專利名稱：鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位snp標記篩選豬的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基于SNP標記篩選豬的方法，具體是利用鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)域中第475位的SNP標記與豬肉嫩度顯著相關的特性，作為豬的SNP標記進行輔助選種和選配。屬于家畜分子生物學技術領域。
背景技術：
SNP標記(單核苷酸多態(tài)性)是指在染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性，而其中一種等位基因在群體中的頻率不少于1％。SNP標記在基因組內可以劃分為2種形式第一是遍布于基因組的大量單堿基變異；第二是基因編碼區(qū)的功能性突變。后者由于分布在基因編碼區(qū)(codingregion)，故又稱其為cSNP(coding SNP)。cSNP常引起表達蛋白的多態(tài)性變異，從而影響它們的功能特性。在家畜分子生物學技術領域，SNP標記主要作為一種標記輔助技術應用于家畜的篩選，從而指導家畜的選種和選配。
豬的SNP標記起步于90年代中期并且進展十分迅速，與此同時有關豬SNP標記的專利爭奪正逐步展開。鑒于豬SNP標記數目多，還有大量未被發(fā)現，且它們有重要的理論和應用價值，特別是我國大量的優(yōu)良地方豬種還可能存在特有的SNP標記，因此在我國開展豬的SNP標記的分析、鑒定和應用研究，開發(fā)具有我國知識產權的SNP標記顯得十分迫切和必要。
隨著生活水平提高，人們對食物有了更高的要求。豬肉作為人膳食中重要的組成部分，是人們近年來改善的重點。既瘦又嫩，多汁味美的豬肉在市場上頗受消費者青睞。另一方面，隨著養(yǎng)豬業(yè)對提高肉豬生長速率和飼料效率的遺傳選育，使得肉豬生產水平得到了提高，但同時，豬肉品質變得粗老，適口性差，降低了消費者對肉質的滿意度。豬肉品質成了當今世界養(yǎng)豬界專家共同關心研究的一項重大課題。其中豬肉嫩度是消費者對豬肉肉質進行評價的重要指標，豬肉嫩度受大量的遺傳和非遺傳因素的影響，肉質專家們針對這些影響因子做了大量的研究，許多研究都揭示了遺傳因子的重要性，這使得育種公司意識到利用基因技術來進行動物的遺傳育種在改良豬肉的嫩度上發(fā)揮著重要作用。
鈣蛋白酶抑制蛋白基因是影響豬肉嫩度的一個重要的候選基因，許多科研工作者都試圖在鈣蛋白酶抑制蛋白基因中尋找影響豬肉嫩度的SNP標記位點。經文獻檢索和專利檢索發(fā)現，Ernst(1998)等將鈣蛋白酶抑制蛋白基因定位于2q2.1-2.4，并發(fā)現了3個在非編碼區(qū)上的PCR-RFLP多態(tài)性位點(HinfI，MspI，RsaI)。孫立彬(2005)等也發(fā)現了2個在非編碼區(qū)上的PCR-RFLP多態(tài)性位點(HinfI，TaqI)。但由于非編碼區(qū)的變異不影響蛋白質的改變，很難證實非編碼區(qū)上的基因突變與豬肉嫩度的相關性。Rothschild(2003)等在鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)上發(fā)現了兩個與肉質相關的SNP，并申請了美國國家專利(SerialNo.339279)。但Rothschild是以西方豬種為研究對象，而東西方豬品系有很大的遺傳差異，西方豬種的多態(tài)位點是否能指導中國豬種的改良還需要驗證。
為了提高豬肉品質和指導中國地方豬的保種和降低生產成本，本領域迫切需要在編碼區(qū)找到更多新的影響豬肉(特別是中國地方品系)嫩度的SNP位點，并開發(fā)基于豬肉嫩度進行豬只篩選的SNP標記方法和試劑盒。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，利用鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)域中第475位的SNP與豬肉嫩度顯著相關的特性，提供一種利用SNP標記篩選豬的方法，進而提供一種新的篩選豬的試劑盒，為豬的標記輔助選種和選配提供新的分子標記，可進行豬只早期篩選。
本發(fā)明提供的鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP標記篩選豬的方法包括如下步驟(a)提取豬的耳組織總RNA樣品，進行反轉錄反應，用鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物進行PCR反應，得到擴增產物；(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性475位T→G；
其中，核苷酸位置編號基于GenBank索引號M20160。
所述的基因特異性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCATCTTCAC-3’的序列。
所述的擴增產物的長度為100～4000bp，且含有M20160中第475位。
