專利名稱：：腫瘤抗原trag-3模擬表位肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種腫瘤抗原模擬表位肽，特別涉及腫瘤抗原TRAG-3模擬表位肽，還涉及該模擬表位肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是嚴重威脅人類健康的高發(fā)病率和高死亡率疾病。其治療方法主要包括手術(shù)切除、放射治療和化學(xué)藥物治療，但這些方法對某些腫瘤特別是晚期惡性腫瘤的治療效果還不盡如人意。近年來，腫瘤免疫治療作為惡性腫瘤的第四種治療方法得到迅速發(fā)展。已有大量文獻報道，基于腫瘤抗原細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表位的腫瘤疫苗在體內(nèi)可有效誘導(dǎo)特異性殺瘤CTL的產(chǎn)生，使部分患者的病情得到控制和緩解，而對正常組織無損害。因此，腫瘤疫苗的研制具有重要意義和良好的應(yīng)用前景。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多種腫瘤抗原及其CTL表位被鑒定并成為腫瘤免疫學(xué)及肺瘤疫苗發(fā)展的基礎(chǔ)。其中，腫瘤睪丸抗原(CT)家族是一類包含多個基因家族的腫瘤特異性共享抗原，廣泛表達于多種實體瘤組織中，而在除睪丸、胎盤外的其他正常組織不表達。因其在腫瘤組織表達的特異性和在體內(nèi)激發(fā)細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答的有效性，CT抗原成為多種實體瘤特異性疫苗免疫治療的首選抗原。泰素耐藥相關(guān)基因(TRAG-3)編碼的TRAG-3是由Duan等在尋找泰素耐藥基因時在泰素耐藥的卵巢癌細胞抹SKOVTR中發(fā)現(xiàn)的一個新CT抗原，在多種惡性腫瘤如非小細胞肺癌、軟骨肉瘤和黑色素瘤中高表達，而在除睪丸組織外的其他正常組織(肝臟、肺臟、腎臟、胰腺、骨骼肌、胎盤、心臟和腦)中不表達。發(fā)明人在前期研究中發(fā)現(xiàn)，TRAG-358-66(ILLRDAGLV)為HLA-A2.1限制性CTL表位，該表位肽負載樹突狀細胞腫瘤疫苗在體外能夠有效激發(fā)抗瘤CTL免疫反應(yīng)。但是，天然表位肽存在不易被抗原遞呈細胞攝取，易被肽酶降解等缺陷，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的腫瘤多肽疫苗不能滿足腫瘤免疫治療的要求，必須對天然表位肽進行改造，以增加CTL免疫應(yīng)答強度和抗肽酶降解能力。近年來，運用非天然氨基酸對生物活性肽進行化學(xué)修飾，研究其構(gòu)效關(guān)系，進一步發(fā)展高效肽類似物，已成為多肽化學(xué)研究的重要手段和方向之一。運用這種方法已得到許多具有高活性、高選擇性、半衰期長的肽類似物。因此，利用非天然氨基酸對天然表位肽進行改造，有望獲得既能激發(fā)較強CTL免疫應(yīng)答，又能抗肽酶降解的模擬表位肽。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于利用非天然氨基酸對TRAG-3天然表位肽(TRAG-358-66,ILLRDAGLV)進行改造，獲得既能激發(fā)較強CTL免疫應(yīng)答，又能抗肽酶降解的模擬表位肽；目的之二在于提供所得模擬表位肽的應(yīng)用。為達到上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種TRAG-3模擬表位肽，由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列組成，其中，第5位Asp為D-Asp或者第6位Ala為D-Ala。在本發(fā)明的第二方面，提供了所述TRAG-3模擬表位肽在制備治療TRAG-3陽性腫瘤的多肽疫苗中的應(yīng)用。進一步，所述TRAG-3陽性腫瘤包括非小細胞肺癌、軟骨肉瘤和黑色素瘤。