)達(dá)治療后8周。另11只腫瘤生長緩慢或不在生長，4只死亡。16只對照小鼠，種植瘤直徑已經(jīng)達(dá)到20mm以上，兩只出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和另兩只出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移和癌性腹水，在注射對照藥物六周內(nèi)14死亡。
序列表抗腫瘤肽氨基酸DNA序列FileNT4P53N.TXTRange1-339 ModeNormalCodon TableUniversalMolecular Weight12634.29 18 27 36 45 545’ATG CTC CCT CTC CCC TCA TGC TCC CTC CCC ATC CTC CTC CTT TTC CTC CTC CCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Met Leu Pro Leu Pro Ser Cys Ser Leu Pro Ile Leu Leu Leu Phe Leu Leu Pro63 72 81 90 99 108AGT GTG CCA ATT GAG TCC CAA CCC CCA CCC TCA ACA TTG CCC CCT TTT CTG GCC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ser Val Pro Ile Glu Ser Gln Pro Pro Pro Ser Thr Leu Pro Pro Phe Leu Ala117 126 135 144 153 162CCT GAG TGG GAC CTT CTC TCC CCC CGA GTA GTC CTG TCT AGG GGT GCC CCT GCT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Pro Glu Trp Asp Leu Leu Ser Pro Arg Val Val Leu Ser Arg Gly Ala Pro Ala171 180 189 198 207 216GGG CCC CCT CTG CTC TTC CTG CTG GAG GCT GGG GCC TTT CGG GAG TCA GCA GGT--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Gly Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Ala Gly Ala Phe Arg Glu Ser Ala Gly225 234 243 252 261 270GCC CCG GCC AAC CGC AGC CGG CGT CCC CCT CTG AGT CAG GAA ACA TTT TCA GAC--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Ala Pro Ala Asn Arg Ser Arg Arg Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp279 288 297 306 315 324CTA TGG AAA CTA CTT GAG CGC CAG ATA AAG ATT TGG TTC CAG AAT CGG CGC ATG--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- ---Leu Trp Lys Leu Leu Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met333AAG TGG AAG AAG TGA 3’--- --- --- --- ---Lys Trp Lys Lys ***
權(quán)利要求
1.一種能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于它是由具有能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽基因序列的雙質(zhì)粒pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，經(jīng)過單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，再次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞培養(yǎng)純化得到的重組腺病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述基因序列是具有人P53和果蠅Ant膜滲透肽的cDNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述cDNA序列是具有依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列，在5`端加入內(nèi)肽酶識別序列和Nae I內(nèi)切酶識別點(diǎn)，3`端加入果蠅膜滲透肽Ant-cDNA內(nèi)切酶Hind III識別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述cDNA序列的表達(dá)載體構(gòu)建是將已經(jīng)插入了NT4全長的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，插入P53 N peptide-Ant cDNA，得到的pBV-NT4-P53N-Ant載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述pBV-NT4-P53N-Ant載體是使用EcoR I和BamH I雙酶切獲得編碼-NT4信號肽、引導(dǎo)肽-P53N-Ant cDNA片段，將其插入到pACCMVpLpA載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，得到將插入目的基因的腺病毒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述插入目的基因的腺病毒載體是轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，得到重組腺病毒載體質(zhì)粒pACCMV-NT4-P53N-Ant。