進而，本發(fā)明提供了一種基于鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP標記篩選豬的試劑盒，它包括進行PCR反應的鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物，所述的特異性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCAT CTTCAC-3’的序列；引物擴增長度為100～4000bp，且含有M20160中第475位的擴增產物。
所述試劑盒還可以含有選自下組的試劑(a)與M20160中第475位的突變結合的探針；(b)識別M20160中第475位的突變限制性內切酶。
所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性475位T→G；其中，核苷酸位置編號基于M20160。
本發(fā)明的積極效果(1)在鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)475位分析鑒定出一個突變位點，經國際基因數據庫中檢索，證明為新的SNP標記。
(2)經將上述的SNP標記與梅山豬等五個群體的110頭豬的豬肉嫩度進行相關性分析，首次證明該標記與豬肉嫩度顯著相關，可以用于豬只的早期篩選，從而降低飼養(yǎng)成本，增加產品的附加值。
(3)所發(fā)明的試劑盒可用于早期檢測以提高檢測效率，降低檢測成本。
具體實施例方式
本發(fā)明針對中國地方豬種梅山豬和蘇太豬進行了深入的研究，并和西方豬的品系進行了對比研究。對鈣蛋白酶抑制蛋白基因整個編碼區(qū)域進行了測序，在編碼區(qū)發(fā)現多個新的SNP位點，其中統(tǒng)計分析結果顯示，在鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)第475位的SNP與豬肉嫩度顯著相關(p＜0.05)，因此可作為檢測豬肉嫩度的特異性SNP，用于豬的標記輔助選種和選配。在此基礎上完成了本發(fā)明。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例11.1研究對象由于豬肉嫩度是多基因參與的受多種環(huán)境因素影響的數量性狀，為了降低環(huán)境的影響，所有實驗豬都在相同的飼養(yǎng)水平下飼養(yǎng)，并在同一天進行屠宰，參照陳潤生(2002)等的方法測定每一個樣品的肌肉嫩度。
實驗用110頭豬實驗豬均在蘇州市蘇太集團飼養(yǎng)，28頭梅山；27頭蘇太豬、15頭長白×蘇太豬雜種、15頭大白×蘇太豬、25頭杜×長×大雜種豬。通過直接測序的方法進行SNP的檢測。
1.2實驗方法和結果1.2.1RNA提取在豬場采取豬耳組織樣，迅速放入液氮中，冷凍后保存于實驗室-80℃冰箱中，準備提取組織總RNA。取100mg耳組織樣放入1ml Trizol(trizal reagent，invitrogen BRL，USA)的勻漿器管中勻漿。4℃ 12000g離心10分鐘。吸取上清液，15-30℃溫育5分鐘。加0.2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30℃溫育2-3分鐘。4℃ 12000g離心15分鐘。吸取上清液，加0.8ml異丙醇，混合均勻。15-30℃溫育10分鐘，4℃ 12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加1ml 75％乙醇洗滌RNA，4℃ 7500g離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA溶于水(RNase free)中分裝，-70℃保存。
1.2.2PCR及測序引物的設計根據GenBank中豬鈣蛋白酶抑制蛋白基因的編碼序列M20160，(可參見網址http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。用引物設計軟件primer5.0設計引物。具體引物如下表1所示。
表1 引物序列表

1.2.3鈣蛋白酶抑制蛋白基因的RT-PCR(反轉錄PCR)擴增反轉錄反應液組成10μL 2×Bca 1st Buffer，4μL 25Mm MgSO2，1μL dNTPMixtμre，0.5μL Rnase Inhibitor(40U/μL)，1μL BcaBEST Polymerase(22U/μL)，1μL Oligo dT Primer，1μL RNA Sample，1.5μL Rnase Free dH2O，總體系為20μL。反轉錄反應條件65℃1分鐘，30℃5分鐘(15分鐘-30分鐘內勻速升溫)，65℃25分鐘，98℃5分鐘，5℃5分鐘。PCR擴增條件97℃變性5分鐘；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分鐘，如此進行30次循環(huán)；72℃延伸10分鐘，RT-PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。結果，獲得844bp的擴增產物。
1.2.4SNP標記的檢測RT-PCR產物經Resin樹脂純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測序儀(美國應用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI)進行熒光標記術端終止雙向測序，用Polyphred.html)進行序列的判讀和SNP確認。