本發(fā)明的有益效果在于研究結(jié)果顯示，與TRAG-3天然表位肽相比，本發(fā)明的TRAG-3模擬表位肽具有更好的抗酶降解穩(wěn)定性，與HLA-A2.1具有更強的親和力，并且對TRAG-3陽性腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的CTL特異性殺傷效應(yīng)；因此，本發(fā)明的模擬表位肽可以用于制備治療TRAG-3陽性腫瘤的多肽疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，其中圖1為TRAG-3模擬表位肽T1的空間結(jié)構(gòu)模擬圖2為TRAG-3模擬表位肽Tl與HLA-A2.1的復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖3為TRAG-3模擬表位肽T2的空間結(jié)構(gòu)模擬圖4為TRAG-3模擬表位肽T2與HLA-A2.1的復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)模擬圖；圖5為TRAG-3模擬表位肽T1的質(zhì)譜鑒定圖；圖6為TRAG-3模擬表位肽T2的質(zhì)譜鑒定圖7為TRAG-3模擬表位肽Tl和T2與HLA-A2.1的親和力4僉測結(jié)果圖；圖8為TRAG-3模擬表位肽Tl和T2的抗酶解穩(wěn)定性檢測結(jié)果圖；圖9為TRAG-3才莫擬表位肽Tl和T2對TRAG-3陽性腫瘤細胞的體外殺傷能力才企測結(jié)果圖10為TRAG-3模擬表位肽Tl和T2對TRAG-3陽性腫瘤細胞的體內(nèi)殺傷能力^r測結(jié)果圖。具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、候選TRAG-3模擬表位肽的序列將TRAG-3天然表位肽(TRAG-358-66，ILLRDAGLV，SEQIDNo.l)中各個位置的丄-氨基酸分別單獨用對應(yīng)的D-氨基酸進行替換，獲得9個候選TRAG-3模擬表位肽。二、候選TRAG-3模擬表位肽的分子動力學(xué)模擬1、分子模型構(gòu)建運用Silicongraphics工作站及InsightII軟件包中的Discover3.0才莫塊(采用CVFF力場)，對9個候選TRAG-3模擬表位肽與HLA-A2.1的復(fù)合物進行分子動力學(xué)模擬。HLA-A2.1的初始坐標(biāo)來自于蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(ProteinDataBank)中流感病毒蛋白]\4158.66與HLA-A0201的復(fù)合物(登錄號為1HHI),候選TRAG-3模擬表位肽是運用Bioploymer模塊對流感病毒Ml58-66進行氨基酸替換而得。分子動力學(xué)^f莫擬分五步進行第一步，將HLA-A2.1與(32m固定，運用最陡下降法對候選TRAG-3模擬表位進行2000步優(yōu)化計算，然后用共軛梯度法優(yōu)化，直到能量均方根誤差(RMS)小于0.1kal/moLA;第二步，在復(fù)合物周圍加一層7.5A的水分子，并固定復(fù)合物對水分子進行2000步能量優(yōu)化，以消除水分子之間以及水分子與蛋白質(zhì)之間的不合理接觸；第三步，對溶液狀態(tài)下的復(fù)合物進行能量最小化計算，非鍵相互作用采用9.5A的截斷值，先后運用最陡下降法和共軛梯度法優(yōu)化，直到能量RMS小于0.1kal/mol.A;第四步，在298K的恒定溫度下進行20皮秒的分子動力學(xué)計算；第五步，對動力學(xué)優(yōu)化得到的最后構(gòu)象進行分子力學(xué)優(yōu)化5000步，即得候選TRAG-3模擬表位肽與HLA-A2.1的復(fù)合物的最終構(gòu)象。2、結(jié)合特征參數(shù)計算借助Homology模塊，計算候選TRAG-3模擬表位肽中各殘基的溶劑可及表面積、錨定殘基間距及氳鍵數(shù)等結(jié)合特征參數(shù)。溶劑可及表面積的計算采用Lee和Richards定義的空間填充模型，選擇水分子作為探針分子，溶劑半徑選為0.14nm。各殘基尤其是錨定殘基的溶劑可及表面積越小，說明模擬表位肽與HLA-A2.1的嵌合越緊密。結(jié)果9個候選TRAG-3模擬表位肽中有2個(Tl和T2)能夠與HLA-A2.1緊密結(jié)合，Tl和T2的空間結(jié)構(gòu)模擬圖及其與HLA-A2.1的復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)模擬圖見圖1~4;Tl和T2與HLA-A2.1的結(jié)合特征參數(shù)計算結(jié)果見表1。