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于它的輔助表達(dá)載體構(gòu)建是使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因組總長達(dá)40.3kb的pJM17。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于它的包裝是使用磷酸鈣方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞得到原代重組病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述原代重組病毒是感染293細(xì)胞1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備的單克隆重組病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述單克隆重組病毒是感染293細(xì)胞后2小時(shí)吸出含病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全培養(yǎng)基在5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒，其特征在于所述收獲細(xì)胞是用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌，得到純化后的重組病毒。
12.一種如權(quán)利要求1-11所述能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒的制備方法，其特征在于它包括下列步驟1.細(xì)胞庫包裝細(xì)胞為轉(zhuǎn)導(dǎo)了腺病毒包裝蛋白的人胚腎細(xì)胞，購置的細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇后，增殖兩代，經(jīng)過FLC鑒定和形態(tài)學(xué)觀察，證實(shí)為人源二倍體細(xì)胞后，液氮凍存20支，為原始細(xì)胞庫；1.1種子細(xì)胞庫由液氮儲(chǔ)存容器保存，每兩個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫傳代至50代，終止使用，再次重新購置，鑒定方法及監(jiān)測方法同前；1.2主細(xì)胞庫種子細(xì)胞庫經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后經(jīng)過上述同種方法進(jìn)行監(jiān)測，作為主細(xì)胞庫，由液氮儲(chǔ)存容器保存，每個(gè)月復(fù)蘇一支，再行增殖2代，凍存10支，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，以此類推，主細(xì)胞庫傳代至50代，終止使用，再次重新購置，鑒定方法及監(jiān)測方法同前；1.3工作細(xì)胞庫從主細(xì)胞庫最早復(fù)蘇的細(xì)胞，傳代次數(shù)依據(jù)生產(chǎn)任務(wù)而定，且要留有繼續(xù)傳代的細(xì)胞的量，每隔10代，要經(jīng)過FLC、形態(tài)學(xué)觀察和增值能力鑒定，用至60代后，停止使用；2.病毒庫2.1種子病毒的制備與篩查2.1.1目的基因的來源及表達(dá)盒構(gòu)建目的肽序列根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫資料，查到人P53和果蠅Ant膜滲透肽的cDNA序列和編碼蛋白質(zhì)序列；治療基因的肽序列依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列目的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)盒構(gòu)建依據(jù)P53的氨基端12-26aa肽序列，在5`端加入內(nèi)肽酶識別序列和Nae I內(nèi)切酶識別點(diǎn)，3`端加入果蠅膜滲透肽Ant-cDNA內(nèi)切酶Hind III識別點(diǎn)的正負(fù)鏈cDNA，變性和復(fù)性，將合成的cDNA插入到pGEM T載體，酶切圖譜鑒定和DNA測序證實(shí)其正確性；2.1.2表達(dá)載體構(gòu)建(1)將已經(jīng)插入了NT4全長的pBV-NT4質(zhì)粒，使用內(nèi)切酶刪除NT4編碼的成熟蛋白編碼區(qū)，插入P53 N peptide-Ant cDNA，構(gòu)建了pBV-NT4-P53N-Ant載體經(jīng)酶切圖譜檢測證實(shí)；(2)使用EcoR I和BamH I雙酶切pBV-NT4-P53N-Ant載體獲得編碼-NT4信號肽、引導(dǎo)肽-P53N-Ant cDNA片段，將其插入到pACCMVpLpA載體的EcoR I和BamH I多克隆位點(diǎn)，(3)將插入目的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)化Topo10感受態(tài)細(xì)胞，大量增殖轉(zhuǎn)化菌，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)，-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每兩周傳代一次，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為表達(dá)載體的種子菌和種子質(zhì)粒；(4)輔助包裝質(zhì)粒使用插入pBR322序列的腺病毒5型基因組總長達(dá)40.3kb的pJM17質(zhì)粒，因?yàn)樗^了腺病毒包裝容量不能未經(jīng)重組包裝腺病毒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Dh5α宿主菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，常規(guī)在含有抗菌素的固體培養(yǎng)基上劃線分離單一菌落，小量擴(kuò)增后分離質(zhì)粒，Hind III內(nèi)切酶消化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的轉(zhuǎn)化菌，大量培養(yǎng)擴(kuò)增，堿裂解方法提取質(zhì)粒，sephadex