1.2.5SNP基因分型和關聯分析用直接單向測序法進行SNP基因分型，將在編碼區(qū)上發(fā)現了多個SNP采用以下模型對基因型效應和遺傳模式進行分析y＝1μ+X1S+X2B+X3M+e模型中，y為個體表型記錄向量，μ為總體均數，S為性別效應向量；B為群體效應向量；M為基因型效應向量；e為隨機誤差向量；1、X1、X2、X3為設計矩陣；統(tǒng)計分析采用SAS(8.02)軟件進行，其中多重比較采用SSR法。
結果，其中大部分SNP與豬肉嫩度并不相關。發(fā)現存在以下SNP475位T→G，該SNP位于鈣蛋白酶抑制蛋白基因的編碼區(qū)，導致編碼氨基酸發(fā)生變化，由Arg→Leu。關聯研究表明該位點是與豬肉嫩度關聯性非常高的SNP，對豬肉嫩度影響顯著，多重比較發(fā)現，含有T型SNP的豬肉嫩度比含有G型SNP的豬肉嫩度高20.15％，證實了M20160中475位的T/G型SNP與豬肉嫩度存在著相關性。
實施例2基于鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP標記篩選豬的試劑盒，如實例1所述，M20160中的475位T→G的突變與豬肉嫩度密切相關。因此，可基于這個SNP位點設計鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物進行擴增和檢測。
制備一試劑盒(100次)，組成如下表所示

在豬場采取豬耳組織樣，提取總RNA，按實施例1所述方法進行反轉錄反應。將試劑盒中的PCR引物稀釋到1pmol/μL，以所提取的反轉錄產物為模板用上述試劑盒進行PCR反應。PCR擴增條件97℃變性5分鐘；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分鐘，如此進行30次循環(huán)；72℃延伸10分鐘。PCR產物純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測序儀進行熒光標記末端終止法雙向測序，用Polyphred軟件進行序列的判讀和SNP確認。
根據本發(fā)明提供的標記方法，如果用與M20160中第475位的突變結合的探針或識別M20160中第475位的突變的限制性內切酶也可以檢測出475位T→G。
檢測結果，含有T型SNP的豬肉嫩度比含有G型SNP的豬肉嫩度高20.15％。
權利要求
1.一種鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP標記篩選豬的方法，其特征在于包括如下步驟(a)提取豬的耳組織總RNA樣品，進行反轉錄反應，再用鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物進行PCR反應，得到擴增產物；(b)檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性475位T→G；其中，核苷酸位置編號基于GenBank索引號M20160；所述的基因特異性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCATCTTCAC-3’的序列；所述的擴增產物的長度為100～4000bp，且含有M20160中第475位。
2.一種鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP標記篩選豬的方法試劑盒，其特征在于包括進行PCR反應的鈣蛋白酶抑制蛋白基因特異性引物，所述的特異性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCATCTTCAC-3’的序列；引物擴增長度為100～4000bp，且含有M20160中第475位的擴增產物。
3.根據權利要求2的試劑盒，其特征在于還含有選自下組的試劑(a)與M20160中第475位的突變結合的探針；(b)識別M20160中第475位的突變限制性內切酶；所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性475位T→G；其中，核苷酸位置編號基于M20160。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鈣蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP標記篩選豬的方法，屬于家畜分子生物學技術領域。其步驟包括，提取豬的基因組RNA，鈣蛋白酶抑制蛋白基因的反轉錄PCR擴增，SNP標記的檢測及其與豬肉嫩度的相關性分析。本發(fā)明的特征是分離鑒定出豬鈣蛋白酶抑制蛋白基因新的SNP標記，篩選出一個適用于豬肉嫩度的SNP標記(475位T→G)，設計了擴增該位點的引物，還提供了用于該方法的試劑盒。本發(fā)明利用鈣蛋白酶抑制蛋白基因編碼區(qū)域中第475位的SNP與豬肉嫩度顯著相關的特性，為豬的標記輔助選種和選配提供了新的分子標記方法。
文檔編號C12Q1/68GK1824807SQ200510111808
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月22日 優(yōu)先權日2005年12月22日
發(fā)明者潘玉春, 王起山, 孫立彬, 孟和, 于丹丹 申請人:上海交通大學