表1候選TRAG-3模擬表位肽與HLA-A2.1的結(jié)合特征參數(shù)多肽序列錨定殘基間距氫鍵數(shù)錨定殘基的溶液可及表面積(A2)(A)P2P9TRAG-3縣ILLRDAGLV17.73111.4013.035TlILLRD(単GLV18.381200.193T2ILLRDA(Z))GLV16.2980.3860.902三、候選TRAG-3模擬表位肽的合成、純化及鑒定候選TRAG-3模擬表位肽Tl和T2的合成、純化及鑒定委托深圳瀚宇藥業(yè)有限公司進行，合成采用多肽合成儀與標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，精氨酸采用兩次偶聯(lián)；純化采用中壓液相色譜儀；純度鑒定采用反相高效液相色譜儀，分子量鑒定采用質(zhì)譜儀。結(jié)果所得Tl和T2的純度均在95。/。以上，分子量測定值與理論值基本相符，質(zhì)譜鑒定圖見圖5~6。四、候選TRAG-3模擬表位肽與HLA-A2.1的親和力檢測本實驗使用HLA-A2.1表達陽性且內(nèi)源性抗原加工處理能力缺失的T2細胞。實驗原理為T2細胞表面空載的HLA-A2.1表達極不穩(wěn)定，呈遞后很快降解，而結(jié)合了抗原肽的HLA-A2.1表達穩(wěn)定，且抗原肽與HLA-A2.1的結(jié)合力越強，HLA-A2.1的表達量越高；因T2細胞的內(nèi)源性抗原加工處理能力缺失，故T2細胞表面HLA-A2.1的表達量增加直觀地反應(yīng)了外源性抗原肽與HLA-A2.1的結(jié)合力。利用BB7.2雜交瘤細胞產(chǎn)生的鼠抗人HLA-A2.1單克隆抗體，采用間接熒光免疫法可以檢測T2細胞表面HLA-A2.1的表達量。T2細胞(購自ATCC公司)用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液在溫度為37°C、C02體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每隔2~3天傳代1次。BB7.2雜交瘤細胞用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在溫度為37°C、C02體積分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，每隔23天傳代1次，收集培養(yǎng)上清液，即得鼠抗人HLA-A2.1單克隆抗體。T2細胞用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，以lxl0V孔接種于12孔培養(yǎng)板中，加入候選TRAG-3才莫擬表位肽至終濃度為100嗎/ml，同時設(shè)置空白對照(不加入候選TRAG-3模擬表位肽)，在溫度為37°C、C02體積分數(shù)為5%的條件下共孵育18小時，離心棄上清，細胞沉淀用PBS洗滌后，加入鼠抗人HLA-A2.1單克隆抗體100^1,溫度4。C孵育1小時，離心棄上清，細胞沉淀用PBS洗滌后，加入稀釋度為1:50的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自Biolegend公司)lOOW,溫度4。C孵育30分鐘，離心棄上清，細胞沉淀用PBS洗滌后，在流式細胞儀上檢測平均焚光強度，檢測波長為488nm,按照下述公式計算熒光系數(shù)(FI):FP(樣品平均熒光強度-空白對照平均熒光強度)/空白對照平均熒光強度，判斷標(biāo)準(zhǔn)FIM.5為高親和力，1.0<FI<1.5為中等親和力,1.0>FI>0.5為低親和力。結(jié)果Tl和T2與HLA-A2.1的親和力檢測結(jié)果見圖7和表2,由圖表可知，與天然表位肽相比，Tl和T2與HLA-A2.1的親和力更高。表2候選TRAG-3模擬表位肽與HLA-A2.1的親和力多肽平均熒光強度熒光系數(shù)TRAG-3涯5.31.52Tl6.62.14T27.22.30空白對照2.1—五、候選TRAG-3模擬表位肽的抗酶降解穩(wěn)定性檢測取HLA-A2.1陽性健康者的濃縮白細胞(購自西南醫(yī)院血庫)，每10ml中加入1000IE的肝素鈉，低速離心分離血細胞，血漿于溫度-20。C保存?zhèn)溆?；在冰浴條件下向離心管中加入所得血漿再加入候選TRAG-3模擬表位肽至終濃度為50嗎/ml，振蕩1~2秒，溫度37。C孵育，分別于第1、2、4、8小時取出20^1，加入冰冷的乙腈90p1,渦旋混勻終止孵育，冰上放置5分鐘，再加入冰冷的質(zhì)量分數(shù)為0.5%的乙酸溶液90fi1稀釋以確保酶解過程停止，13000g離心15分鐘，收集上清液，過濾，取濾液進行高效液相色譜分析，按下述公式計算降解率降解率(0/。)=[(初始量_殘留量)/初始量]x100。結(jié)果T1和T2的抗酶降解穩(wěn)定性檢測結(jié)果見圖8和表3，由圖表可知，與天然表位肽相比，Tl和T2的抗酶降解穩(wěn)定性更好。