G50柱層析純化質(zhì)粒，紫外分光度計(jì)280/260測定DNA純度，酶切圖譜鑒定重組狀態(tài)，-20℃條件下LB/甘油溶液中保存轉(zhuǎn)化菌，每兩周傳代一次，小提質(zhì)粒，酶切鑒定，大提的重組質(zhì)粒，無菌條件下冷凍干燥，-20℃冰箱保存，每6個(gè)月制備一次，酶切圖譜鑒定，為包裝病毒用輔助質(zhì)粒；(5)包裝重組病毒①工作細(xì)胞庫的293細(xì)胞從主細(xì)胞庫分離獲取，在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)5％CO2、溫度37℃條件下貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80％成片時(shí)用于病毒包裝；②使用磷酸鈣方法，pJM17和pACCMV-NT4-P53N-Ant雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，常規(guī)方法觀察噬菌斑和細(xì)胞病變，收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌兩次，離心收集沉淀，置-20℃反復(fù)凍融3次，3000rpm離心20分鐘收集上清，加入含10％甘油的病毒保護(hù)液2ml為原代重組病毒；③重組病毒克隆的分離和擴(kuò)增a.滴定重組病毒滴度將原代病毒或被檢測的重組病毒液，用培養(yǎng)基做指數(shù)倍的系列稀釋，10-1至10-10，接種各種濃度病毒到293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的半固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后計(jì)數(shù)噬斑數(shù)，噬斑數(shù)×稀釋倍數(shù)＝病毒滴度b.分離單克隆重組病毒根據(jù)病毒原液的病毒滴度，以10MOI的病毒感染劑量感染293細(xì)胞，感染1小時(shí)后，吸出病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，換含有1.3％細(xì)胞瓊脂的辦固體完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，一周后出現(xiàn)噬斑，使用彎頭滴管取出單個(gè)噬斑的瓊脂，反復(fù)凍融噬斑瓊脂，加2ml培養(yǎng)基洗脫病毒，使用洗脫的病毒感染293細(xì)胞，制備單克隆重組病毒。2.2建立原始病毒庫單克隆重組病毒毒液冷凍干成粉，每次分裝40支，0.1ml/支，每10代凍存一次，作為原始病毒庫，每2個(gè)月復(fù)蘇一次，檢測病毒的增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性；2.3建立主病毒庫從原始病毒庫復(fù)蘇病毒，感染宿主293細(xì)胞后，復(fù)制出來的病毒，記錄代數(shù)，監(jiān)測增殖能力、感染能力、遺傳穩(wěn)定性等參數(shù)；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例；從原始病毒庫復(fù)蘇病毒，感染宿主293細(xì)胞后，收獲病毒，置于甘油保護(hù)液中-20℃保存，每周傳代一次；提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例；2.4建立工作病毒庫主病毒庫病毒經(jīng)過鑒定合格后，凍存存檔，供給工作病毒庫，工作病毒庫感染293細(xì)胞，擴(kuò)增病毒，提取病毒DNA，PCR特異擴(kuò)增目的基因，檢測野生毒株比例；3.重組病毒的生產(chǎn)和純化3.1重組病毒的生產(chǎn)80％成片的293細(xì)胞，10MOI劑量接種工作病毒，感染后2小時(shí)吸出含病毒液體，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全培養(yǎng)基在5％CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，收獲細(xì)胞。3.2重組病毒的純化收獲的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，-20℃冰箱冷凍，37℃溶解，凍融三次3000rpm 4℃離心20分鐘收集上清。加入0.5體積的20％PEG，含2.5M NaCl溶液冰浴30分鐘，搖床過夜。4℃20000orpm離心10分鐘收集沉淀。沉淀的病毒用PBS溶解后，置1.30g/ml蔗糖溶液頂端，水平超速離心360000g，4℃2小時(shí)，收集沉淀。溶于含有5mMKcl、10mM Tris-Hcl的等滲Nacl溶液中，在將溶液通過sephadex柱床層析，收集260nm吸收峰各管，合并后過膜除菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒的應(yīng)用，其特征在于純化后的重組病毒用于腫瘤的治療，包括腦膠質(zhì)瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和各種白血病。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒的應(yīng)用，其特征在于它是以注射劑形式用于腫瘤治療。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒的應(yīng)用，其特征在于所述注射劑為注射液或注射用無菌粉末。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽的重組腺病毒及其制備方法，它是由具有能夠表達(dá)腫瘤特異凋亡肽基因序列的雙質(zhì)粒pJM17和pACCMV－NT4－P53N－Ant共轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，經(jīng)過單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，再次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞培養(yǎng)純化得到的重組腺病毒。它通過重組的腺病毒載體，向腫瘤組織內(nèi)導(dǎo)入促進(jìn)腫瘤凋亡的物質(zhì)——腫瘤凋亡肽，達(dá)到治療腫瘤的目的。
文檔編號C12N15/12GK1775947SQ20051009847
公開日2006年5月24日 申請日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者楊廣孝, 李求是 申請人:北京多米諾醫(yī)藥研究所