表3候選TRAG-3模擬表位肽的抗酶降解穩(wěn)定性處理時間(h)降解率(％)TRAG-358.■66TlT2124831.1270.5489.1297.1011.2320.1434.2139.129.7812.3420.5630.51六、候選TRAG-3模擬表位肽對TRAG-3陽性腫瘤細胞的體外殺傷能力檢測1、效應(yīng)細胞的制備取HLA-A2.1陽性健康者的濃縮白細胞(購自西南醫(yī)院血庫)，用聚蔗糖-泛影葡氨分層液梯度離心法分離，獲得外周血單個核細胞(PBMC),用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的PBS調(diào)整細胞濃度為lxl0Vml,接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml，加入候選TRAG-3模擬表位肽至終濃度為100嗎/ml以及重組人白細胞介素-2(rML-2，購自Biolegend公司)至終濃度為30U/ml共培養(yǎng)，之后每周收集細胞，1000r/min離心5分鐘，細胞沉淀按同樣方法加入相同濃度的候選TRAG-3模擬表位肽和rhlL-2進行共培養(yǎng)，連續(xù)刺激PBMC3次，收集細胞作為效應(yīng)細胞；同時，以H2-Kk限制性小鼠肝炎病毒CTL表位肽(正PYNGVI)作為陰性參照肽。2、靶細胞的制備將TRAG-3陽性的黑色素瘤細胞LB373-MEL(購自ATCC公司)用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為耙細胞。3、乳酸脫氬酶(LDH)釋放實驗將靶細胞調(diào)整細胞濃度為2xl05/ml，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100(^1,加入不同稀釋度的效應(yīng)細胞ioopi使效靶比分別為20:i、40:i和80:i,同時設(shè)置自然釋放孔(加入培養(yǎng)液)和最大釋放孔(加入終濃度為15嗎/ml的植物血凝素)，在溫度為37。C、C02體積分數(shù)為5%的條件下孵育3小時，加入LDH補充液及裂解液(LDH檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，繼續(xù)孵育1小時，1000r/min離心IO分鐘，取上清液50(al，加入LDH反應(yīng)液及顯色液，室溫避光孵育30分鐘，加入LDH終止液，用酶標(biāo)儀檢測吸光度A值，按照下述公式計算特異性殺傷率特異性殺傷率(％)=(樣品孔A值-自然釋放孔A值)/(最大釋放孔A值-自然釋放孔A值)x100。結(jié)果Tl和T2對黑色素瘤細胞的體外殺傷能力檢測結(jié)果見圖9和表4，由圖表可知，與天然表位肽相比，Tl和T2對黑色素瘤細胞的體外殺傷能力更強。表4候選TRAG-3模擬表位肽對黑色素瘤細胞的體外殺傷能力<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>七、候選TRAG-3模擬表位肽對TRAG-3陽性腫瘤細胞的體內(nèi)殺傷能力檢測1、實-驗動物812周齡的HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因鼠，是將含有HLA-A2.1全長基因的EcoRI片段注射入C57BL/6小鼠的卵細胞而獲得，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心。2、效應(yīng)細胞的制備于HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因鼠尾根部皮下注射經(jīng)福氏不完全佐劑(購自Sigma公司)乳化的候選TRAG-3模擬表位肽，每只IOO嗎，每周l次，連續(xù)3周，末次免疫后l周，處死小鼠，無菌條件下取脾臟，分離T淋巴細胞，用含10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為lxl06/ml，接種至24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5ml,加入候選TRAG-3模擬表位肽至終濃度為100嗎/ml以及rhlL-2(購自Biolegend公司)至終濃度為20U/ml共培養(yǎng)，7天后收集細胞作為效應(yīng)細胞；同時，以H2-Kk限制性小鼠肝炎病毒CTL表位肽(正PYNGVI)作為陰性參照肽。3、耙細胞的制備將TRAG-3陽性的黑色素瘤細胞LB373-MEL(購自ATCC公司)用含有質(zhì)量分數(shù)為10%的胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為輩巴細胞。4、LDH釋放實驗將耙細胞調(diào)整細胞濃度為2xl05/ml，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔lOO[il，加入不同稀釋度的效應(yīng)細胞ioO(ii使效靶比分別為20:l、40:i和80:i,同時設(shè)置自然釋放孔(加入培養(yǎng)液)和最大釋放孔(加入終濃度為15|ig/ml的植物血凝素)，在溫度為37。C、C02體積分數(shù)為5%的條件下孵育3小時，加入LDH補充液及裂解液(LDH檢測試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，繼續(xù)將育1小時，1000r/min離心IO分鐘，取上清液50fi1,加入LDH反應(yīng)液及顯色液，室溫避光孵育30分鐘，加入LDH終止液，用酶標(biāo)儀才全測吸光度A值，按照下述/>式計算特異性殺傷率特異性殺傷率(％)=(樣品孔A值-自然釋;^文孔A值)/(最大釋放孔A值-自然釋放孔A值)x100。結(jié)果Tl和T2對黑色素瘤細胞的體內(nèi)殺傷能力檢測結(jié)果見圖10和表5，由圖表可知，與天然表位肽相比，Tl和T2對黑色素瘤細胞的體內(nèi)殺傷能力更強。表5候選TRAG-3模擬表位肽對黑色素瘤細胞的體內(nèi)殺傷能力效耙比特異性殺傷率(％)TRAG-358-66TlT2陰性參照肽20:l20.1228.6430.123.2440:l31.2539.6647.365.5480:145.3050.5468.575.981基于上述實驗結(jié)果，可得出如下結(jié)論與TRAG-3天然表位肽相比，TRAG-3模擬表位肽Tl和T2具有更好的抗酶降解穩(wěn)定性，與HLA-A2.1具有更強的親和力，并且對TRAG-3陽性腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的CTL特異性殺傷效應(yīng)，可用于制備治療TRAG-3陽性腫瘤的多肽疫苗。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院<120>腫瘤抗原TRAG-3才莫擬表位肽及其應(yīng)用<160>1<210〉1<211〉9<212>PRT<213>智人(homosapiens)<400〉1lieLeuLeuArgAspAlaGlyLeuVal1權(quán)利要求1、腫瘤抗原TRAG-3模擬表位肽，其特征在于由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列組成，其中，第5位Asp為D-Asp或者第6位Ala為D-Ala。2、權(quán)利要求1所述的腫瘤抗原TRAG-3模擬表位肽在制備治療TRAG-3陽性腫瘤的多肽疫苗中的應(yīng)用。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的肺瘤抗原TRAG-3模擬表位肽的應(yīng)用，其特征在于所述TRAG-3陽性腫瘤包括非小細胞肺癌、軟骨肉瘤和黑色素瘤。全文摘要本發(fā)明公開了腫瘤抗原TRAG-3模擬表位肽及其應(yīng)用，該模擬表位肽由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列組成，其中，第5位Asp為D-Asp或者第6位Ala為D-Ala；與TRAG-3天然表位肽相比，本發(fā)明的模擬表位肽具有更好的抗酶降解穩(wěn)定性，與HLA-A2.1具有更強的親和力，并且對TRAG-3陽性腫瘤細胞表現(xiàn)出更強的CTL特異性殺傷效應(yīng)，可以用于制備治療TRAG-3陽性腫瘤的多肽疫苗，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域有著良好的開發(fā)應(yīng)用前景。文檔編號C07K7/06GK101619092SQ20091010455公開日2010年1月6日申請日期2009年8月6日優(yōu)先權(quán)日2009年8月6日發(fā)明者波朱,林治華,王槐亮,程曉明,陳正堂,龍海霞申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院